Method Article

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי Clostridium difficile R20291 הזנים

DOI:

10.3791/54850

⸱

December 10th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את מודל עכבר cefoperazone של זיהום difficile Clostridium (CDI) באמצעות זן קליני רלוונטי וגנטי-צייתן, R20291. דגש על ניטור מחלה קליני, פקידת חיידקי C. difficile, cytotoxicity רעלן, ושינויי histopathological ברחבי CDI במודל של עכברים מפורטים בפרוטוקול.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קלוסטרידיום דיפיצילה הוא פתוגן אנאירובי, גרם חיובי, יוצר נבגים הקשור לעלייה בתחלואה ותמותה וכתוצאה מכך מהווה איום דחוף על בריאות הציבור. הישנות של זיהום קלוסטרידיום דיפיצילה (CDI) לאחר טיפול מוצלח באנטיביוטיקה היא גבוהה, מתרחשת ב-20-30% מהחולים, ולכן מחייבת גילוי טיפולים חדשים נגד פתוגן זה. מודלים עכשוויים של CDI בבעלי חיים מביאים לשיעורי תמותה גבוהים ולכן אינם מתקרבים לביטויי המחלה הכרוניים והערמומיים הנראים בבני אדם עם CDI. כדי להעריך טיפולים נגד קלוסטרידיום דיפיצילה, יש צורך במודל עכברי המעריך מחלה אנושית תוך שימוש בזן רלוונטי מבחינה קלינית. פרוטוקול זה מתאר את מודל העכבר cefoperazone של CDI באמצעות זן רלוונטי קלינית וניתן למעקב גנטי, R20291. טכניקות לניטור מחלות קליניות, ספירת חיידקים של קלוסטרידיום דיפיצילה, ציטוטוקסיות רעלן ושינויים היסטופתולוגיים ברחבי CDI במודל עכבר מפורטות בפרוטוקול. בהשוואה למודלים אחרים של CDI בעכברים, מודל זה אינו קטלני באופן אחיד במינון הניתן, מה שמאפשר תצפית על מהלך קליני ממושך של זיהום התואם את המחלה האנושית. לכן, מודל עכבר cefoperazone זה של CDI מוכיח פלטפורמה ניסויית רבת ערך להערכת ההשפעות של טיפולים חדשים על שיפור המחלה הקלינית ועל שיקום עמידות הקולוניזציה נגד C. difficile.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile הינו אנאירובי, חיובי-גרם, חיידק יוצרי נבגים שגורמת מסכני חיים שלשולים 1. C. difficile זיהום (CDI) קשור לתחלואה אנושית מוגדלת ותמותה ותוצאות בלמעלה מ -4.8 מיליארדים $ בעלויות בריאות בשנה 1-4. בשנת 2013, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן מסווג difficile ג כסיכון עמידות לאנטיביוטיקה דחוף, המציין כי זה מהווה איום דחוף בריאות הציבור 1. נכון לעכשיו, טיפול אנטיביוטי עם vancomycin ו metronidazole נחשבים רמת הטיפול CDI 5. למרבה הצער, ישנות CDI לאחר טיפול מוצלח באנטיביוטיקה הן גבוהות, המתרחשות 20 - 30% מהחולים 2,5-7. לכן, הגילוי רפוי רומן נגד ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרה אתית:
הטיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת השימוש (IACUC) במכללת צפון קרוליינה סטייט לרפואת וטרינרית (NCSU) אשרה את המחקר הזה. טיפול בבעלי חיים NCSU ושימוש מדיניות חל תקנים והנחיות שנקבעו הרחבה מחקר חוק צער בעלי-חיים ובריאות משנת 1985. מתקנים בעלי חיים במעבדות בעמותת NCSU פועלים על פי ההנחיות שנקבעו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. סטטוסי בריאות החיה הוערכו יומי, ובעלי חיים גוססים היו מורדמים אנושיים בחנק CO 2 ואחריו אמצעים משניים. טכנאי חיה מאומנים או וטרינר בצעו בעלי חיים במתקן AAALAC-מוכר במסגרת מחקר זה.

מנהל 1. של Cefoperazone האנטיביו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך מחקר נציג, 5 שבועות בן C57BL / 6 עכברים WT טופלו קודם cefoperazone במי השתייה שלהם (0.5 מ"ג / מ"ל) במשך 5 ימים, מותר 2-יום לשטוף עם מי שתייה רגילים. עכברים היו תיגר עם 10 5 נבגים של C. difficile R20291 gavage דרך הפה ביום 0 (איור 1 א). עכברים נוטרו לירידה במשקל וסימנים קליניים (עייפות, inappetence, שלשול, יציבה כפופה) של CDI למשך 14 יום. האתגר של עכברים C57BL / 6 WT עם נבגים C. difficile R20291 הב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפיין את המהלך הקליני, כולל ירידה במשקל, קולוניזציה של חיידקים, ציטוטוקסיות רעלנים ושינויים היסטופתולוגיים במערכת העיכול, של עכברים שטופלו באנטיביוטיקה מאותגרים עם נבגי C. difficile R20291. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שבהם תשומת לב לפרטים חיונית. חישוב מדויק של חיסון נבגי קלוסטרידיום דיפיצילה הוא קריטי. חישוב זה מבוסס על ספירת מלאי הנבגים המקורית של C. difficile , שאמורה להיות עקבית על פני ספירת נבגים מרובים לפני תחילת פרוטוקול זה. אם חישוב החיסון שגוי, הוא יגרום למינון חיסון.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף בשלב זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לטרוור לולי ממכון וולקאם טראסט סנגר על נבגי C. difficile R20291 ולג'יימס ס. גאי מהמכללה לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת צפון קרוליינה עבור תאי Vero, שניהם משמשים בכתב היד הזה. היסטופתולוגיה של בעלי חיים בוצעה במתקן הליבה להיסטופתולוגיה של בעלי חיים LCCC באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, בסיוע מיוחד של טרייסי ריילי ואמנדה בראון. הליבה להיסטופתולוגיה של בעלי חיים של LCCC נתמכת בחלקה על ידי מענק תמיכה בליבת מרכז NCI (2P30CA016086-40) למרכז הסרטן המקיף של UNC Lineberger. ברצוננו להודות גם לווינסנט יאנג, אנה סיקץ, ג'האנסי לסלי וקאסי שומאכר על דיונים מועילים על פרוטוקול בדיקת ציטוטוקסיות של תאי Vero. JAW ממומן על ידי מענק הכשרה למחקר ע"ש רות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#62 מנקה חיטוי ספורדיציאלי Perisept SSS Navigator48027מוצר זה ידרוש דילול לפי המלצת היצרן
0.22 μ m filterFisherbrand09-720-3אלטרנטיבה לצלחת סינון לדגימות אינדיבידואליות שנבדקו בבדיקת Vero Cell
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056צריך לחמם באמבט מים ב-37 מעלות; C לפני השימוש
0.4% טריפאן כחולגיבקו15250-061
1% פניצילין/סטרפטומיציןגיבקו15070-063
10% מומת בחום FBSGibco16140-071צריך לחמם באמבט מים ב-37 מעלות; C לפני השימוש
במזרק פלסטיק 1 מ"ל BD ציוד רפואי309628
1x PBSGibco10010-023
2 מ"ל מיקרו צנטריפוגה בורג מכסהקורנינג430917
96 באר תרבית תאים צלחת תחתונה שטוחהCostar CorningCL3595
96 באר צלחת סינוןMilliporeMSGVS2210
דבק חותםThermoScientificAB-0558
Bacto AgarBecton Dickinson214010חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
Bacto Proteose PeptoneBecton Dickinson211684חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
CefoperazoneMP Bioworks199695
CefoxitineSigmaC47856חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
Clostridium difficile Antitoxin KitTech LabsT5000משמש כבקרה לבדיקת תאי Vero
Clostridium difficile Toxin AList Biological Labs152Cבקרה חיובית לבדיקת תאי Vero
D-cycloserineSigmaC6880חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
מים מזוקקיםGibco15230
DMEM 1x MediaGibco11965-092צריך לחמם באמבט מים ב-37 מעלות; C לפני השימוש
בפרוקטוזפישרL95500חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
המוציטומטרBright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
MgSO4 (נטול מים)SigmaM2643חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
Millex-GS 0.22 μ m מסנןMillex-GSSLGS033SSמסנן עבור לוחות TCCFA 
Na2HPO4SigmaS-0876חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
NaClFisherS640-3חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
מספר 10 להב אזמל חד פעמיMiltex, Inc4-410
צלחות PCRFisherbrand14230244
צלחת פטרי מפלסטיקKord-Valmark Brand2900
מפזר תאים סטרילי מפלסטיק בצורת Lפישרברנד14-665-230
מזרק צעדDymax CorporationT15469
TaurocholateSigmaT4009חלק מלוחות TCCFA (ראה להלן)
מים מזוקקים אולטרה-טהוריםInvitrogen10977-015
C57BL/6J עכבריםמעבדת ג'קסון664עכברים צריכים להיות בני 5 - 8 שבועות
מיקרוסקופ אור אולימפוס BX43FOlympus Life Science
DP27Olympus Life Science
cellSens Dimension תוכנה אולימפוס מדעי
מצלמת החיים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cefoperazone Mouse ModelClostridium difficile InfectionBacterial EnumerationToxin CytotoxicityHistopathologic ChangesFecal Sample CollectionSpore Inoculum PreparationAnaerobic Chamber UseClinical Disease MonitoringColony Forming Units

Related Articles