הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54849

⸱

1 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

תקציר

נכון לעכשיו, ניתן לבנות צורות רקומביננטיות של נגיפים שונים, כגון נגיף הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) ונגיף הפטיטיס C (HCV), הנושאים גנים זרים כגון מדווח או חלבון סמן בגנום שלהם. נגיפים רקומביננטיים אלה בדרך כלל מחקים נאמנה את מחזור החיים של הנגיף המקורי בתאים נגועים ומציגים את אותה תלות בטווח המארח. פיתוח נגיף רקומביננטי מאפשר סינון יעיל של מעכבים וזיהוי גורמי מארח ספציפיים. עם זאת, עד כה הבנייה של נגיף הפטיטיס B רקומביננטי (HBV) הייתה קשה בגלל מגבלות ניסיוניות שונות. המגבלה העיקרית היא גודל הגנום הקומפקטי של HBV, וגודל גנום קפדני למדי שאינו עולה על 1.3 גדלי גנום, שיש לארוז בוויריונים. לפיכך, גודלו של גן זר שיוכנס צריך להיות קטן מ-0.4 קילו-בייט אם אין לבצע מחיקה של ה-DNA של הגנום. לכן, כדי להתגבר על מגבלת גודל זו, נדרשת מחיקה של חלק מה-DNA של HBV. כאן, אנו מדווחים על בניית גן מדווח רקומביננטי המקודד HBV כדי לנטר את השלב המוקדם של מחזור השכפול של HBV על ידי החלפת חלק מאזור קידוד הליבה של HBV בגן המדווח על ידי מחיקת חלק מאזור קידוד HBV pol. זיהוי זיהום HBV רקומביננטי, המנוטר על ידי פעילות המדווח, היה רגיש מאוד וזול יותר מגילוי בשיטות הקונבנציונליות הקיימות כיום להערכת זיהום HBV. מערכת זו תהיה שימושית למספר יישומים, כולל סריקה בתפוקה גבוהה לזיהוי מעכבים נגד HBV, גורמים מארחים ותאים רגישים לנגיף.

מבוא

זיהום כרוני בנגיף הפטיטיס B (HBV) מהווה גורם סיכון עיקרי למחלות כבדות כרונית 1. למרות אסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על אנלוגים נוקלאוטיד המעכבות פונקצית pol HBV ו / או הממשל של אינטרפרון מסוג I שמפעיל מערכת חיסונית אצל אנשים נגועים וכן בעקיפין התפשטות HBV דיכוי באמצעות פונקציות גן מגורה אינטרפרון 2, טיפולים אלה לא יכולים לחסל HBV DNA לחלוטין 3. יתר על כן, הופעתה של HBVs כי הם עמידים בפני סוכני-Pol אנטי היא דאגה 4. הממשל של תרופות אנטי-ויראליות בשילוב ישירות מיקוד השלבים השונים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) או הפטיטיס C וירוס מחזור החיים (HCV) הוצגה לדכא בהצלחה או למגר את הנגיף (es). דומה לרעיון זה, פיתוח חומר נוגד-HBV (ים) אשר פועל ישירות על השלבים השונים של Hמחזור החיים BV חשוב לביסוס טיפולים HBV בעתיד.

באופן כללי, הקמת פשוט במערכת התרבות חוץ גופית של הנגיף היעד מקל על הפיתוח של תרופות אנטי-וירוס. עם זאת, ישנם לפחות שני מחסומים לפיתוח מערכות תרבות במבחנה להקרין תרופות אנטי-HBV. הראשון הוא העדר מערכת תרבית תאים נוח במבחנה עבור זיהום HBV / התפשטות. שלא כמו וירוסים אחרים, כגון HIV HCV, אשר מופצים בשורות תאים הוקמו, קשה לטפח HBV במבחנה בשל מגבלות ניסוי כוללים מגוון מארח צר. השימוש במערכות תרבית תאים ספציפיות כגון שורת תאי hepatoma אדם HepaRG, שהוא רגיש לזיהום HBV, 5, 6, 7 פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. יתר על כן, תאי PXB, מבודדים מן-טאי האוריקינאזמהונדס activator plasminogen PE / עכברים SCID מחוסן עם hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH), הוצגו להיות רגישים לזיהום HBV ושכפול 8. עם זאת, רמות שכפולות HBV ב HepaRG תלויות מדינת ההתמיינות אחרי התרבות, אשר יכול לגרום לתוצאות עקביות irreproducible של רמות HBV זיהום / שכפול. PXB משמש בדרך כלל ניסויי זיהום HBV אך מוגבל בגלל זמינותו. שורת תאי ביטוי HBV מושרה טטרציקלין, HepAD38, גם נעשתה שימוש נרחב ללמוד שכפול HBV, אבל מערכת זו מאפשרת רק הערכה לאחר שעתוק ולא צעד כניסת HBV זיהום 9. לאחרונה, זיהוי של פוליפפטיד cotransporting נתרן taurocholate (NTCP) כמו קולטן פונקציונלי עבור HBV אפשרה פיתוח של מערכת התרבות משתנה HBV 10. אכן, ביטוי NTCP בתאי hepatocarcinoma שאינם רגישים כגון Huh7 וHepG2 מאפשרת זיהום HBV 10 וכך, הבחירה של שורות תאים רגישים HBV הורחבה, לפתרון רב מהמגבלות ניסיון. הבעיה השנייה היא חוסר מערכת assay פשוט להעריך זיהום HBV ושכפול. הערכת זיהום HBV מתבצעת לרוב על ידי ניתוח HBV DNA, RNA וחלבונים. עם זאת, כימות של סמנים אלה של הווירוס הוא גוזל זמן, לעתים קרובות יקר ולא תמיד פשוט. לכן, הפיתוח של מערכת assay פשוטה, כגון שימוש גן כתב, אולי להתגבר על בעיות הקשורות במערכות assay HBV.

עם זאת, מכיוון שהגודל הגנום כי ניתן לארוז לתוך קפסיד HBV מוגבל - פחות מ -3.7 kb 11 - בגודל של גן כתב צריך להיות קצר ככל האפשר. יתר על כן, נוכחותם של אלמנטי ציס מרובים הפזורים לאורך הגנום, שחיוניים שכפול נגיפי, מגבילה את המשרות פנויות ב sertion של גן הכתב לתוך הגנום. כמה דיווחים ניסו להכניס גנים זרים, כולל HIV-1 טאט, חלבון פלואורסצנטי ירוק, DsRed, לתוך הגנום HBV 11, 12, 13. עם זאת, HBVs רקומביננטי אלה אינם יעילים לסינון HBV זיהום / שכפול, או להקרנת התפוקה הגבוהה של גורמים המשפיעים HBV זיהום / שכפול. זאת בעיקר בגלל הפריון הנמוך של וירוסים רקומביננטי והעוצמת המופחתים של ביטוי גני כתב הנגרם על ידי ייצור וירוס יעיל.

כדי להתגבר על בעיות אלה, בנינו HBV כתב עם תשואה גבוהה של ייצור וירוס. וירוס זה רגיש מאוד לניטור בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול HBV, מן הכניסה שעתוק. כדי להשיג זאת, NanoLuc (NL) נבחר גן סמן בגלל זה הוא (חומצות אמינו 171) קטנות מהונדסות כתב זורחclass = "Xref"> 14. יתר על כן, NL הוא כ 150-לקפל בהירים יותר גחלילית או בלוציפראז Renilla, והתגובה הזורחת היא ATP-עצמאית, דבר המצביעה על כך אחוזי הצלחת השווא יהיו נמוכים להקרנת תפוקה גבוהה. יעילות הייצור של HBV רקומביננטי הוא כ 1/5 של ההורה HBV, ובדומה לרמות דיווחו לאיתור וירוסים הקודם רקומביננטי HBV; עם זאת, את הבהירות של NL מתגברת בעיות פריון וירוס, כך שהוא יכול לשמש להקרנה ההמונית של תרופות אנטי-HBV.

הקרנת חומרים אנטי-HBV באמצעות hepatocytes העיקרי, HepaRG, HepAD38 ו hepatocytes-transduced NTCP יכול להיות שימושי לצורך ההקרנה של תרופות אנטי-HBV ידי השיטה המקובלת (ים). עם זאת, המערכת המתוארת כאן יש יתרונות שונים כגון טיפול פשוט, רגישות גבוהה, ועלות נמוכה להקרנה. יתרונות אלה מתאימים מבחני תפוקה גבוהים לפתח אילו חומרי HBV חדשים למטרות טיפוליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפקה 1. של HBV רקומביננטי המקודד את החלבון Reporter

  1. הכנת התאים HepG2
    1. כן בינוני תרבית תאים (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS), 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 100 U / ml חומצות אמינו חיוניות).
    2. פלייט 4 x 10 6 תאים HepG2 בצלחת 10 ס"מ מצופה קולגן 10 מ"ל של מדיום תרבות יום לפני transfection. דגירת תאי HepG2 ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור humidified 5%.
      הערה: כאשר כ 4 x 10 6 תאים HepG2 הם מצופה בצלחת 10 ס"מ מצופה קולגן 10 מ"ל של מדיום תרבות, הם יהיו ומחוברות% 70-90 למחרת.
  2. transfection
    1. Transfect HepG2 תאים עם 5 מיקרוגרם של דלתא pUC1.2HBV אפסילון 15 ו -5 מיקרוגרם של pUC1.2HBV / NL 15 באמצעות transfectionמגיב בהתאם להוראות היצרן.
    2. למחרת, להסיר את המדיום התרבות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום תרבות טריים.
    3. שבוע לאחר transfection, להעביר את המדיום תרבות המכיל את HBV רקומביננטי לצינור מ"ל-50 לבין המשך לשלב 1.3.1. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבות טרי לצלחת המכיל את התאים transfected.
      הערה: הפקה של HBV רקומביננטי נשמרת למשך 4 שבועות. מדיום התרבות המכיל HBV רקומביננטי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 חודש.
  3. טיהור של HBV רקומביננטי
    1. סור פסול תא ממדיום התרבות המכיל HBV רקומביננטי על ידי צנטריפוגה (2,300 XG במשך 5 דקות).
    2. להעביר את supernatant דרך פילטר קרום 0.45 מיקרומטר.
    3. הוסף נפח שווה של 26% PEG / 1.5 M NaCl (פוליאתילן גליקול 6000: 130 גרם, NaCl, 49 גרם, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0 ו -5 מ"ל של 1 M HEPES pH 7.6 ב 500 מ"ל) עד ​​בינוני התרבות רקומביננטי המכילHBV ומערבבים בעדינות. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. צנטריפוגה ב 2,300 XG במשך 20 דקות ב 4 °.
    5. בטל supernatant ו לפזר את גלולה ב 0.5 מ"ל של TNE (10 מ"מ טריס, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. הסר את הפסולת על ידי צנטריפוגה ב 2300 XG במשך 5 דקות.
    7. טען 0.5 מ"ל של TNE המכיל HBV רקומביננטי על סוכרוז 0.8 מ"ל של 20% ב TNE.
    8. צנטריפוגה ב 100,000 g × 3 שעות ב 15 מעלות צלזיוס.
    9. מחק כמה שיותר supernatant ככל האפשר, ולשמור גלולה. Resuspend זה ב 1 מ"ל של DMEM חופשית בסרום לכל 40 מ"ל של החל בינוני תרבות.
    10. דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    11. סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. הכן 0.5 מ"ל aliquots ולאחסן ב -80 ° C.
      הערה: אם זיהום חלבון הכתב של מדגם וירוס המקורי הוא ציין, לטהר את הנגיף על ידי צנטריפוגה אולטרה-שיפוע צפיפות של סוכרוז 5-30% TNE ב 100,000 XG במשך 2 שעות, או צנטריפוגה equilibrated צפיפות CsCl הלוך ושובמ 1.1-1.6 גרם / מ"ל ​​ב 150,000 XG במשך 50 שעות.

2. זיהום של HBV רקומביננטי

  1. HepG2 תרבות תאים המבטאים NTCP ביציבות (HepG2 / NTCP) 15 כי הם רגישים לזיהום HBV DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 250 מיקרוגרם / מ"ל G-418 ו- 100 U / ml חומצות אמינו חיוניות על 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2 humidified.
  2. יום אחד לפני ההדבקה, צלחת כ 5 x 10 4 HepG2 / תאים NTCP 14 לתוך צלחת מצופה 96-גם הקולגן 0.1 מ"ל של מדיום תרבות.
  3. HBV רקומביננטי הפשרה באמבט מי 37 ° C עד שיש קצת קטן של קרח שנותר הבקבוקון.
  4. הכן את המדיום עבור זיהום על ידי שילוב של הבאים: 10 μl של 40% PEG8000 ב בופר פוספט 1x (PBS), 2 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO), 10 μl של HBV רקומביננטי ו -78 μl של המדיום תרבות טרילכל גם צלחת 96-היטב.
  5. הוספת 100 μl של פתרון HBV רקומביננטי כדי היטב אחד של הצלחת 96-היטב.
  6. יום אחד לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם 300 μl PBS לכל היטב כדי להסיר את חלבון הכתב המזהם מן שבר הווירוס.
  7. דגירת תאים נגועים 200 μl של מדיום התרבות המכיל DMSO 2% למשך שבוע או פחות.

.3 ניתוח

  1. שבוע לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם PBS.
  2. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה אל התאים הנגועים.
  3. רוק הצלחה התרבות במשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות XG ב 2000 למשך 5 דקות.
  4. הוסף 50 μl של המצע כתב לתוך צלחת luminometer.
  5. הוסף 20 μl של lysate התא לצלחת luminometer המכיל את המצע הכתב. מערבבים על ידי vortexing בקצרה.
  6. מניחים את הצלחת luminometer וליזום קריאה 15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג סכמה של הגנום HBV, RNAs עבד, חלבוני וירוס ובאזור הקידוד שלהם על הגנום. גן הכתב ומיקומו בגנום מסומן גם. איור 2 מציג את פלסמיד כתב HBV ו עוזרים פלסמיד המכיל את הגן המדווח. כתב pUC1.2HBV / NL נבנה על ידי מחיקת עמדות נוקלאוטיד 223-811 מאתר ייזום שעתוק של mRNA preCore של pUC1.2HBV 16 ולאחר מכן החדרת גן הכתב. PUC1.2HBVdelta עם מוטציות נקודתיות ברצף encapsidation האות נוצר על ידי PCR mu...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הגנום HBV יש ארבע מסגרות קריאה פתוחות עיקריות (ORFs) כולל הליבה, פולימראז, המשטח ו- X ORFs (איור 1). תמלול של ארבעה HBV ORFs מוסדר בחוזקה על ידי ארבעה יזמים: אמרגן precore / ליבה המכילים שפר שני, אמרגן S1, אמרגן האמרגן ו- X S2 המכיל משפר לי 18. תעתיקי 3.5 קילו ו 3.4 kb מתורגמים לחלבונים PreCore ו- Core, בהתאמה. החלבון לעטוף גדול (L) מופק mRNA subgenomic הגדול (2.5 kb), ואת באמצע (M) וחלבונים משטח קטן (S) מתורגמים פרוטוקול מן קצר יותר (2.1 k...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תוכנית המחקר על הפטיטיס של הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) ועל ידי מענקים למחקר מדעי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT) של יפן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Nano-Glo Luciferase Assay RegentPromegaN1110
פניצילין-סטרפטומיצין תמיסה מעורבתנקלאיטסק 09367-34 
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניתרמו פישר 31985070
100 מ"מ/צלחת מצופה קולגןIwaki4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo פישר סיינטיפיקL3000001 
פוליאתילן גליקול (PEG) 6000 סיגמא-אולדריץ'81255
פוליאתילן גליקול (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0.5 מול/ליטר EDTA SolutionNacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0.45 μ m, polyethethersulfone, פילטרMerck MilliporeSLHP033RS
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2650
קולגן מצופה 96 בארותצלחת קורנינגNO3585
ליזה פסיבית 5x מאגרPromegaE1941
GloMax 96 מיקרופלייט לומינומטרPromegaE6501
סוכרוזNacalai tesque30403-55
צלחת לומינומטרגריינר ביו-אחד655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--התייחסות 15
pUC1.2HBV דלתא אפסילון--התייחסות 15
pUC1.2HBV/NL--התייחסות 15
שפופרת 50 מ"לViolamo1-3500-02
Anti-Myc נוגדןSigma-AldrichC3956
HBIGיפן ארגון מוצרי דם-IFN
-βMochida פרמצבטיקה14987224005413
הפריןסיגמא-אולדריץ'H3393

מקורות

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306(2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בניית HBV רקומביננטיניטור מחזור השכפול של HBVסריקה של חומרים אנטי-HBVהדבקת תאי HepG2 NTCPשיטת שקיעת PEGסרימרקציה במדרג סוכרוזזיהוי גן מדוררזיהוי מעכבי HBVניתוח גורמי מאכסן
פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.