מאמר שיטה

Immunostaining סעיפים Biocytin מלא ומעובד מרקרים הנוירוכימיים

22.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54880

⸱

31 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, 2Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.

תקציר

קלטות אלקטרו של תאים באמצעות טכניקת מהדק התיקון אפשרו לזיהוי סוגי נוירונים שונים המבוססים על דפוסי ירי. הכללת biocytin / Neurobiotin ב האלקטרודה ההקלטה מתירה פוסט הוק התאוששות של פרטים מורפולוגיים, אשר נחוצים כדי לקבוע את arborization הדנדריטים ואת באזורים אליהם מכוונים את האקסונים של הנוירונים המוקלטים. עם זאת, בהתחשב בנוכחות של נוירונים דומים מורפולוגית עם זהויות הנוירוכימיים ברורות ופונקציות, מכתים immunohistochemical עבור חלבוני תא מסוג ספציפי חיוני לזהות נוירונים באופן סופי. כדי לשמור על קישוריות רשת, חלקים במוח להקלטות פיסיולוגיות ערוכים בעובי של 300 מיקרומטר או גדולים יותר. עם זאת, עובי זה לעתים קרובות מעכבת postprocessing immunohistological עקב בעיות עם חדירה נוגדן, דבר המחייב את resectioning של הרקמה. Resectioning של פרוסות הוא אמנות מאתגרת, לעתים קרובות Resulטינג אובדן רקמות המורפולוגיה של התאים שמהם נתוני אלקטרו הושגו, עיבוד הנתונים שמישים. מאז ההתאוששות של מורפולוגיה תגביל אובדן נתונים ומדריך בבחירת סמנים עצביים, אימצנו אסטרטגיה של מחלים מורפולוגיה התא הראשון, ואחריו immunostaining משנית. אנחנו מציגים גישה מעשית biocytin המילוי במהלך הקלטה פיסיולוגיים immunostaining סדרה נוסף של ההתאוששות של מורפולוגיה, ואחריו restaining סעיפים כדי לקבוע את הזהות הנוירוכימיים. אנו מדווחים כי הקטעים היו מלאים biocytin, קבועים עם paraformaldehyde (PFA), מוכתמים, ו coverslipped ניתן להסיר restained עם ימי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן. restaining זה כולל הסרת coverslip, כביסה הפרקים, פתרון חיץ, ו הדגירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לחשוף את זהותו הנוירוכימיים. השיטה היא יתרון עבור ביטול datהפסד עקב חוסר יכולת לשחזר מורפולוגיה עבור בצמצום סמנים הנוירוכימיים להיבדק המבוסס על מורפולוגיה.

מבוא

המוח ידוע גיוון המאפיינים המבניים ותפקודיים של האלמנטים העצביים הפרט שלה. הבנת התפקידים של סוגי נוירונים ברורים בתפקודי המוח והפתולוגיה דורש אפיון זיהוי חד משמעי של הנוירונים. מבחינה מבנית, תכונות המורפולוגיות המוגדרות לפי מיקום somato-הדנדריטים לקבוע את תשומות פוטנציאל שתא מוח נתון מקבל, בעוד הדפוס של arborization אקסונלית מזהה מטרות postsynaptic פוטנציאליות. המגוון המבני של נוירונים כבר מוערך מאז ימי המחקרים היסטולוגית הזרע של רמון y קחאל 1. הופעתו של טכניקות הקלטת תא בודד עולה כי נוירונים מבחינה מבנית גם להראות הבדלי דפוסי ירי ומאפיינים הסינפטי. המגוון במבנה ופיזיולוגיה בולט במיוחד נוירונים מעכבים GABAergic 2,3. בנוסף, היא הפכה יותר ויותר נראה כי structurallנוירונים דומה y יכול להביע סמנים הנוירוכימיים שונים ולהראות מקביל הבדלים פונקציונליים 4. בדומה לכך, נוירונים עם אותו הסמנים הנוירוכימיים יכולים להיות מבנים נפרדים ופונקציות 5-10. לכן, בפועל, הניתוח של המאפיינים הפונקציונליים של נוירונים ותפקידם הרשת כרוך להגדיר הן זהויות מורפולוגיים הנוירוכימיים. אפילו עם כניסתו של קווי עכבר כתב מיקוד סמנים הנוירוכימיים ספציפיים, זה לעתים קרובות יש צורך לקבוע מורפולוגיה וזהות תת סוג מבוסס על immunohistology 11.

השיטה הסטנדרטית המשמשת לאפיין תאים רשמו פרוסות מוח חריפות היא למלא אותם עם biocytin או Neurobiotin במהלך ההקלטה, לתקן את הסעיפים paraformaldehyde (PFA) בעקבות ההקלטות, ולהשתמש אימונוהיסטוכימיה כדי לחשוף את המורפולוגיה הנוירוכימיה. מאז עובי סעיפים עבור פיזיולוגיה פרוסה הם בדרך כלל 300 מיקרומטראו יותר, כי רוב הנוגדנים מצליחים לחדור לאורך כל הדרך בעומק זה, פרוסות צריך להיות מחדש מחולק ל -60 מיקרומטר או פחות כדי לאפשר immunostaining סימולטני biocytin וסמנים הנוירוכימיים 12-14. למרבה הצער, resectioning מייגע; סיכוני אובדן רקמות במהלך חתך; ויכול להוביל דיפרנציאלי הצטמקות רקמות, שמסבך שחזורים מורפולוגיים. בנוסף, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול לעזור לצמצם את הסמנים המועמדים כי צפוי לבוא לידי ביטוי על ידי התאים. יש לנו שונה פרוטוקולי immunohistology biocytin הסטנדרטיים כדי לאפשר עיבוד סדרה של החלקים ראשונים להתאוששות של מורפולוגיה ואז לזיהוי סמנים הנוירוכימיים פוטנציאליים.

אימונוהיסטוכימיה היא חקרה חלוקת אנטיגן ברקמות או תאים וניתן מדמיינת באמצעות אנזים, תוויות ניאון, יסודות רדיואקטיביים, או חלקיקי קולואיד זהב 15. אני ההליךnvolves באמצעות נוגדנים ראשוניים לתייג ולהגביר ספציפי אחד או יותר אנטיגנים במיוחד, ואחריו שימוש נוגדנים משני ניאון מיקוד הנוגדן הראשוני לשם ויזואליזציה. בשל הצורך להבחין בין ספקטרום הקרינה של כל נוגדנים משני ללא חפיפה, רק מספר מוגבל של אנטיגנים יכול להיבחן בו זמנית. לפיכך, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול להיות שימושי בבחירת סמנים הנוירוכימיים מועמד סיווג התא. מבחינה מושגית, את הרציונל מאחורי עיבוד סדר סעיפים כבר מוכתמים מבוסס על ההנחה כי immunolabeling עבור אחד חלבון או פפטיד אינו אמור להפריע antigenicity ו immunolabeling עוקבת עבור פפטיד עצמאית מבחינה מבנית 16. חוסר ההתערבות זאת בשל הכריכה של נוגדנים על epitope חלבון מסוים על אנטיגן ולכן מאפשר מכתים סימולטני של אנטיגנים מרובים באותו הרקמות. מספר אנטיגנים revealeד על ידי immunostaining הוא מוגבל על ידי צורך ספקטרה שאינה חופפת של נוגדנים משני פלורסנט, בצורך למקד אנטיגנים בודדים עם נוגדנים וגדלו מינים שונים כדי לחסל 17,18 תגובתיות צולבת. אמנם זהו ההיגיון מאחורי הסדרה ולא תיוג סימולטני עם שני נוגדנים ברורים שעשוי אינטראקציה, למיטב ידיעתנו, immunostaining עבור אנטיגן שני לא דווח לאחר השלים immunolabeling עבור אנטיגנים אחד או יותר על חלקים רכובים. כאן, אנו מתארים שיטה immunostaining סדר ויטראז'ים בעבר רכוב חלקים. בעוד אנו בפירוט את התהליך הזה עבור הליך immunolabeling סדר להחלמתם של מורפולוגיה ואחריו מכתים עבור סמנים חלבוניים / פפטיד חלקים עבים, אותם ההליכים ניתן להשתמש בתקן, סעיפים היסטולוגית דקים גם כן. בנוסף, אנו מתארים גישה מעשית למלא נוירונים מוקלטים עם biocytin והתהליך כדי לסלק אתאלקטרודה מהתא עם השלמת ההקלטות כדי לייעל את המילוי של axonal ו סוכות הדנדריטים של נוירונים, כמוצג 6,8 העבודה האחרונה שלנו.

היתרון החשוב ביותר של ההליך המתואר כאן הוא כי המורפולוגיה של התא רשם ניתן לשחזר באופן מלא צלמה לפני שתנסה כריתה או immunostain הפרוסות. למרות בעיות עם החדירה של נוגדנים מסוימים עשויות להבהיר את זה צורך פרוס כריתה עבור immunostaining המשנית, הנהלים המפורטים כאן היו מונעים את הצורך לשחזר נוירונים מורכבים ממקטעים מרובים היה למנוע בעיות עקב אובדן רקמות הצטמקות הפרש, אשר יכולים לסכן את שיקום בעקבות resectioning. יתרון נוסף הוא כי התהליך יהיה להפחית עלויות, זמן, מאמץ, ונוגדנים יקרים ידי הגבלת immunostaining מחדש חתך פרוס שבו מלאה biocytin נוירונים הם התאוששו. ההיבט המעשי ביותר הוא המודעותimmunostaining ditional שניתן לבצע על חודשים מוכתם סעיפים לפני השימוש בטכניקה הנ"ל. בפרט, ההתאוששות של מורפולוגיה תפחית את הפוטנציאל ניכר כי נתונים פיסיולוגיים מתאי נמחקת בשל חוסר יכולת להשיג אפיון מורפולוגי בסיסי של סוג התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מילוי 1. Biocytin במהלך Electrophysiology

הערה: הקוראים יכולים להפנות למקורות חלופיים טכניקות הקלטת תיקון- clamp בסיס מכשור 19-22, אשר לא פרטו על כאן. הצעדים המפורטים כאן להניח כי הציוד והנהלים להקלטות-מהדק תיקון כבר מבוססים, והתיאור יוגבל הפרטים הקשורים biocytin-מילוי immunostaining פוסט-הוק. כל הניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו על חולדות.

  1. באמצעות vibratome, להכין חלקים במוח החי של האזור הרצוי בעובי של 300 - 350 מיקרומטר 23.
  2. הכן פתרון פנימי המכיל biocytin 0.2% על ידי הוספת 2 מ"ג biocytin ל 1 מ"ל של פתרון פנימי 6. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, sonicate הפתרון הפנימי עבור 10 - 15 דקות עד biocytin מתמוסס לחלוטין. בשלב הבא, לטעון את פתרון פנימי בתוך מזרק 1 מ"ל מצויד עם 0.2 &# 160; מיקרומטר נקבוביות מסנן גודל פוליפרופילן קצה המחובר microloader. שמור מזרק טעינה זה על חפיסה קרה כדי לשמור על היציבות של Mg-ATP ו Na-GTP בפתרון הפנימי.
    הערה: כרטיס גלוקונאט אשלגן המכיל פתרון פנימי (126 מ"מ-גלוקונאט K, 4 מ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 4 מ"מ Mg-ATP, 0.3 מ"מ Na-GTP, ו -10 phosphocreatine מ"מ) הוא אופטימלי עבור התאוששות של סמנים הנוירוכימיים מסוימים, כולל parvalbumin, במהלך immunolabeling. מניסיוננו, באמצעות cesium- ופתרונות פנימיים מבוססי כלור מפחיתה את היכולת להתאושש immunostaining עבור סמנים הנוירוכימיים מסוימים. Neurobiotin או תא-impermeant, אפשר לתקן, נותב הקוטב המשלב Alexa Fluorophore עם biocytin יכול לשמש כחלופה biocytin.
  3. תחת התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום, לדמיין את התא המתאים להקלטה. כדי למזער את ההפרעה של האקסון, להתקרב גוף התא על ידי הפחתת פיפטה לאורך צירו באמצעות f "גישה"משיחה זמינה ברוב micromanipulators. להקים כל תא הקלטות תחת התערבות הפרש לעומת אינפרא אדום באמצעות פרוטוקולי פיזיולוגית תיקון- clamp 19-22.
    הערה: הימנע מתקרב התא מהכיוון של האקסון המשוערת, כפי שהוא ינתק את האקסון, דמיינו כמו בועה בסוף לחתוך (החץ הירוק באיור 1). כמו כן, להימנע מהפעלת לחץ חיובי גבוה פיפטה ההקלטה בעת שהתקרב התא כדי למזער לשפוך של biocytin, אשר יגרום מכתים רקע גבוה.

figure-protocol-1
איור 1. מוצע מטוס מתקרב תאים עבור Biocytin ממלא. התמונה ממחישה תא גרגיר (GC) מתמלא biocytin במהלך ההקלטה שעובדה לחשוף biocytin (באדום באמצעות streptavidin 594 מצומדות). יש GC דנדריטים שלה מכוונים במישור XY. שים לב תא הגרגיר ניתקהאקסון (חץ ירוק) בשל התנועה פיפטה במישור XY. שים לב הוא אידיאלי להתקרב נוירון זה במישור XZ. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.

  1. בתצורת מהדק מתח, לקבוע את הקיבול כל התא והתנגדות סדרה בתגובה הקטן (5 mV), קצרות (30 מילישניות) מתח צעדים באמצעות באמצעות בדיקת תפקודי קרום במצב אמבטית רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיה תוכנת ניתוח. פעולה זו תבטיח את בקביעת תנאי הקלטה כל התא כדי לאפשר מילוי biocytin.
  2. לנהל הקלטות פיסיולוגיות במצב משני שוטף או מתח- clamp לפי צורך. זמן הקלטת מינימום של> 10 דקות ב 34 מעלות צלזיוס הוא אידיאלי.
    הערה: ארוכה יותר פעמי הקלטה עשויות להיות נחוצות עבור מחקרים שבוצעו בטמפרטורת חדר.
  3. עם השלמת ההקלטות הפיזיולוגיות, להקים מחדש את התצורה-מהדק תיקון על ידי העברת פיפטה ההקלטה לאט בצעדים קטנים, לסירוגין כלפי מעלה (לאורך ציר ה- Z) וכלפי חוץ (לאורך ציר ה- X) במצב מתח- clamp.
  4. במקביל לפקח על התנגדות קיבול קלט באמצעות "מבחן קרום" הפונקציה כדי להמחיש את האובדן ארעי קיבולים וקריסת התגובות הקיימות כדי בקו ישר, המציין את מחדש והאיטום של התא ואת ההקמה מחוץ-out- תיקון בקצה פיפטה. החזקת תא פוטנציאל depolarized (-40 mV) תקל על תהליך האיטום מחדש.
    הערה: הליך זה להסרת תא בדרך כלל מבטיח התאוששות מלאה של סומה דנדריטים. אל תפעילו לחץ חיובי פיפטה ההקלטה במהלך הליך זה או תוך ניתוק התא מן פיפטה. ויזואליזציה של סומה של התא נרשם הפרוסה מציינת התנתקות מוצלחת. הנוכחות של פסולת הסלולר או תיקון קרום בסוף הקצה המנותק בדרך כלל מצביעה על עקירה של סומה לא תניב מורפולוגיה הסלולר שלמה.
  5. אָחוֹראה ניתוק פיפטה מהתא, לשמר את הפרוסה לתא הקלטה עבור 3 - 5 דקות על מנת להבטיח את התחבורה של צבע כדי הדנדריטים דיסטלי ותהליכים אקסונלית.
  6. מעביר את הפרוסות לצלחת 24 גם המכילה 4% PFA עבור קיבעון.
    זהירות: PFA הוא מסרטנים, וציוד מגן אישי מתאים, כוללים כפפות ומסכת פנים, חייב לשמש כדי למנוע עור לגירוי שאיפה. PFA דליק יש להרחיק מהישג ידם של אש. PFA הוא לא מסולק לטמיון יש לאסוף כפסולת כימית. קיבעון PFA חייב להיות מבודד מאזורים מנוצל להכנת פרוסה חי כדי למנוע זיהום של ההתקנה פיזיולוגיה, כולל טפטפות ההעברה.
  7. 24 - 48 שעות לאחר קיבוע PFA, להעביר את פרוסות 0.1 M פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לאחסון לפני immunostaining.
    הערה: באופן אידיאלי, biocytin התאוששות immunostaining הם הטובים ביותר כאשר היא מבוצעת מיד לאחר קיבעון, למרות לכל מכתים נוצר בתוך 7 ד תשואות קיבעון תוצאות טובות. פרוסות יכול להישמר PBS 0.02 - 0.05% אזיד הנתרן מכתים שבוצעו עד ולמעלה מ -90 ימים לאחר קיבוע. למרות קיבעון לילה PFA עובד היטב עבור רוב הנוגדנים, יתכן כי חלק מן הנוגדנים פועלים בצורה הטובה ביותר כאשר משך הדגירה מקבע מצטמצם. קיבוע ב PFA במשך 48 שעות מקטין את זמינות אנטיגנים ומצמצמת את הסיכוי immunostaining משני מוצלח עבור סמנים הנוירוכימיים.
    זהירות: אזיד הנתרן הוא מאוד מסוכנים מגרה במגע עם העור או העיניים או על בליעה או שאיפה. יכול לגרום למוות חשיפת יתר חמורה. המסרטנת ו מוטגניות של המתחם אינן ידועות. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים לרבות כפפות, משקפי להתיז, חלוק מעבדה, ומכשיר הנשמה אבק. אזיד הנתרן לא ממומשת ב לטמיון יש לאסוף כפסולת כימית.
e_title "> 2. מכתים של הנוגדן הראשוני הראשון Biocytin

(יום 1)
הערה: ההליך immunostaining הבא מיועד סעיפים "פנויות" ודורש רציפה רועד במהירות נמוכה (2 מהפכות / min, סל"ד) על שייקר עבור כל הצעדים הדגירה.

  1. שטפו את 3x רקמות במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
    הערה: 0.1 M PBS ניתן לרכוש מסחרית או המיוצרים במעבדה כדלקמן (עושה 1 ליטר): 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na 2 HPO 4, ו 0.24 גרם של KH 2 PO 4 ב 1 L של dH 2 0.
    הערה: אם את הסמן הנוירוכימיים הרצוי ידוע, מכתים עבור חלבון / פפטיד יכול להתבצע בו זמנית עם biocytin מכתים (שלבים 2.2 - 2.4). אם מכתים עבור biocytin בלבד, עבור לשלב 2.5.
  2. בלוק עם 10% חסימת סרום (BS; עז בסרום נורמלי (NGS) מדולל 0.3% Triton X-100 ב PBS עבור 1 ש 'ב RT): אופציונלי.
    הערה: כל טוב צריךלקבל את אותו הנפח של הפתרון; הנפח המומלץ הוא בין 250 - 500 μL / טוב. הבחירה של סרום החסימה מבוססת על המינים שבה הנוגדנים משני גדלים (למשל, NGS משמש אנטי עז צבען מצומדות (מיני נוגדן ראשוני בהתאמה)). אם מתעורר הצורך להשתמש נוגדנים משני וגדל מינים שונים כדי immunostain סעיפים, כולל 10% של כל בסרום נורמלי בחסימת צעד (2) ו -3% של כל בסרום נורמלי עבור צעדים הדגירה נוגדנים ראשוניים ומשניים.
  3. (אופציונלי) דגירה מקטעים נוגדן ראשוני, CB 1 R (polyclonal, שפן ניסיונות) עם 0.3% Triton X-100, ו BS 3% ב 0.1 M PBS ב RT O / N. CB 1 R משמש לזיהוי סוג קולטן קנבינואידים 1 הביטוי.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי ולא נדרשים לחשוף את המילוי biocytin. איור 2 מדגים קטע שכותרתו עבור biocytin ו- R CB 1 במהלך תהליך מכתים הראשון. O / N incubation ב RT מספיק עבור רוב של נוגדנים ראשוניים; עם זאת, נוגדנים ראשוניים מסוימים, לרבות R CB 1, דורשים 3 - 5 ד של דגירה. אם הדגירה צריכה להיות יותר מ 1 ד, מומלץ דגירה על 4 מעלות צלזיוס כי טריטון X-100 יכולים permeabilize פרוסות ויכולים לגרום להתפוררות של הרקמה במהלך דגירה ממושכת בטמפרטורת חדר. כלול שליטה שלילית חסרת נוגדן ראשוני בסעיף לפחות אחד מכל סדרה של ניסויים כבקרה את הספציפיות של הנוגדנים משני. עבור פקדים שליליים, הנוגדן הראשוני מושמט, אך 0.3% Triton X-100 ב 0.1 M PBS ו BS מתווספים.

figure-protocol-2
איור 2. מוצלח CCK מכתים 1 שבוע בעקבות השחזור של Biocytin מכתים ו- C annabinoid קולטן מסוג 1 (CB 1 R) - <תיוג> חזק. (A - C) תמונות Confocal ב 60X מראה הנוירון מלא biocytin (א) ו immunoreactivity R CB 1 (ב), שמסומן על ידי ראש חץ. סעיף אותו היה מעובד עבור immunostaining CCK לאחר שבוע 1 (C). השכבה-העל של תמונות מוצגת D. immunoreactivity CCK התגלה באמצעות מרחיקות אדום היה פסאודו בצבע ב ציאן. (E) שיחזור מורפולוגי של התא מלא biocytin בבאור א כי biocytin והכתים CB 1 R ניכרים גם לאחר immunostaining CCK השני. כמו כן שים לב ההתפלגות הצפויה של R CB 1 ודפוסים immunostaining CCK. (F - H) תמונה מוגדלת של האקסון מהתא, כמו A, קרוב תכנית שיתוף לוקליזציה של biocytin ו- R CB 1 אקסונים (ראשי חץ). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר (A - D), 100 מיקרומטר (E), ו -10 מיקרומטר ( et al. 2015 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

(יום 2)

  1. שטפו את המוח בסעיפים 3x במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
  2. דגירת המקטעים המצומד צבע אדום streptavidin (ריכוז: 1: 1,000; עירור: 594 ננומטר עם פליטה בספקטרום האדום נראה לעין) BS 0.3% Triton X-100 ו -3% ב 0.1 M PBS ב 4 ° CO / N כהה (עטוף בנייר כסף) כדי לחשוף את biocytin. אופציונליים: כלול נוגדנים משני, חזיר אנטי-גינאה עיזים (ריכוז: 1: 500; עירור: 488 ננומטר ופליטה בירוק), עם הדגירה לעיל אם בעקבות הדגירה העיקרית האופציונלית בשלב 2.3.
    הערה: נוגדנים משני יהיה צורך רק אם מכתים נוגדן ראשוני פומבי (שלב 2.3) מתבצע. כדי להמחיש biocytin, streהמצומד ptavidin-fluorophore עם ספקטרום פליטה באדום מומלץ, כפי שהוא עוזר לדמיין אקסונים עדינים בפירוט עם ניגודיות טובה יותר (איורים 1 - 3). במהלך immunostaining הכפולה או משולשת, על מנת למנוע תגובתיות צולבת של נוגדנים משני אחד עם השני, להוסיף נוגדנים משני בזו אחר זו באופן סדרתי (2 מרווח h בין תוספות הסידוריות של הנוגדנים מספיק). איור 3A ממחיש תא מלא biocytin מעובד ללא מכתים נוגדן ראשוני פומבי צילמו לפני resectioning.

figure-protocol-3
איור 3. Immunostaining שנית מוצלח בעקבות השחזור של Biocytin מורפולוגיה Resectioning. (A1) Confocal תמונה של פרוסה 300 מיקרומטר מראה את ההתאוששות של המורפולוגיה הדנדריטים של תא מלא biocytin. (<מתח ממברנה A2) עקבות strong> של הנוירון בתגובת 500 ו -100 זריקות נוכחיות ברשות. (ב) שחזור של סומה המלאה biocytin בתוך סעיף 50 מיקרומטר המתקבל לאחר resectioning בסעיף 300 מיקרומטר (ב A1) לאחר ההרכבה והדמיה. (B2) immunostaining לאחר הסעיף דק חשף colocalization של סומה מלא biocytin (פאנל מימין) עם CCK (פאנל באמצע). התמונה הממוזגת מודגמת בלוח הימני. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לוח A2 משועתקת באישור ואח יו. , In press 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

(יום 3)

  1. חלקים במוח לשטוף 3x במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
  2. כדי להגן על הקרינה ועל מנת להקל מחדש מכתים בעתיד, ההר השנימשא בתווך הרכבה מימית מבוסס וסוגר את הקצוות של coverslip עם לק ברור.
    הערה: עדיף restain סעיפים מוקדם ככל האפשר כדי למנוע קשיים בהסרת לק משקופית, שריצה עובש, והתייבשות של רקמות עקב דליפה של הרכבה בינונית משקופית הזכוכית. ניתן למנוע זיהום מיקרוביאלי באמצעות אזיד הנתרן 0.02% ב PBS.
    זהירות: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר ודליקים כאשר הוא בא במגע עם מים. עיין נהלי עבודה סטנדרטיים עבור טיפול וסילוק של חומרים מסוכנים.
    (ימים 4 - 7)
  3. בצע הדמיה confocal עם עירור ב 594 ו 488 ננומטר בהגדלה של 20X או 40X לחשוף נוירונים מלאות biocytin בסמנים אדום neurochemical (CB 1 R) בירוק. להעריך colabeling (איור 2).
  4. הגדר את חשיפת המצלמה פחות מ -100 ms כדי למנוע photobleaching ו obtaבערימות תמונה confocal של סוכות axonal ו הדנדריטים של הנוירון כולו. השתמש ערימות התמונה confocal וחבילות תוכנה התחקות נוירון לשחזר את המורפולוגיה העצבית.

3. מכתים של הנוגדן הראשוני שנית

הערה: בעוד צעד immunostaining השני יכול להתבצע 90 ד לאחר המכתים הראשון, מכתים אופטימלי מושג אם מכתים הנוגדן השני העיקרית מתבצע בתוך 7 - 10 ד.

(לאחר 7 - 90 ד)

  1. החל אצטון כדי מקלון צמר גפן ויסיר את לק הנחה של שקופיות זכוכית.
  2. הסר את coverslip בזהירות בעזרת מלקחיים בסדר-קצה ולשים כמה טיפות של 0.1 M PBS על הסעיפים.
  3. מוציאים בזהירות את הסעיפים משקופית באמצעות מברשת צבע עדין ולשטוף אותם 0.1 M PBS עבור 24 - 48 שעות על שייקר מכוסה בנייר אלומיניום באור נמוך ב 4 מעלות צלסיוס
    הערה: זה חיוני כדי לכסות חלקים עםרדיד luminum להימנע photobleaching.
  4. כדי להבטיח הסרה מלאה של הרכבה בינונית, לשטוף את סעיפים 1 - 2x למחרת ב 0.1 M PBS במשך 10 דקות כל אחד.
  5. המשך עם הדגירה הנוגדן הראשוני השני (למשל, כולציסטוקינין, ונוירופפטידים נמצא interneurons GABAergic מסוימים (CCK; ריכוז: 1: 1,000; נוגדנים חד שבטיים העכבר)) עבור 1 ד (איור 2).
    הערה: הליך זה דומה לשלב 2.3, אך עושה שימוש נוגדן שונה. בנוסף, צעד החסימה מושמט במהלך מחדש מכתים.
  6. שטוף את החלקים במוח שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
  7. כתם עם עז נוגדנים משני מצומדות fluorophore אנטי העכבר (ריכוז: 1: 500; גל עירור: 647 ננומטר), ולוודא כי ספקטרום פליטת עירור של נוגדנים משני אינו חופף עם streptavidin (ריכוז: 1: 1,000; גל עירור: 594 ננומטר) immunofluorescence לפניכתמים.
  8. הר בסעיפים במדיום הרכבה מימי וסוגרים את הקצוות של להחליק את המכסה עם לק ברור.
    הערה: אחסן את הסעיפים ב 4 מעלות צלזיוס תיבת אחסון אטומה כדי להגן על הקרינה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עם סיום מוצלח, בסעיפים לשמר את המילוי biocytin ואת immunolabeling ביצע בשלב 2 וניתן צילמו באמצעות confocal או מיקרוסקופ epifluorescence. בנוסף, חלקים מעובדים גם יראה immunostaining עבור אנטיגן שכותרתו במהלך עיבוד שלאחר מכן בשלב 3. במקטע באיור 2, את המורפולוגיה של נוירון מלא biocytin בחלק עבה (300 מיקרומטר) התגלה באמצעות streptavidin דמיינו (R CB 1) האדום בפריימריס הראשונים דמיינו בירוק. Immunostaining הראשונה בוצעה תוך 7...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

מילוי התא תוקן עם biocytin הוא הצעד החשוב ביותר כדי להבטיח את ההתאוששות המלאה של המורפולוגיה. מועד להחלמה מלאה של התא, זה הכרחי כדי לבחור את כיוון הדפסה פרוס אופטימלית כדי למזער את ניתוק התהליכים במהלך חיתוך. כיוון זה עשוי להשתנות בהתאם לסוג המעגל ותא בבחינה. הבא, זה הכרחי כדי לאפשר זמן מספיק עבור biocytin מפוזר על דנדריטים אקסונים. צבעים מסוימים, כגון Neurobiotin, יכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות התמיכה מ- NIH / NINDS R01 NS069861 ו NJCBIR CBIR14IRG024 כדי VS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NaClSigmaS7653צביעה חיסונית
KClFluka60129צביעה חיסונית
Na2HPO4 SigmaS7907צביעה חיסונית
KH2PO4 Sigma229806Immunostaining
Triton X-100SigmaT8787צביעה חיסונית
של שרקנים נגד CB1 SigmaAf530-1Immunostaining
Mouse anti CCKCURE, UCLAבאדיבות G. OhningImmunostaining
Rabbit anti ParvalbuminSwantPV27Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor Conjugateבדיקות מולקולריותS11227Immunostaining
סרום עיזים רגיל (NGS)SigmaG9023Immunostaining
Vectashield Vector LabsH-1000צביעה חיסונית
נוגדנים משנייםבדיקות מולקולריותשל אלקסה פלואור צבעים מצומדיםצביעה חיסונית
מסלול Labnet שייקר במהירות נמוכהBioexpressS-2030-LSמלקחיים לצביעה חיסונית
Dumont11231-30
תיקיות שקופיותEMS71520צביעה חיסונית
Vibratome VT 1200 SLeica14048142066אלקטרופיזיולוגיה
מגבר Multiclamp 700Bמכשירים מולקולרייםMulticlamp 700Bאלקטרופיזיולוגיה
pCLAMP 10 תוכנהמכשירים מולקולרייםpCLAMP 10 אלקטרופיזיולוגיה
דיגיטייזרמכשירים מולקולרייםDigidata 1440 דיגיטייזראלקטרופיזיולוגיה
טיפים מסנניםNalgene171-0020אלקטרופיזיולוגיה
סוניקטורפישר סיינטיפיק15-335-100אלקטרופיזיולוגיה
מיקרו-מעמיסיםאפנדורף930001007אלקטרופיזיולוגיה
ביוציטיןסיגמאB4261אלקטרופיזיולוגיה
צביעה חיסונית

מקורות

  1. Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9(2010).
  2. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  3. Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  4. Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
  5. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553(2013).
  6. Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
  7. Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
  8. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
  9. Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
  10. Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
  11. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109(2015).
  12. Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
  13. Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
  14. Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17(2011).
  15. Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C. Double staining immunohistochemistry. N Am J Med Sci. 2 (5), 241-245 (2010).
  16. Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
  17. Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
  18. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358(2015).
  20. Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
  21. Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
  22. Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
  23. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  24. Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
  25. Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
  26. Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109(2013).
  27. Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
  28. Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים