פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
קלטות אלקטרו של תאים באמצעות טכניקת מהדק התיקון אפשרו לזיהוי סוגי נוירונים שונים המבוססים על דפוסי ירי. הכללת biocytin / Neurobiotin ב האלקטרודה ההקלטה מתירה פוסט הוק התאוששות של פרטים מורפולוגיים, אשר נחוצים כדי לקבוע את arborization הדנדריטים ואת באזורים אליהם מכוונים את האקסונים של הנוירונים המוקלטים. עם זאת, בהתחשב בנוכחות של נוירונים דומים מורפולוגית עם זהויות הנוירוכימיים ברורות ופונקציות, מכתים immunohistochemical עבור חלבוני תא מסוג ספציפי חיוני לזהות נוירונים באופן סופי. כדי לשמור על קישוריות רשת, חלקים במוח להקלטות פיסיולוגיות ערוכים בעובי של 300 מיקרומטר או גדולים יותר. עם זאת, עובי זה לעתים קרובות מעכבת postprocessing immunohistological עקב בעיות עם חדירה נוגדן, דבר המחייב את resectioning של הרקמה. Resectioning של פרוסות הוא אמנות מאתגרת, לעתים קרובות Resulטינג אובדן רקמות המורפולוגיה של התאים שמהם נתוני אלקטרו הושגו, עיבוד הנתונים שמישים. מאז ההתאוששות של מורפולוגיה תגביל אובדן נתונים ומדריך בבחירת סמנים עצביים, אימצנו אסטרטגיה של מחלים מורפולוגיה התא הראשון, ואחריו immunostaining משנית. אנחנו מציגים גישה מעשית biocytin המילוי במהלך הקלטה פיסיולוגיים immunostaining סדרה נוסף של ההתאוששות של מורפולוגיה, ואחריו restaining סעיפים כדי לקבוע את הזהות הנוירוכימיים. אנו מדווחים כי הקטעים היו מלאים biocytin, קבועים עם paraformaldehyde (PFA), מוכתמים, ו coverslipped ניתן להסיר restained עם ימי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן. restaining זה כולל הסרת coverslip, כביסה הפרקים, פתרון חיץ, ו הדגירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לחשוף את זהותו הנוירוכימיים. השיטה היא יתרון עבור ביטול datהפסד עקב חוסר יכולת לשחזר מורפולוגיה עבור בצמצום סמנים הנוירוכימיים להיבדק המבוסס על מורפולוגיה.
מבוא
המוח ידוע גיוון המאפיינים המבניים ותפקודיים של האלמנטים העצביים הפרט שלה. הבנת התפקידים של סוגי נוירונים ברורים בתפקודי המוח והפתולוגיה דורש אפיון זיהוי חד משמעי של הנוירונים. מבחינה מבנית, תכונות המורפולוגיות המוגדרות לפי מיקום somato-הדנדריטים לקבוע את תשומות פוטנציאל שתא מוח נתון מקבל, בעוד הדפוס של arborization אקסונלית מזהה מטרות postsynaptic פוטנציאליות. המגוון המבני של נוירונים כבר מוערך מאז ימי המחקרים היסטולוגית הזרע של רמון y קחאל 1. הופעתו של טכניקות הקלטת תא בודד עולה כי נוירונים מבחינה מבנית גם להראות הבדלי דפוסי ירי ומאפיינים הסינפטי. המגוון במבנה ופיזיולוגיה בולט במיוחד נוירונים מעכבים GABAergic 2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מילוי 1. Biocytin במהלך Electrophysiology
הערה: הקוראים יכולים להפנות למקורות חלופיים טכניקות הקלטת תיקון- clamp בסיס מכשור 19-22, אשר לא פרטו על כאן. הצעדים המפורטים כאן להניח כי הציוד והנהלים להקלטות-מהדק תיקון כבר מבוססים, והתיאור יוגבל הפרטים הקשורים biocytin-מילוי immunostaining פוסט-הוק. כל הניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו על חולדות.
- באמצעות vibratome, להכין חלקים במוח החי של האזור הרצוי בעובי של 300 - 350 מיקרומטר 23.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם סיום מוצלח, בסעיפים לשמר את המילוי biocytin ואת immunolabeling ביצע בשלב 2 וניתן צילמו באמצעות confocal או מיקרוסקופ epifluorescence. בנוסף, חלקים מעובדים גם יראה immunostaining עבור אנטיגן שכותרתו במהלך עיבוד שלאחר מכן בשלב 3. במקטע באיור 2, את המורפולוגיה של נוירון מלא biocytin בחלק עבה (300 מיקרומטר) התגלה באמצעות streptavidin דמיינו (R CB 1) האדום בפריימריס הראשונים דמיינו בירוק. Immunostaining הראשונה בוצעה תוך 7.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
מילוי התא תוקן עם biocytin הוא הצעד החשוב ביותר כדי להבטיח את ההתאוששות המלאה של המורפולוגיה. מועד להחלמה מלאה של התא, זה הכרחי כדי לבחור את כיוון הדפסה פרוס אופטימלית כדי למזער את ניתוק התהליכים במהלך חיתוך. כיוון זה עשוי להשתנות בהתאם לסוג המעגל ותא בבחינה. הבא, זה הכרחי כדי לאפשר זמן מספיק עבור biocytin מפוזר על דנדריטים אקסונים. צבעים מסוימים, כגון Neurobiotin, יכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות התמיכה מ- NIH / NINDS R01 NS069861 ו NJCBIR CBIR14IRG024 כדי VS.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | צביעה חיסונית |
| KCl | Fluka | 60129 | צביעה חיסונית |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | צביעה חיסונית |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | צביעה חיסונית |
| של שרקנים נגד CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | באדיבות G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor Conjugate | בדיקות מולקולריות | S11227 | Immunostaining |
| סרום עיזים רגיל (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | צביעה חיסונית |
| נוגדנים משניים | בדיקות מולקולריות | של אלקסה פלואור צבעים מצומדים | צביעה חיסונית |
| מסלול Labnet שייקר במהירות נמוכה | Bioexpress | S-2030-LS | מלקחיים לצביעה חיסונית |
| Dumont | 11231-30 | ||
| תיקיות שקופיות | EMS | 71520 | צביעה חיסונית |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | אלקטרופיזיולוגיה |
| מגבר Multiclamp 700B | מכשירים מולקולריים | Multiclamp 700B | אלקטרופיזיולוגיה |
| pCLAMP 10 תוכנה | מכשירים מולקולריים | pCLAMP 10 | אלקטרופיזיולוגיה |
| דיגיטייזר | מכשירים מולקולריים | Digidata 1440 דיגיטייזר | אלקטרופיזיולוגיה |
| טיפים מסננים | Nalgene | 171-0020 | אלקטרופיזיולוגיה |
| סוניקטור | פישר סיינטיפיק | 15-335-100 | אלקטרופיזיולוגיה |
| מיקרו-מעמיסים | אפנדורף | 930001007 | אלקטרופיזיולוגיה |
| ביוציטין | סיגמא | B4261 | אלקטרופיזיולוגיה |
מקורות
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
