הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הגברת Recovery Time וירידה מינהל LPS לחקר העצב התועה מנגנוני גירוי בתגובות דלקתיות מוגבל

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54890

⸱

29 במרץ 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Unit of Rheumatology, Center for Molecular Medicine (CMM), Karolinska Institute, Karolinska University Hospital

במאמר זה

סיכום

גירוי עצב הוואגוס הוכח כבעל יעילות חזקה להפחתת דלקת היקפית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול גירוי עצב תועה שונה המאפשר בדיקות נוספות של המנגנונים האנטי דלקתיים הכולינרגיים בתגובות דלקתיות מוגבלות.

תקציר

דלקת היא תגובה מקומית לזיהום ולנזק לרקמות המתווכת על ידי מקרופאגים פעילים, מונוציטים ותאים חיסוניים אחרים המשחררים ציטוקינים ומתווכים אחרים של דלקת. במשך זמן רב נחקרו מנגנונים הומורליים ותאיים על תפקידם בוויסות התגובה החיסונית, אך ההתקדמות האחרונה בתחום האימונולוגיה ומדעי המוח חשפה גם מנגנונים עצביים ספציפיים בעלי פוטנציאל טיפולי מעניין. מה שנקרא מסלול נוגד דלקת כולינרגי (CAP) תואר כדי לשלוט בתגובות חיסוניות מולדות ובדלקת בצורה חזקה מאוד. בתחילת שנות ה-2000, טרייסי ועמיתיו פיתחו טכניקה המגרה את עצב התועה ומחקה את השפעת המסלול. המתודולוגיה מבוססת על גירוי חשמלי של עצב התועה במתח ובתדר נמוכים, על מנת למנוע תופעות לוואי של גירוי יתר, כגון אי ויסות של השתנות קצב הלב. מכשירים חשמליים לגירוי זמינים כעת, מה שמקל על הגדרת המתודולוגיה במעבדה. מטרת מחקר זה הייתה לחקור את המעורבות הפוטנציאלית של פרוסטגלנדינים ב-CAP. למרבה הצער, בהתבסס על ניסיונות קודמים, לא הצלחנו להשתמש בפרוטוקול המקורי, מכיוון שהתגובה הדלקתית המושרית הייתה גבוהה מדי או לא התאימה לתכונות חילוף החומרים האנזימטי. ההגדרות השונות של פרוטוקול הניתוח המקורי נותרו ברובן ללא שינוי, אך התנאים הנוגעים לאינדוקציה דלקתית ונקודת הזמן לפני ההקרבה שופרו כדי להתאים למטרותינו (כלומר, לחקור את המעורבות של ה-CAP בתגובות דלקתיות מוגבלות יותר).

הגרסה המעודכנת של הפרוטוקול המקורי, המוצגת כאן, כוללת טווח זמן ארוך יותר בין גירוי עצב התועה לניתוח, הקשור לאינדוקציה נמוכה יותר של תגובות דלקתיות. בנוסף, תוך הפחתת רמת הליפופוליסכרידים (LPS) להזרקה, נתקלנו גם בתצפיות חדשות לגבי תכונות מכניסטיות בטחול.

מבוא

חסינות מולדת מספקת שורה ראשונה מיידית של הגנה מפני זיהומים ומחלות במגוון רחב של אורגניזמים. זה לא רק משיג את התגובה החיסונית הראשונית כדי לחסל את האיום, אבל זה גם משחק תפקיד מרכזי בהפעלה והדרכת החסינות אדפטיבית כי מבצעת תגובות משתי חיסוניות בצורה פתוגן ספציפית. דלקת היא מתוזמרת על ידי שפע של ציטוקינים chemokines, שבתורה יש את היכולת למשוך תאים חיסוניים אחרים לאתר של זיהום וכדי לגרום סימני הקרדינל של דלקת, כגון אדמומיות, נפיחות, כאב, אובדן התפקוד, וחום . משך ועוצמת הדלקת תלוי במספר גורמים, אך בפתרון דלקת ושחזור הומאוסטזיס הוא שלב קריטי, כדי למנוע התפרצות של מחלות דלקתיות כרוניות. התפתחויות אחרונות בתחום הנוירולוגיה אימונולוגיה יש נפרם מנגנונים עצביים ספציפיים עם פוטנציאל טיפולי עצום לשלוט inflammation היא במערכת העצבים המרכזית ובפריפריה. אחד המנגנונים האלה הוא המסלול אנטי דלקתי כולינרגית (CAP), הידוע גם בשם רפלקס הדלקתי, אשר מונע על ידי מערכת העצבים האוטונומית 4, 5.

הוא חשב כרגע כי מתווכים דלקתיים להפעיל עצבים תחושתיים ושולחים אותות על מצב הדלקת במערכת העצבים המרכזית. תגובה רפלקס אז מופעל באמצעות העצב התועה efferent. מחקר מקיף על הפרטים האנטומיים של CAP חשף דגם הפאראסימפתטית-אוהד מורכב משני עצבים, העצב התועה ואת עצב טחול, בהתאמה 6. בשנות ה CAP, העצב התועה כולינרגית efferent מופעל מסתיים גנגליון צליאק-mesenteric, וכתוצאה מכך ההפעלה של עצב הטחול אדרנרגיים על ידי מנגנון טרם נחקרו. עצב הטחול, ולכן הופעל, ידוע פנימיvate בסמיכות לתאים חיסוניים עיסת לבן, אזור שולי, ואת עיסת אדום של הטחול, קרן איבר חובה של CAP 7, 8. ונוראפינפרין (NE) מן קצות עצבי טחול נקשר לרצפטורים אדרנרגיים β 2 המתאימים הביעו על לימפוציטים מסוג T טחול. זה גורם transferase אצטיל כולין (צ'אט) אצטילכולין בתיווך (ACH) שחרור, אשר בתורו מפעיל קולטני אצטילכולין ניקוטינית α7 (α7nACh) על מקרופאגים, וכך להגביל ייצור ציטוקינים ודלקות 2. כתוצאה מכך, עכשיו זה ברור כי מערכת העצבים היא מסוגלת לווסת דלקת ברקמות היקפיות וכדי לשחזר הומאוסטזיס מקומית חיסונית.

כפי שהשם של המסלול מרמז, מערכת האח היא בעל חשיבות מרכזית לתפקוד מסלול המסדיר נוירו-החיסון הזה. מעניין, המנגנונים מעורבים בהפעלהה- CAP נראה שונה בפריפריה ובמערכת העצבים המרכזית. למרות החשיבות של קולטנים ניקוטינית (α7nAChR) בטחול הודגמה מוקדם 9, קולטנים מוסקריניים (mAChR) הם חובה עבור ההפעלה המרכזית של המסלול 10, 11. לאחרונה, ממשל היקפי של אגוניסט M1 מוסקריניים מרכזי הפועל α גורם נימק בסרום מודחק משמעותי וטחול גידול (TNFα) במהלך endotoxemia בעכברים הקטלני, פעולה שחייב שלם עצב תועה ואת עצב טחול איתות 12. גם הראינו לאחרונה כי עכברים שחסרו פרוסטגלנדין E 2 (PGE 2) לא היו מסוגלים להגיב לגירוי העצב התועה ולא למטה להסדיר את שחרורו המושרה LPS של ציטוקינים בסרום והטחול 3. לכן, CAP יכול גם להיות מוסדר על ידי מערכות אחרות מאשר pathw האח הראשיAY.

העצב התועה כבר בשם כזה בגלל כמובן לנדוד בגוף, innervating אברים עיקריים כולל הכבד, ריאות, טחול, כליות, ואת הבטן 13. בהתחשב עצבוב גדול זו והשפעת אימונוסופרסיבי מאוד חזקה של העצב התועה, את הפוטנציאל הטיפולי של CAP יכול לכסות מגוון רחב של מצבים דלקתיים. עצב התועה יכול להיות חשמלי (או מכאני) מופעל, עם שליטה על המתח ותדירות, ובניגוד לטיפול קונבנציונלי, ללא תרופות הוסיפו לגוף. ניסויים נערכים כיום בחולי ראומטיים, למשל, כדי לבדוק את המשמעות הקלינית של VNS בטיפול בדלקת כרונית 14. בסך הכל, התקשורת חיסונית-נוירו והרגולציה של דלקת כרגע תחת חקירה, אשר תספק טיפול חלופי אפשרי לטיפול קונבנציונלי. לכן, ניתוח של העצב התועה stimulatioאפקט n באיברים מעוצבבים השונים, אלא גם אפיון של הפעולה הטיפולית הפוטנציאלית מודלים בבעלי חיים למחלות דלקתיות כרוני, בהחלט ייתן תובנה ולקוות מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות.

המתודולוגיה המקורית שפותחה על ידי טרייסי ועמיתיו 4 לא יכולה להיות משורבבת לתחום שלנו של מחקר עקב גירוי יתר של התגובה הדלקתית (על ידי מנה קטלנית של LPS) ומגוון מדי-זמן קצר בין הפעלת CAP ואת ההקראה. בעבודה הנוכחית, נציג את השינויים שבוצעו בפרוטוקול המקורי, להשוות בין שתי מתודולוגיות שונות על רמות ציטוקינים, ולהאיר של התבוננות חדשה ההפוכה על איבר המטרה (הטחול).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ולשימוש בחיות אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית בבית קרולינסקה בסטוקהולם. ועדת האתיקה המקומית בעקבות הנחיות האיחוד האירופי על טיפול בבעלי חיים.

הערה: השינויים העיקריים מן הפרוטוקול המקורי הם זמן החלמה לאחר ניתוח (6 שעות לעומת 1 hr) ורמת LPS מוזרק (2 מ"ג / ק"ג לעומת 15 מ"ג / ק"ג). אחרת, הגדרות שונות הקשורות לניתוח עצמו לא שונו.

1. הכנת חומר עבור גירוי

  1. הפעילו את המחשב ואת מערכת הרכשת נתונים צמוד (איור 1 א) מגרה אלקטרודה.
  2. הזן את תכנית מכירים.
  3. הכן פתרון המניות של LPS בריכוז של 5 מ"ג / מ"ל ​​ב PBS 1x, aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. ביום הניסוי, להפשיר aliquot ולהכין ADEמדגם של LPS קווייט (0.5 מ"ג / מ"ל) כדי להזריק סביב 100 μl לתוך החיה, לפי משקל.

2. הכנת בעלי החיים עבור הרדמה

  1. השתמשו C57Bl / 6 עכברים. לשמור אותם בתנאי אקלים מבוקר עם מחזור אור 12-hr / כהה, להאכיל אותם צ'או מכרסמים רגילים, ולתת להם כרצונך מים.
  2. בצע ניתוח על עכברים כי שוקל בסביבות 25 גרם ביום של הניסוי.
    הערה: כאשר תגובות דלקתיות מושרות, חשוב במיוחד לבצע בדיקות ותצפיות קבועות של התגובות הקליניות בחיות. המתת חסד מוקדם על ידי שאיפת 2 CO נדרשת אם תנאי החיה אינו עומד בקריטריונים האתיים.
  3. הגדר את מכונת ההרדמה.
    1. ודא כי הצינורות מחוברים כראוי והוא לא ניזוק בצורה כלשהי. ודא כי במקום מאוורר פועל כהלכה. חבר את מסנן מפתח בקבוק isoflurane ולמלא את vaporizer עם כמות isoflurane מספיק.
    2. פתח את אספקת הגז (אוויר וחמצן) ולוודא כי הבקבוקים המכילים גז מספיק לצורך הניסוי. מחבר שלושה כיוונים ואז תוכל לשלוח את זרימת isoflurane לתא האינדוקציה או המסכה.
  4. הפעל את המחבר המשולש לתא האינדוקציה. פיק עכבר אחד מהכלוב הביתה ולהכניס את החיה לתוך התא. התאם את הרגולטור זרימת חמצן 1.0 L / min ואוויר 1.0 L / min. התאם את ריכוז isoflurane ל 4 - 5%.
  5. כאשר רמת ההרדמה הרצויה, כאשר רמת ההרדמה הרצויה, לגלח את אזור הניתוח ולעבור את החיה מבית הבליעה אל המסכה. הפעל את מחבר שלושה כיווני זרימת מסכה. התאם את הרגולטור זרימת חמצן 0.25 L / min ואוויר 0.25 L / min.
    1. התאם את ריכוז isoflurane ל -1.5 - 2.5%. בדוק את רמת הרדמה בשלט רפלקס וקצב הנשימה לפני תחילת procedur כירורגידואר.
  6. תקן את הרגליים של העכבר על ספסל העבודה באמצעות דבק. ודא כי האף של החיה עדיין בדקדקנות את המסכה.

3. כירורגיה ועידוד של העצב התועה

  1. לחטא את אזור הניתוח עם 70% אתנול.
  2. באמצעות אזמל, לחתוך את העור בזהירות ברמה של הצוואר (חתך של בסביבות 1 עד 1.5 ס"מ).
    הערה: הפרוטוקול, הליך הניתוח מסתיים כאן עבור חיות-דמה פעל. ואכן, הוכח כי רק נגיעה בעצב עם כלי מתכת כבר מגרה אותו במידה מסוימת. לכן, כדי לקבל חיה מלאה ניתוח מדויק יותר כאשר משתמשים בכמות קטנה של LPS, להפסיק את הניתוח בשלב זה.
  3. בעזרת מיקרוסקופ (אובייקטיבי 12.5X), לבודד את העצב התועה השמאלי מן העורק הראשי באמצעות מלקחיים לנתח. ראשית לאתר את שריר sternocleidomastoid ידי הסרת שכבות עור ושומן, ולאחר מכן לחזור בוכדי לשים את המלקחיים מאחורי שניהם עצב ואת העורק.
    הערה: השלב הבא הוא מאוד מסובך, כמו העצב העורק הם דבקו באופן הדוק זה לזה. לכן, קל מאוד לחתוך את הספינה ולהרוג את החיה. עם זאת, על ידי הצבת מלקחיים בזהירות רבה בין העצב והעורק, הם בסופו של דבר להפריד, וזה אפשרי לבודד את העצב.
  4. מניחים את האלקטרודה (1B איור) תחת העצב התועה. אלקטרודה המחט ארוכה למדי, כך שגם אם העצב מעביר מעט במהלך הגירוי, זה תמיד יהיה במגע עם האלקטרודה.
  5. לביצוע הזרקה הזרקה (IP) של LPS (2 מ"ג / ק"ג) בעזרת מזרק (עבור לקריאה על רמות הציטוקינים; כלומר, כדי למדוד את השפעת ויסות למטה).
  6. מתן 5 דקות לפני תחילת הגירוי.
  7. לעורר את העצב התועה עבור 5 דקות ב 5 V ו- 1 הרץ על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנית הכר.
  8. מִחָדָשׁלהזיז את אלקטרודה ו תפר את הפצע של החיה עם חוט תפירה כירורגית.
  9. רסס סרט מכשול אין סטינג (NSBF) על הפצע כדי לשפר ריפוי להגן מפני זיהומים.

שחזור 4. של בעלי החיים

  1. לאחר הניתוח, להזיז את החיה חזרה לכלוב בבית שלו עבור התעוררות והתאוששות. תחת אור אינפרא-אדום על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף, לוודא לפקח על בעלי חיים עד להכרה מלאה כבר חזר.
  2. בואו החיה להתאושש בכלוב שלה עבור 6 שעות לפני ההקרבה לניתוח.
    הערה: ההשפעה של גירוי עצב הואגוס היא מאוד מהירה וגם הוכחה להיות ארוך שנמשך (עד 48 שעות), כך שזמן ההתאוששות יכול להיות מוגדר על ידי הנסיין בהתאם לצרכי המחקר.

5. קורבן לניתוח נוסף

  1. מניח את החיה בכלוב הקשור מכשיר ממשל 2 CO.
  2. הגדר את המכשיר על 5מחזור -min משאיפת 2 CO.
  3. כאשר המתת חסד נעשה, לאסוף את האיברים של עניין ולהקפיא אותם ישירות על קרח יבש לניתוח נוסף (למשל, למדידת רמות הציטוקינים בתמציות הטחול באמצעות TH1 העכבר / TH2 9-Plex assay) 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רמה של TNFα ו- interleukin-1β (IL-1β) לאחר הגדלת ועבר זמן רב לאחר הניתוח הקטנת המינון של LPS

כפי שהוצג קודם, באמצעות פרוטוקול מקורי, VNS ירד לרמות של TNFα (169.3 ± 24.9 pg / מ"ג בהעמדת הפנים לעומת 39.7 ± 10.8 pg / מ"ג ב VNS, p <0.001) ו- IL-1β (360.0 ± 40.21 pg / מ"ג ב SHAM לעומת 191.7 ± 27.2 pg / מ"ג ב VNS, p <0.01) הטחול לאחר הזרקת LPS הזרקה (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאז גילויו בתחילת שנות ה -2000, המנגנונים של CAP נחקרו ביסודיות. עכשיו יש לנו תמונה טובה של המסלול, ובפרט, איבר היעד, הטחול, שבו NE, תאי T הזיכרון, אח, ו מקרופאגים העבודה כצוות יעיל מאוד למטה לווסת מתווכים דלקתיים 2. גם פרסמנו נתונים לאחרונה על החשיבות של מערכת פרוסטגלנדין תפקודית בעכברים, בפרט, 2 PGE, אשר ללא ספק מרכיב חובה עבור שחרור אח הטחול לאחר ההפעלה של CAP 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לחשוף.

תודות

המחקר נתמך על ידי מועצת המחקר השוודית, האגודה השוודית לראומטיזם, קרנות מכון קרולינסקה, מועצת מחוז שטוקהולם, קרן ולנברג וקרן GV 80 שנה למחקר. המחברים רוצים גם להודות לחנה אוקוט על הגהה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחשבטושיבה-כלמחשב הוא למעשה תואם
MP-150 מערכת רכישת נתוניםBiopac SystemsMP150WSW
Acknowledge תוכנהBiopac Systems
עכברים C57Bl/6של נהר
Simtec Engineering
בקבוק חמצן רפואיAGA107563
בקבוק אוויר רפואי AGA108639
Vetflurane (1,000 מ"ג/גרם)Virbac137317
LPSSigma-AldrichL2630
תמיסת מלחMerck Millipore1024060080
PBS 10xSigma-AldrichP5493מדולל 10 פעמים למזרק ריכוז משומש
(1 מ"ל)BD Plastipak303172
מחטים 23 גרםKD-FINE0.6 x 30 מ"מ (כחול)
מלקחיים מיקרו-חיתוכים (מעוקלים)Sigma-AldrichF4142
מספריים לניתוחSigma-AldrichZ265969
תפר כירורגי 4-0EthiconG667G
יחידת המתת חסדEuthanex SmartboxEA-32000
Cavilon ללא סרטמחסום עוקץ3M Health Care3346N
TH1/TH2 9-Plex assay, ערכה רגישה במיוחדMesoScale DiscoveryK15013C-1
מכשיר אלקטרודות מגרהBiopac SystemsSTIMSOC
Aesculap Isis מכונת גילוחAgnthosGT420
R70דיאטת מכרסמים מלנטמנן, שטוקהולם, שוודיה
מכונת הרדמה צ'ארלס 900284

מקורות

  1. Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
  2. Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
  3. Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
  4. Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
  5. Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
  6. Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
  7. Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
  8. Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
  9. Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
  10. Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
  11. Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
  12. Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
  13. Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. Psychoneuroimmunology. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).
  14. Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3(2012).
  15. Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
  16. Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
  17. Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
  18. Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
  19. Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530(2014).
  20. Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
  21. Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TNF AlphaIL One Beta
הגברת Recovery Time וירידה מינהל LPS לחקר העצב התועה מנגנוני גירוי בתגובות דלקתיות מוגבל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.