מאמר שיטה

3D כמוני סיליקו דוגמנות (q3DISM) של Phagocytosis עמילואיד-ביתא מוחין במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר

DOI:

10.3791/54868

⸱

26 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroinflammation מוכרת כיום כגורם אטיולוגי מרכזי למחלות ניווניות. פגוציטים mononuclear הם תאי מולד חיסוניים אחראים phagocytosis ופינוי פסול שאריות. תאים אלה כוללים מקרופאגים CNS-תושב המכונה microglia, ואת phagocytes mononuclear שחדר מהפריפריה. במיקרוסקופ אור כבר משמש בדרך כלל כדי לחזות phagocytosis ב מכרסמים או דגימות מוח אנושי. עם זאת, שיטות איכותיות לא ספקו ראיות מוחלטות של in vivo phagocytosis. כאן אנו מתארים 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM), שיטה חזקה המאפשרת לכמת 3D אמיתי של עמילואיד-β (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במחלת מכרסם אלצהיימר (AD) מודלים. השיטה כרוכה fluorescently חזותי Aβ כמוסה בתוך phagolysosomes בסעיפי מוח מכרסם. מערכי נתונים confocal z-ממדי גדולים אז 3D המשוחזר כדי לכמת את A &# 946; מרחבית colocalized בתוך phagolysosome. אנו מדגימים את היישום המוצלח של q3DISM כדי מוח עכבר וחולדה, אבל מתודולוגיה זו ניתן להרחיב כמעט כל אירוע phagocytic בכל רקמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת אלצהיימר (AD), דמנציה 1 הקשורה הגיל הנפוץ ביותר, מאופיין עמילואיד-β מוחין (Aβ) הצטברות כמו "סנילי" הפלאק β עמילואיד, neuroinflammation ברמה נמוכה כרונית, tauopathy, איבוד עצבי, והפרעה קוגניטיבית 2 . במוחות המטופל לספירה, neuroinflammation מיועד ידי תגובתי אסטרוציטים פגוציטים mononuclear (המכונה microglia, למרות המרכזי שלהם לעומת ממוצא הפריפריה עדיין לא ברור) שמסביב Aβ פיקדונות 3. כמו זקיפים החיסון המולדת של מערכת העצבים המרכזית, microglia ממוקמים מרכזי להצליל Aβ. עם זאת, גיוס microglial הפלאק Aβ מלווה מעט מאוד, אם בכלל, Aβ phagocytosis 4,5. אחת ההשערות היא כי microglia הם בתחילה נוירו ידי phagocytozing מכלולים קטנים של Aβ. עם זאת, בסופו של דבר תאים אלה הופכים הנוירו כמו נטל Aβ המכריע ו / או ד תפקודית כתוצאה מהזדקנותecline, מעורר microglia לתוך פנוטיפ מעודד דלקת מתפקדת, תורם לירידה ברעילות וקוגניטיביות 6.

הגנום כולו אחרונים מחקרים אגודים (GWAS) זיהו מקבץ של אללים לסיכון לחלות באלצהיימר השייכים מסלולי חיסון מולדים ליבת 7 לווסת phagocytosis 8-11. כתוצאה מכך, התגובה החיסונית בתצהיר עמילואיד מוחין הפך אזור מרכזי של עניין, הן מבחינת הבנת האטיולוגיה לספירה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות 12-14. עם זאת, יש צורך חיוני מתודולוגיה להערכת phagocytosis Aβ in vivo. כדי לתת מענה לצורך מסופקים זה, פיתחנו 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) כדי לאפשר quantitation 3D אמיתי של phagocytosis Aβ מוחין ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר דמוי.

מוגבל רק על ידי המידה שבה הם לשחזר מחלה, במודלים של בעלי החיים ישהוכח שלא יסולא בפז להבנה לספירה pathoetiology ולהערכה רפוי ניסיון. בשל העובדה כי מוטציות בגנים presenilin (PS) ו חלבון מקדים עמילואיד (APP) עצמאי לגרום לספירה אוטוזומלית דומיננטית, transgenes מוטציה אלה נעשה שימוש נרחב כדי ליצור מודלים מכרסם מהונדס. מהונדס APP / PS1 עכברים coexpressing זמנית "שוודית" APP האנושי מוטציה (swe APP) ו Δ אקסון 9 presenilin 1 אדם מוטציה (PS1ΔE9) הנוכחי עם עמילואידוזיס מוחין מואץ neuroinflammation 15,16. יתר על כן, יצרנו חולדות דו-מהונדס coinjected עם APP swe ובונה PS1ΔE9 (קו TgF344-AD, על רקע פישר 344). בניגוד למודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס מוחין, חולדות TgF344-AD לפתח עמילואיד מוחין שמקדים tauopathy, אובדן אפופטוטיים של נוירונים, ו ליקוי התנהגותי 17.

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור IMMunostaining microglia, phagolysosomes ופיקדונות Aβ בסעיפי מוח מעכברי APP / PS1 וחולדות TgF344-AD, ורכישת תמונות confocal z-ממדי גדולות. נפרטנו בדור סיליקון וניתוח של שחזורי 3D אמיתיים ממערכות נתוני confocal המאפשרים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes microglial. באופן כללי יותר, מתודולוגיה נפרט כאן ניתן להשתמש כדי לכמת כמעט כל צורה של phagocytosis in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כאן אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים מוסדיים דרום קליפורניה ועדת שימוש (IACUC) וביצע בהתאם קפדנית עם National Institutes of הנחיות בריאות והמלצות מהאגודה הערכה וההסמכה של מעבדה הבינלאומי טיפול בבעלי חיים.

בידוד מוח 1. מכרסמים והכנת Immunostaining

יום 1:

  1. מניחים חולדות TgF344-AD בגילאי (14 בן חודש) או APP / עכברים PS1 (12 בן חודש) בהרדמה isoflurane עמוק רציפה (4%). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה.
  2. חותך דרך משני צידי בית החזה ולהרים כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 23 G לתוך החדר השמאלי של הלב ולעשות חתך קטן לתוך העלייה הימנית. המשך exsanguination ידי זלוף transcardial עם פוספט שנאגרו מלוחים קר כקרח(PBS) באמצעות משאבת peristaltic (30 מ"ל לעכברים; 150 - 200 מ"ל לחולדות).
  3. ביצוע חתך קו האמצע הזנב לתוך העור ולהזיז את העור והשרירים בצד. חותך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו האמצע בין העיניים. הסר את צלחות עצם ולבודד את המוח כולו מהגולגולת.
  4. מניח את המוח לתוך מטריצת מוח מכרסם העטרה ופורס אותו לרבעים. דגירת רבעים אחוריים O / N (16 שעות) מקבע paraformaldehyde (PFA 4% PBS) ב 4 ° C.. 3x לשטוף PBS, ולאחר מכן להעביר עד 70% אתנול. זהירות: PFA הוא רעיל יש לטפל מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים.

יום 2:

  1. מניח רבעים מוח לתוך קלטות הטבעה בהדרגה מייבשי רקמה באמבטיות יותר מרוכזות 1 h אתנול ברציפות (70%, 80%, 95% ו -100% x3).
  2. אתנול מנקה מהרקמה עם שלוש אמבטיות קסילן רצופות 100% (1 h כל אחד). זהירות: קסילן רעיל shולד להיות מטופלים מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים.
  3. הטמע רקמה בבלוקי פרפין לאחר שתי אמבטיות מותכות פרפין שעווה (56 - 58 ° C, 90 דקות כל אחד).

יום 3:

  1. חותכים 10 סעיפים מיקרומטר בעובי של המוח פרפין מוטבע באמצעות microtome. סעיפים לטבול באמבט מים (50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות) ולמרוח על שקופיות מיקרוסקופ. השאירו את השקופיות להתייבש O / N, הבטחת הידבקות רקמות לשקופית.

2. Immunostaining

הערה: שילובים שונים של נוגדנים יכולים להיות מנוצלים עבור ההליך המכתים המתואר להלן. קוקטיילים נוגדן תואם רקמות המוח מפני חולדות ועכברים מפורטים בטבלה 1.

יום 4:

  1. Deparaffinize החלק במוח באמצעות אמבטיות קסילן 2x 100% (12 דקות כל אחד).
  2. רעננותם חלקים במוח באמבטיות אתנול רצופות - 100% במשך 10 דקות, 95% במשך 5 דקות, 80% במשך 10 דקות, ולבסוף 70% במשך 15 דקות - followeד על ידי שטיפות 3x PBS [5 דקות ב RT, עם תסיסה אור]. בינתיים, פתרון יחזור אנטיגן חום עד 95 - 97 ° C על פלטה חשמלית עם ערבוב בר מגנטי.
  3. דגירה חלקה במוח בתמיסה יחזור אנטיגן ב 95 - C ° 97 למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף 3x ב PBS (5 דקות ב RT, עם תסיסה אור).
  4. מגלשות יבשות במהירות באמצעות מגבי משימה עדינים כדי למנוע התייבשות רקמה, ולהסיק מחסום הידרופובי מסביב לאזור הרקמה עם עט מחסום הידרופובי. מלא את אזור הרקמה הקיף עם חסימת חיץ [PBS המכיל 0.3% Triton X-100 ו -10% סרום דונקי רגיל (NDS)], לדגור על RT עבור 1 שעות בתא humidified.
  5. חלף חיץ חסימה עם נוגדן ראשוני Iba1 (מדולל במאגר חסימה) לתייג פגוציטים mononuclear, דגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. עבור המארחים נוגדן דילולים עובדים, ראה טבלה 1 טבלה של חומרים.

יום 5:

  1. לִשְׁטוֹףנוגדן ראשוני עם אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). דגירה עם נוגדנים משני ניאון (מצומדות עם fluorophore פליטה 594 ננומטר) עבור H 1 (בחסימת המאגר ב RT בחושך) ואחריו אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). בשלב זה, לשמור על סעיפים בחושך כדי למנוע הלבנת אות ניאון.

יום 6 - 7:

  1. חזור על שלבי 2.5 & 2.6 עם CD68 (מוח עכברוש) או LAMP1 (רקמות עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (בשילוב עם fluorophore פליטה 488 ננומטר) לתייג phagolysosomes.

יום 7 - 8:

  1. חזור על שלבי 2.5 & 2.6 עם OC (רקמות חולדה) או 4G8 (מוח עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (מצמיד את fluorophore 647 ננומטר) לתייג פיקדונות Aβ.
    הערה: לחלופין, נוגדני 6E10 יכול לשמש היא בהצלחה על רקמות עכבר וחולדה. עבור שילובים נוגדנים מתאימים, ראה טבלה של חומרים .
  2. אפשר סעיפים לגמרי יבש O / N ב RT בחושך. לאחר מכן, לכסות דגימות עם תלוש כיסוי האטום על ידי תקשורת הרכבת קרינה המכילה DAPI.

3. רכישת מערכי נתונים גדולים Confocal Z- מחסנית

הערה: פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר אוטומטי לחלוטין מצויד מטרה 60X ו 405 ננומטר, 488 ננומטר, 594 ננומטר, ו 647 nm לייזרים. כל הציוד הוא מחשב בשליטת תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת פרוטוקול ההדמיה, כוח על מנורת המחשב, epifluorescent, מיקרוסקופ, לייזרי מצלמה.

יום 9:

  1. בחר את מטרת מיקרוסקופ 60X. מוסיפים שמן טבילה העדשה, ומניחים את המדגם על מחזיק השקופיות הבמה מיקרוסקופ. הרם את המטרה עד שהשמן יוצר קשר עם השקופיות. התאם את מישור המוקד לאיתור פלאק עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת המוח באמצעות תאורה epifluorescent דרך oculars.
  2. רוכשת im confocalהגילאים של פגוציטים mononuclear מופעל שמסביב פיקדונות עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת מכרסמים על ידי מיקרוסקופ confocal (בהגדלה 60X, צעדים Z- מחסנית: 0.25 מיקרומטר

4. q3DISM

הערה: על מנת להניב תוצאות משמעותיות, אנו ממליצים לנתח מינימום של 3 תמונות לכל חיה / אזור של עניין. עבור כל תמונה, השפע של תאים לנתח עשוי להשתנות תלוי פרדיגמות ניסוי. בתוצאות נציג שהוכח בדו"ח זה, ניתחנו מצב 3 תאים / (למשל, mononuclear פגוציטים רחוקים או הקשורים הפלאק; לראות 1C דמויות - D ו- 2C - D).

יום 10:

  1. לנתח מערכי נתונים confocal עם colocalization תוכנת ניתוח עיבוד תמונה 3D מדעית (coloc) מודול בקרבה מרחבית של Iba1 / CD68 (רקמות חולדה) או Iba1 / LAMP1 (רקמות העכבר) מכתים בכל z-מטוסים בו זמנית.צור איבא + / CD68 + או איבא + / LAMP1 + colocalization הערוצים מתאימות phagolysosomes בתוך פגוציטים mononuclear מופעל.
    1. בחר TRITC עבור ערוץ A (המקביל ל מכתים Iba1 יחד עם 594 fluorophore ננומטר) FITC עבור B ערוץ (המקביל ל CD68 או מכתים LAMP1 יחד עם 488 fluorophore ננומטר). בצד הימני של חלון התוכנה עבור 'בדיקת מצב, בחר' סף 'ועבור' עוצמות coloc 'בחר' ערוצי מקור '.
    2. לחץ על 'ערוך' כדי לבחור 'צבע coloc' בצד הימני של חלון התוכנה.
    3. עבור כל ערוץ בנפרד, להתאים ספים לכלול מכתים ספציפי ואינו כולל אותות רקע / הלא ספציפיים. לאחר מותאם, לא לשנות ספים בין תמונות על מנת להבטיח ניתוח משוחד. ווקסלים colocalized (פיקסלים מכל Z- ערימות) יופיעו בצבע שנבחר בשלב 4.1.2 בכל Z- ערימות SIMultaneously.
    4. לחץ על 'לבנות ערוץ coloc'. ערוץ colocalization נוצר יופיע בחלון התאמת תצוגה.
    5. הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך '% נפח / חומר מעל לסף colocalized' מייצגים את% ממסר Iba1 (ווקסלים המתאימים fluorophore 594 ננומטר) colocalized עם LAMP1 או אות CD68 (ווקסלים המתאימים fluorophore 488 ננומטר). יותר פשוט, זה הוא נפח מונוציטים שנכבשו על ידי phagolysosomes (ראה איורים 1 ג ו 2C).
      הערה: '% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized' תואמת% ממסר LAMP1 או CD68 colocalized עם Iba1. זה צריך להיות קרוב ל -100%, כפי phagolysosomes הם מבנים תאיים. הערכים מבוססים על יחס של אות מכל Z- ערימות מעל לסף colocalized.
  2. באמצעות מודול coloc, לנתח את ערוץ coloc שנוצרה בשלב 4.1 בקרבה מרחבית עם OC (עכברוש tissue) או 4G8 (רקמות העכבר) אותות Aβ. זה מאפשר לכמת Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes.
    1. בחרו בערוץ מערך נתונים coloc (המקביל ל Iba1 / CD68 או Iba1 / LAMP1 coloc ערוץ שנוצרה בשלב 4.1) ו Cy5 עבור B ערוץ (fluorophore המתאים OC או 4G8 מכתים יחד עם 647 ננומטר).
    2. בניית ערוץ coloc כמתואר 4.1.2 צעדים 4.1.5.
    3. הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך '% נפח / חומר מעל לסף colocalized' מייצגים את% של Iba1 / LAMP1 או Iba1 / CD68 (ווקסלים מקבילים לערוץ coloc נבנה בשלב 4.1.5.) Colocalized עם OC או אות 4G8 (ווקסלים מתאימים 647 fluorophore ננומטר). זהו נפח phagolysosomal שנכבשו על ידי Aβ (ראו תרשימים 1D ו 2 ד).
      הערה: '% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized' מתכתב עם% ממסר Aβ הכולל colocalized עם phagolysosomes.זה יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי של פיקדונות Aβ הכוללים כמוסות בתוך phagolysosomes (לא מוצג בתוצאות הנציג הנוכחיות).
  3. השתמש מודול לעלות לשחזר את ערימות תמונת confocal וליצור מודלי 3D של Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes מונוציטים.
    1. בחלון 'תצוגת ההתאמה', בחר TRITC (כדי להציג רק מכתים Iba1). בחלון 'מאפייני נפח', לחץ על 'הוסף שטח חדש'.
    2. בשלב '1/5 אלגוריתם', ב 'הגדרות', בחר 'משטח'. כמו כן, ב 'צבע', בחר סוג צבע צבעים או RGB ולהתאים שקיפות (אדום מוגדר ב 60% שקיפות איורים 1B ו -2). סמן תיבה 'בחר אזור של אינטרס ". לחץ הבא.
    3. בשלב '2/5 האזור של עניין, "לצייר חלון סביב תא העניין על ידי התאמת x, y ו- z קואורדינטות (ראו תיבות לבנות איורי 1A ו 2 א). לחץ הבא.
    4. בשלב 'ערוץ מקור 3/5', בחרו בערוץ מקור TRITC. סמן את התיבה 'חלקה' ורמת פירוט שטח מוגדר 0.4 מיקרומטר. עבור 'thresholding,' לבחור עוצמת מוחלטת. לחץ הבא.
    5. בשלב '4/5 סף, "להתאים סף כך הנפח נוצר חופף באופן מושלם עם אות ערוץ TRITC. לחץ הבא.
    6. בשלב '5/5 לסווג משטחים, "בסעיף" סוג מסנן, "בחר אובייקטים בהתאם לגודלם להיכלל או מחוץ כרכים להיווצר. לחץ על סיום, לבצע את כל שלבי היצירה, וצא האשף.
    7. חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ FITC (LAMP1 + או CD68 + phagolysosomes).
    8. חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ Cy5 (OC + או 4G8 + Aβ פיקדונות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מתודולוגיה רב שלבית עבור q3DISM שפורטו לעיל, אנו מסוגלים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes מונוציטים במוחם של עכברים APP / PS1 (איור 1) וחולדות TgF344-AD (איור 2). לכן, המתודולוגיה q3DISM אפשרה ניתוח פגוציטים mononuclear במודלים של עכברים וחולדה של AD. מעניין לציין, כי נפח שנכבשו על ידי CD68 + phagolysosomes הוא גדל באופן משמעותי ב phagocytes mononuclear Iba1 + הקשורים לעומת רחוקים הפל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול זה אנו מתארים בדוח זה כדי לכמת 3D אמיתי של phagocytosis Aβ in vivo על ידי פגוציטים mononuclear מסתמך על תיוג ספציפי של תאים סלולריים ו subcellular וכן פיקדונות Aβ. באופן ספציפי, אנו משתמשים Iba1 (מיונן בסידן כריכה מתאם המולקולה 1), חלבון כי הוא מעורב עלעול קרום phagocytosis על תא הפעלה 18, 19, להכתים פגוציטים mononuclear מוחין. בעוד Iba1 + תאים נחשבים בדרך כלל microglia מוח-תושב, אפשרי עדיין כי שולי פגוציטים mononuclea...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V. ג'י-ס. נתמך על ידי פרס מלגת מחקר מחלת האלצהיימר של קרן BrightFocus (A2015309F) ופרס החוקר הצעיר של אגודת האלצהיימר, סניף סאות'לנד בקליפורניה. T.M.W. נתמך על ידי קרן ARCS ומלגת פוסט-דוקטורט ע"ש ג'ון דאגלס פרנץ' אלצהיימר ע"ש מגי מקנייט ראסל-JDFAF. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (1R01NS076794-01, ל-T.T.), פרס עמיתי זניט של אגודת האלצהיימר (ZEN-10-174633, ל-T.T.), ופרס אמצע הקריירה של הפדרציה האמריקאית לחקר ההזדקנות/הקרן הרפואית אליסון ג'ולי מרטין בחקר ההזדקנות (M11472, ל-T.T). אנו אסירי תודה על כספי הסטארט-אפ מהמכון הנוירוגנטי Zilkha, שעזרו לאפשר את העבודה הזו.  

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IsofluraneAbbottNDC 0044-5260-05
מספריים לניתוחVWR82027-582
מספריים לניתוח קצה קההVWR82027-588
פינצטהVWR94024-408
23 גרם מחטVWRBD305145
משאבה פריסטלטית FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02מי מלח עם חוצץ פוספט; ריכוז עבודה 1x
מטריצת מוח עכבר למבוגרים, פרוסות קורונליות, נירוסטה 1 מ"מ Kent ScientificRBMS-200C
מטריצת מוח חולדה בוגרת, פרוסות קורונליות, נירוסטה 1 מ"מ קנט סיינטיפיקRBMS-305C 
32% תמיסה מימית פרפורמלדהיד (PFA)EMS15714-Sאזהרה: רעיל. ריכוז עבודה: 4% ב-PBS
אתנולVWR89125-188ריכוזים שונים, ראה פרוטוקול
Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
הטבעה וחדירה פרפיןVWR15147-839
Microtome Leica RM2125Leica Biosystems
להבי מיקרוטום חד פעמיים VWR25608-964
אמבט מים Leica HI 1210Leica Biosystems
מיקרו שקופיות Superfrost פלוסVWR48311-703
קסילןסיגמא-אולדריץ'534056-4X4Lזהירות: רעיל 
פתרון אחזור מטרה 10xDAKOS1699ריכוז עבודה 1x
KimWipesVWR21905-026
עט PAP הידרופוביVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
סרום חמור רגיל (NDS)Jackson Immuno017-000-121
CoverslipsVWR48393081
מגיב אנטי-דהייה זהב עם DAPILife TechnologiesP36935
מתלה שקופיות זכוכיתVWR100492-942
נוגדן Iba1 (פוליקלונלי, ארנב)Wako019-19741 ריכוז עבודה 1:200
נוגדן Iba1 (פוליקלונלי, עז)LifeSpan BioscienceLS-B2645ריכוז עבודה 1:200
נוגדן CD68 [KP1] חולדה (חד שבטי, עכבר)Abcamab955ריכוז עבודה 1:200
עכבר CD68 [FA-11] נוגדן (חד שבטי, חולדה)Abcamab53444ריכוז עבודה 1:200
נוגדן CD107a (LAMP1) עכבר (חד שבטי, חולדה)Affymetrix14-1071ריכוז עבודה 1:100
בטא-עמילואיד, 17 - 24 (4G8) נוגדן (חד שבטי, עכבר)CovanceSIG-39220ריכוז עבודה 1:200
בטא-עמילואיד, 1 - 16 (6E10) נוגדן (חד שבטי, עכבר)CovanceSIG-39320ריכוז עבודה 1:200
נוגדן OC (פוליקלונלי, ארנב)מתנה על ידי D. H. Cribbs ו- C. G. Glabe (UC Irvine)ריכוז עבודה 1:200
Alexa Fluor 488 נוגדן משני לעכברInvitrogenA-11001ריכוז עבודה 1:1,000
Alexa Fluor 488 נוגדן משני לחולדהInvitrogenA-11006ריכוז עבודה 1:1,000
Alexa Fluor 594 נוגדן משני לארנבInvitrogenA-11037ריכוז עבודה 1:1,000
Alexa Fluor 594 נוגדן משני לעזיםInvitrogenA-11080ריכוז עבודה 1:1,000
Alexa Fluor 647 נוגדן משני לעכברInvitrogenA-21235ריכוז עבודה 1:1,000
Alexa Fluor 647 נוגדן משני ארנבInvitrogenA-21443ריכוז עבודה 1:1,000
שמן טבילהNikon 
מיקרוסקופ קונפוקלי A1ניקון 
NIS Elements תוכנת מחקר מתקדמתNikon 
Imaris:תוכנת Bitplane גרסה 7.6Bitplane"coloc" ו-"supass". לחלופין, התוכנה החינמית בקוד פתוח  ניתן להשתמש ב-ImageJ לקולוקליזציה  ניתוח מערכי נתונים קונפוקליים של z-stacks.
נעשה שימוש במודולי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774(2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949(2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393(2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185(2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33(2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46(2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים