Method Article

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

DOI:

10.3791/54897

⸱

December 14th, 2016

 ,  , 
1Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת המיקרו-נטרול (MN) היא טכניקה סטנדרטית למדידת ההדבקה של נגיף השפעת ועיכוב שכפול הנגיף. במחקר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול של בדיקת MN מבוססת הדמיה כדי לכמת את הקשרים האנטיגניים האמיתיים בין נגיפים. בניגוד לבדיקות טיפוסיות להפחתת פלאק המסתמכות על פלאק גלוי לעין, בדיקה זו מכמתת את כל אוכלוסיית התאים הנגועים של כל באר. הפרוטוקול מתאים את סוג הנגיף או תת-הסוג עם בחירת קווי התאים כדי להשיג הדבקה מקסימלית, מה שמשפר את ניגודיות הדגימה במהלך הדמיה ועיבוד תמונה. הכנסת טיטרציה כמותית מגדירה את כמות נגיפי הקלט של הנטרול ומאפשרת להשוות את התוצאות מניסויים שונים. מערך ההדמיה עם סורק שטוח ותוכנה הניתנת להורדה בחינם הופך את הגישה לתפוקה גבוהה, חסכונית, ידידותית למשתמש וקלה לפריסה ברוב המעבדות. המחקר שלנו מדגים כי בדיקת ה-MN המשופרת עובדת היטב עם נגיפי השפעת הנוכחיים A(H1N1)pdm09, A(H3N2) ו-B, מבלי להיות מושפעת באופן משמעותי מהחלפת חומצות אמינו בנוירמינידאז (NA) של נגיפי A(H3N2). הוא שימושי במיוחד לאפיון נגיפים שגדלים לטיטר HA נמוך ו/או עוברים זיהום כושל וכתוצאה מכך חוסר יכולת ליצור פלאק בתאים מתורבתים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני מיקרו-נטרול (MN) משמשים וירולוגיה עבור quantitation של נוגדנים מנטרלים וכן את פעילות אנטי. כחלופה של עיכוב hemagglutination (HI) מבחנים, מבחני MN יכולים להתגבר השפעות חד אנטיגני מושפעות משינויי הזיקה של קולטן מחייב נגיפי שפעת, אשר יכול לסבך את הפרשנות של HI תוצאות 1,2,3. עד לאחרונה, רוב מבחני MN התבססו על תופעות cytopathic (CPE) או מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 4,5. מבחני MN מבוסס על הפחתת מוקד ורובד פותחו 6,7,8 1990. מבחני הפחתת רובד להסתמך על ספירת הפלאק גלוי לכמת infectivity. עם זאת, ספירה חזותית לכסות רק לוחות גדולים כי הם פתירים על ידי עין אנושית, למרות שהרוב הפלאק הם קטנים ובלתי נראים לאיתור וירוסים במחזור נוכחי רבים. כיסוי חלקי זה יכול לגרום וריאציה משמעותית בין בוחנים בין ניסויים, שמוביל iתוצאות ncomparable. זה גם בלתי אפשרי להשתמש בשיטה כאשר וירוסים מסוימים מוצגים זיהום נפל של תאים בודדים או הפלאק קטן מאוד.

החלטת ספירת העניים ניתן לשפר על ידי כניסתה של פרוטוקול מבוסס-הדמיה. עם ההתקדמות הטכנולוגית, מיקרוסקופיה אופטית תפוקה גבוהה הקוראים גם צלחת יכול לספק אמצעי מדויק לספור את התאים הנגועים 9. תחת מיקרוסקופ טרנס-מואר, תאים נגועים מתויגים עם סמנים מסוימים עשויים להיות דמיינו לעומת הקליטה או קרינה שלהם בהחלטת משנה הסלולר. מדגם לאחר מכן ניתן לנתח על מסך מחשב.

למרבה הצער, בשל הגבלת שדה הראייה, יותר ממאה תמונות רעפים נדרשות לכסות היטב יחיד. ניתוח צלחת עם 96 בארות ידרוש ההדמיה והעיבוד של כעשר אלף תמונות. תהליך כזה מייגע הוא זמן רב ויקר, ואת ברזולוצית צבר היא בכללl מיותר לאפיון שגרת זיהומים נגיפיים. מעבדות עם תקציב מוגבל עשויות לגלות כי הגישה הבנויה סביב וסורק מספקת אלטרנטיבה חסכונית, תפוקה גבוהה.

במאמר זה, אנו מתארים assay MN הפחתת פלאק משופר כי הוא מתאים לאפיון אנטיגני של מספר רב של וירוסים ותוכנות עבור מדידת פעילויות אנטי כמותית ונוגדנים הניטרול. יש assay מספר יתרונות: ראשית, היא assay מבוססת הדמיה כי הוא מסוגל למדוד וירום ברמה התאית, ללא קשר לגודל פלאק. ספירת אוכלוסיית התא הנגועה הכוללת (ICP) בתוך באר מגדיל מאוד את רגישות זיהוי, מה שהופך אותו ניתן לאפיין את הווירוסים עם infectivity הנמוך. שנית, טיטרציה כמוני מדויקת יותר הוא הציג לפני נטרול כדי לקבוע את כמות נגיף קלט. וירוס קלט כמותית מפחית באופן משמעותי את Variation בין ניסויים שונים והופך את התוצאות יותר להשוות בין מעבדות. שלישית, טיטר נטרול ניתן לקבוע ישירות על ידי ניתוח תמונות, מה שהופך את quantitation מהיר וידידותי למשתמש. לבסוף, פרוטוקול מספק חסכונית אלטרנטיבה תפוקה גבוהה עם רזולוציה והדיוק הנדרשים. Quantitation מבוסס על וסורק ותוכנות עיבוד נתונים חינם. ההתקנה כולה יש טביעת רגל קטנה והוא פריסה ברוב המעבדות.

הפרוטוקול המובא במאמר זה מורכב מארבעה שלבים עיקריים, כולל טיטרציה וירוס, quantitation טיטרציה, נטרול הנגיף, quantitation הניטרול. טיטרציה וירוס הוא ניסוי הכנה שקובע את כמות וירוסים קלט לשמש הניטרול. במהלך טיטרציה, מספר ריכוזים ויראלי מוחלים על monolayers התא בצלחת 96-היטב. התאים הנגועים אז נבדקים ונרשמים בסעיף 2. dilu ויראליtion שמייצר 20% -85% ICP הוא בתורו מיושם כמו וירוסי קלט הנטרול המקביל סעיף 3. טיטר של פרוטוקול נטרול הם לכמת באמצעות סעיף 4. ניסויים שבאו בעקבות הפרוטוקולים הנ"ל מוצגים נציג תוצאות. את assay נבדק ביסודיות במהלך השנים האחרונות עם רוב נגיף שפעת במחזור הנוכחית, כגון A (H1N1) pdm09, A (H3N2), וירוסי B. התוצאות של אפיון נגיף שפעת נכללו בדוחות עבור פגישת יעוץ WHO כי נתן המלצות על החיסונים לשפעת לשימוש בחצי הכדור הדרומי בשנת 2016 בחצי הכדור הצפוני ב 2016-2017.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: רמת הבטיחות הביולוגית (BSL) עבור הפרוטוקול להלן BSL 2 עבור נגיפי שפעת עונתיים BSL 3+ עבור נגיפי שפעת פוטנציאל מגיפים. טיטרציה ויראלי נדרש מראש של ניסוי נטרול להחליט ריכוז ויראלי של לשלוט בקצב התרבות הנגיף (VC).

1. טיטרציה וירוס

הערה: בהתאם למספר של וירוסים ומספר כפילויות, צלחת גם ניתן להגדיר עם הגמישות הבאים: (1) דילול ויראלי ניתן לארגן יחד גם את השורות או העמודות (איור 1). כל וירוס צריך לכבוש שורה / עמודה נפרדת. (2) תוספת הדילול ויראלי היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם ריכוז ויראלי הגבוה בפינה השמאלית העליונה. (3) אין הגבלה על מספר כפילויות.

הערה: מדין דארבי כליות כלבים (MDCK) ו MDCK-SIAT1 (SIAT) תאים נמסרו באדיבות על ידי ד"ר מ Matrosovich, מרבורג, Gerרב 10. תאים SIAT הם תאים MDCK transfected ביציבות עם CMP-N-acetylneuraminate האדם: הגן בטא galactoside α-2,6-sialyltransferase עבור ביטוי מוגבר של חומצה sialic (SA) אוליגוסכרידים הסתיים α2-6Gal.

  1. תאים Aliquot MDCK מספיק או MDCK-SIAT תאים 8 לתוך צלחות 96-היטב (200 μl / טוב). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ימים 2 או 3 כדי להגיע למפגש. הפץ את תאי DMEM בתוספת 10% נסיוב עגל העוברי חום המומת (FCS) ואנטיביוטיקה (100 פניצילין U / ml ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). דגירה התאים SIAT על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ו סולפט G418 1 מ"ג / מ"ל.
    הערה: גורם לדילול תלוי ניסיון ואת שורת התאים בשימוש. בשכבת התא חייבת להיות ומחוברות (כלומר, אין קיר תא או מתאר גלוי עבור תאי MDCK וכן פריסה בחוזק ארוזה עבור תאי MDCK-SIAT1) בעת חיסון וירוס. דוגמאות של דילולים מבוססים עלתת-תרבות צלוחיות ומחוברות של תאים MDCK או MDCK-SIAT1 ניתנות בטבלה 1.
  2. שוטפים את התאים 3 פעמים עם 200 μl של מדיום הגידול וירוס (VGM) לכל טוב. לעקר את מכונת כביסה צלחת multiwall עם 70% EtOH למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו פוספט בופר סליין סטרילית (PBS) או VGM לפני הכביסה.
  3. לשאוב VGM ומיד להוסיף 50 μl של VGM היטב כל אחד.
  4. להוסיף 900 ​​μl של VGM לכל אחד 6 צינורות סטרילי (או פחות, בהתאם למספר של וירוסי בדיקת כפילויות). פיפטה 100 μl של הנגיף לתוך הצינור הראשון, ומערבבים היטב, לדלל סדרתי, שינוי עצות בין כל דילול. חזור על הפעולה עבור כל וירוס להיות טיטרציה.
    הערה: זה ייתן דילולים וירוס של 10 -1 עד 10 -6.
  5. הוסף 50 μl של דילול כל וירוס, החל משעת הדילול הגבוה ביותר (1 x 10 -5 באיור 1), בארות כפולות (עמודות 9 ו -10 באיור 1) של 96-גם צלחת.
  6. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות כדי לאפשר הנגיף להדביק את התאים.
    הערה: דגירת 2 עד 3 שעות יש צורך להבטיח כי וירוסי הבידוד יש מספיק זמן להגיע בשכבה.
  7. מכינים את שכבת (10 מ"ל / צלחת)
    הערה: כיסוי מורכב 5 מ"ל של 2x DMEM, טריפסין (2 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל), 20 μl של 1 מ"ג / מ"ל ​​המניות, ו -5 מ"ל של linters כותנה תאית (ראה רשימת חומרים).
  8. הסר את הבידוד.
  9. מוסיף את הכיסוי (200 μl לכל היטב). דגירת הלילה בשעה 37 ° C, ללא הפרעה.
    הערה: ניצני הווירוס מתקיימים לאחר כ -4 שעות, ולכן חשוב כי הצלחת אינה מופרעת אחרי הפעם.
  10. לשאוב את הכיסוי מהבארות.
  11. הוספת paraformaldehyde 4% קר כקרח ב PBS A (200 μl / טוב). מניחים אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    הערה: PBS A הוא שנאגר-פוספט הטבעי-pH מלוח עם 10 Gof NaCl, 0.25 גרם של KCl, 1.437 גרם של Na 2 HPO 4, 0.25 גרם של KH 2 PO 4, ו 1 ליטר של מים מזוקקים (ראה רשימת חומרים).
    הערה: Paraformaldehyde מזיק כאשר בשאיפה ויכול לגרום לכוויות בבליעה. יש גם עדויות מוגבלות השפעה מסרטנת, וזה עלול לגרום רגישות לאחר מגע עם העור.
  12. לשאוב paraformaldehyde ולשטוף את הצלחות פעמיים עם PBS A (200 μl / טוב).
  13. אחסן את לוחות PBS ב 4 ° C לשימוש עתידי, או להמשיך בביצוע השלבים הבאים.
  14. הוסף חוצץ permeabilization (100 μl / טוב). עזוב את זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  15. לשטוף צלחת פעמים עם PBS A (200 μl / טוב).
  16. הוסף 50 μl של הנוגדן הראשון, עכבר MAb מפני סוג שפעת (1: 1,000 ב הצפת ELISA), לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 (או לילה 4 ° C), עם רעד.
  17. לשטוף אותו 3 פעמים 100 μl של חיץ לשטוף (0.05% 80 Tween ב PBS A, V / V) עמ 'אה כן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בין שוטף. לחלופין, לשטוף אותו 3 פעמים ללא דגירה באמצעות 300 μl לכל טוב.
  18. הוסף 50 μl של הנוגדן השני, עיזים אנטי עכבר IgG (H + L) המצומד HRP (1: 1,000 ב הצפת ELISA), לכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, עם רעד.
  19. לשטוף אותו 3 פעמים כמתוארות בשלב 1.17.
  20. מוסיפים את המצע (50 μl / טוב). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או עד לפיתוח של צבע כחול נראה בבירור.
  21. כדי לעצור את התגובה, לשטוף את הצלחת פעמיים עם 200 μl של מים מזוקקים לכל טוב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 2 -3 דקות בין הכביסות.
  22. האוויר יבש הצלחת ולאחסן אותו במקום חשוך (למשל, לעטוף אותו בנייר אלומיניום).

2. כימות טיטרציה

  1. מניחים צלחת היטב באזור סריקה של סורק שטוח, כפי שמוצג באיור 2a. השתמש במגבלת עמדת L-צורהלהבטיח מיקום הדמיה אופטימלי דיר.
    הערה: אפשר תמונת שתי צלחות גם בסריקה אחת.
  2. לסרוק תמונה.
    הערה: ההגדרות מוצגות בלוח 2.
  3. הפעל את התוכנה "Reader Wellplate" כדי לחשב את ריכוז וירוס הנדרש (איור 3).
    1. לחץ על הכפתור "תמונה טען" כדי לטעון תמונה. חלק את הפס האדום בהיסטוגרמה של הכרטיסייה "גלובל סף" על מנת להתאים את סף הדגימה. לחץ על הכפתור "רענן" כדי לבחון את ההשפעה על התמונה.
    2. סמן את התיבה "נטרול חישוב / טיטרציה". לחצו על כפתור ה "דגימה" לכמת את ICP. לחצו על כפתור "שמור" כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת.
      הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם "נטרול & טיטרציה חישוב" מופיעה אוטומטית אם "נטרול החישוב / טיטרציה" התיבה מסומנת.
    3. טען או קלט את מפת ההגדרה היטב צלחת. ציין את הסף (למשל, 30%) ב "טיטרציה: אוכלוסין וירוס אופטימליים (%)". בחר בכרטיסייה "תהליך טיטרציה" כדי לחשב את תוצאות טיטרציה. בדוק את התוצאות טיטרציה. לחצו על כפתור "שמור וסגור 'כדי לשמור את התוצאות טיטרציה.
      הערה: עיין משלים S1 עבור הדרכה מפורטת יותר על התוכנה. עותק של התוכנה העידה זמין על פי בקשה.
      הערה: בדרך כלל, דילול הווירוס הטוב ביותר עבור תשואות assay פלאק ההפחתה כ -50% (20-85%) ICP של תאים הכוללים בתוך כל טוב 11.

ניטרול וירוס 3.

הערה: חישוב מספר הצלחות נדרשו עבור assay הנטרול. כל צלחת יכולה להכיל וירוס אחד ומספר נסיובי.

הערה: בהתאם למספר של נסיובי מספר כפילויות, צלחת גם ניתן להגדיר עם ההדואר בא גמישות: (1) הדילול בסרום ניתן לארגן יחד באחת מהשורות או עמודה (איור 4). כל בסרום צריך לתפוס מקום בשורה או בטור נפרד. (2) התוספת של דילול בסרום היא גמישה, אבל זה צריך להתחיל עם הריכוז בסרום הגבוה בפינה השמאלית העליונה של צלחת. (3) מספר כפילויות מאזן את מספר נסיובי. עוד כפילויות יכול לעזור להחליק את וריאציות ניסיון. (4) המספר של VC ומספר שליטת התא (CC) כפילויות גמישות, אבל הם גם צריכים להיות בשורות נפרדות או עמודות. צפוי כי מספר כפילויות VC הוא גדול משמעותית מזה של נסיובי.

  1. הכן את monolayer התא, כמו צעדים 1.1-1.3, 2 או 3 ימים מראש.
  2. הוסף 50 μl של VGM היטב כל הצלחת.
  3. השתמש עמודות 11 ו -12 עבור VC ו CC, בהתאמה. הוסף 50 μl aliquots של 1:20 אנזים להרוס קולטן (RDE) בסרום -treated לשורה הראשונה (א) של קולוםns 1-10.
    הערה: לכל שילוב וירוס וסרום, assay מבוצעת בשני עותקים, כך צלחת ניתן, למשל, מכילה וירוס אחד נבדק נגד חמישה נסיובי.
  4. בצע דילולים סדרו פי 2 על ידי העברת 50 μl מ בטור א לחתור H (עמודות 1-10 באיור 4) ולהשאיר 50 μl מן השורה H.
  5. הוסף 50 μl של diluent היטב בכל בעמודה CC (טור 12 באיור 4).
  6. הוסף 50 μl של הנגיף היטב בכל צלחת, למעט הטור CC (עמודות 1-11, שורות AH באיור 4).
  7. דגירה זה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות. הסר את הבידוד. מוסיף את הכיסוי (200 μl) זה טוב. דגירה זה לילה בשעה 37 ° C, ללא הפרעה. תיקון ו להכתים את הצלחות ובאשר טיטרציה הווירוס (שלבי 1.11-1.22).

4. כימות ניטרול

  1. מניחים צלחת היטב באזור סריקה של סורק משטח אופקי, כפי שמוצג figuמחדש 2a. השתמש מיקום גבול L-צורה כדי להבטיח מיקום הדמיה אופטימלי דיר.
    הערה: אפשר תמונת שתי צלחות גם בסריקה אחת.
  2. סרוק את הצלחת, כמתואר בשלב 2.2.
  3. הפעל את התוכנה "Reader Wellplate" כדי לחשב את titers ויראלי הנדרש (איור 3, שלב 2.3).
    1. לחץ על הכפתור "תמונה טען" כדי לטעון תמונה. חלק את העמודה האדומה "גלובל סף" על מנת להתאים את סף הדגימה. לחץ על הכפתור "רענן" כדי לבחון את האפקט.
    2. סמן את התיבה "נטרול חישוב / טיטרציה". לחצו על כפתור ה "דגימה" לכמת את ICP. לחצו על כפתור "שמור" כדי לשמור את תוצאות הדגימה כאשר תתבקש לעשות זאת.
      הערה: לאחר תהליך הדגימה, חלון חדש בשם "נטרול & טיטרציה חישוב" מופיעה אוטומטית אם "נטרול החישוב / טיטרציה" התיבה מסומנת.
    3. טען או קלט את p-טובהמפה מאוחר. ציין את הסף (למשל, 50%) ב "ניטרול:. זיהום ניכוי (%)"
    4. בחר "תהליך ניטרול" כדי לחשב את titers. בדוק את כותרות ולחץ על כפתור "שמור וסגור 'כדי לשמור את התוצאות הניטרול.
      הערה: ניטרול הוא כפי שדווח הגומלין של הדילול הגבוה ביותר של נסיוב עם הפחתת ICP מוגדרת מראש (כגון 50% או 80%) נגד VC (הממוצעת של טור 11 באיור 4). ירידה של 50% ICP שמשה נציג התוצאות.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות התהליך המתואר לעיל, אנו מציגים כמה תוצאות מניסויי אפיון אנטיגני אחרונים. התקנת טיטרציה נועדה לבחון שמונה וירוסי קלט, עם כפילויות כפולות עבור כל דילול. דילולים ויראלי נבדקו בין 1.0 x 10 -1 ו 1.0 x 1.0 -6 לכסות את ההבדלים בין הווירוסים. הוירוסים הבדיקה היו מן תת סוג H3N2, לרבות A / קמרון / 15V-3538/2015, A / ולדיווסטוק / 36/2015, A / מוסקבה / 103/2015, A / טומסק / 5/2015 /, A / מוסקבה / 101 / 2015, A / מוסקבה / 100/2015, A / מוסקבה / 133/2015, ו- A / ברטיסלבה / 437/2015. תוצאות טיטרציה הן באיור 5. 5D איור מדגים את הירידה של ICPs עם עלייה של דילול וירוס. העקומות היו מנורמלות נגד ICPs מאותו הווירוסים שהניבו זיהומים בכל התאים בתוך באר 12 (מוגדר רווית ICP). אם ICP לא הגיע לרוויה עם ההייריכוז נגיף ghest, ממוצע ICP מן הכפילויות מקבילות שמש במקום (A / מוסקבה / 103/2015 איור 5D). דילולי הווירוס שייצרו 30% רווית ICP נבחרו דילול וירוס קלט לנטרול (לוח 3).

ניטרול שמטרתה יש וירוס קלט אחד נגד חמישה נסיובי, עם כפילויות כפולות על כל צלחת. הווירוס האסמכתא המופיע הוא A H3N2 / Stockholm / 63/2015. חמשת נסיובי הם A / HK F12 ביצה 4801/14 / 15, A / HK F02 MDCK 7295/14 / 15, A / דרום אפריקה R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / שוויצרי 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, ו- A / הולנדית 525/14 SIAT F23 / 15. תוצאות הנטרול הן באיור 6. 6d האיור מציג את התקדמות זיהום עם העלייה של דילול בסרום. האוכלוסייה החיובית מנורמלת על הציר האנכי מייצגת את היחס של ICPs מתגובת נסיובי המקבילה נגד ממוצע ICP של נגיף התייחסות 12. ICP רקע מפיקוח תא הנגוע היה מופחת במהלך הנורמליזציה. את titers נטרול נקבעו כמו reciprocals של דילולים antiserum המקביל ל -50% הפחתה ICP (לוח 4). אינטרפולציה לינארית שמשה כדי להעריך titers נופל בין שני דילולים בסרום סמוכים.

figure-results-1
איור 1: דוגמה של תוכנית ההתקנה היטב הצלחת ניסוי טיטרציה וירוס. וירוסי מבחן מוקצים בשורות נפרדות (א 'עד ח'). עמודות מיועדות דילולים ויראלי שונים (1 עד 12). שני טורים שימשו כפילויות עבור כל דילול ויראלי. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

p-together.within-page = "1"> figure-results-2
איור 2: שרטוטים של מערכת סריקה המדגם. (א) צלחת 96-היטב על מצבת ההדמיה של וסורק (מחדש מן אסמכתא 11 באישור BV Elsevier), ו- (ב) מידות של גבול עמדת L-צורה שמוצגת (א). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: תרשים שולחני של התוכנה "Reader Wellplate" quantitation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4: דוגמה של תוכנית ההתקנה של צלחת היטב בניסוי הניטרול. antiserum מוקצה לשתי עמודות עם כפילויות (1 עד 10). שורות מיועדות דילולי סרום שונים (א 'עד ח'). שליטת הווירוס לוקחת טור 11, עם שמונה כפילויות (A11 כדי H11). שליטת התא נמצאת טור 12, עם שמונה כפילויות (A12 כדי H12). סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5: תוצאות של ניסוי טיטרציה. (א) הגדרת היטב צלחת, (ב) תמונה סרוקה היטב צלחת, (ג) איורשל דילולים צבע בקידוד, ונרשמת, אוכלוסיית תאים הנגועים בנגיף, ו- (ד) אוכלוסיות תאים מנורמל הנגועים בנגיף נגד וירוס. ICP 30% שימש הסף. ברי השגיאה ב (ד) מציינים את סטיית התקן (SD) מן כפילויות המדגם (± 1 SD). ברים בקנה מידה (ב) ו- (ג) = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6
איור 6: תוצאות של ניסוי הניטרול. (א) הגדרה היטב הצלחת, (ב) סרק היטב צלחת תמונה, (ג) איור של אוכלוסיית תא והנרשמת, נגוע בוירוס, ו- (ד) אוכלוסיית תאים מנורמלת נגוע בנגיף נגד הדילול בסרום. השישי קלטרוס (VC) הוא A / שטוקהולם / 63/2015. 50% ICP שימש לחישוב titers. ברי השגיאה ב (ד) מציינים את סטיית התקן (SD) מן כפילויות המדגם (± 1 SD). ברים בקנה מידה (ב) ו- (ג) = 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

S1 משלים: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דילול אופייני
תאי MDCK תאי MDCK-SIAT1
2 ימים 1: 5 (1 + 4) 1:10 (1 + 9)
3 ימים 1:20 (1 + 19)
מספר טיפוסי של תאים לכל מ"ל
תאי MDCK תאי MDCK-SIAT1
2 ימים 2 x 10 5 1 x 10 5
3 ימים 1 x 10 5 5 x 10 4
1:10 (1 + 9)

טבלת 1: דילולים אופייניים על תת-תרבות של צלוחיות ומחוברות של תאי MDCK או MDCK-SIAT1.

מצב מצב מקצועי
סוג מסמך סרטים (עם מדריך עירוני סרט)
סוג חשיפה אוטומטית תמונה
Imסוג גיל 24 סיביות צבע
רזולוציה 1,200 dpi
פורמט תמונה נשמר רִיב

טבלה 2: התקנה טיפוסית של וסורק.

שׁוּרָה וִירוּס דילול מומלץ
א A / קמרון / 15V-3538/2016 1.0 x 10 -2
B A / ולדיווסטוק / 36/2015 1.0 x 10 -3
C A / מוסקבה / 103/2015 1.1 x 10 -1
D A / טומסק / 5/2015 5.9 x 10 -1
E A / מוסקבה / 101/2015 8.3 x 10 -1
F A / מוסקבה / 100/2015 1.4 x 10 -2
G A / מוסקבה / 133/2015 1.3 x 10 -2
H A / ברטיסלבה / 437/2015 1.3 x 10 -4

טבלה 3: דילולים ויראלי מחושב מתוך אוכלוסייה של 30% ICP.

טור נסיובי כייל מומלץ
1 - 2 A / HK4801 / 2014 110
3 - 4 A / HK7295 / 2014 213.3
A / דרום אפריקה / R2665 / 2015 2155.8
7 - 8 A / שוויץ / 9715293/2013 89.4
9 - 10 A / הולנד / 525/2014 78.6

לוח 4: titers ב 50% ICP של A / שטוקהולם / 63/2015 נגד נסיובי.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו תארנו assay MN מבוסס הדמיה לכמת את היחסים אנטיגני הנכונים בין וירוסים. לעומת מבחני פלאק-הפחתה אחרים, השיטה מדגישה מדידת ICP של באר כולו, הבטחת כיסוי מלא של האוכלוסייה התולעת. עצמאותה של הצטברות אבנית גם מרחיבה את היישום של assay כדי וירוסים שיכולים ליצור לוחות קטנים בלתי נראים בעיקר או שרק יכול לנהל זיהום תא בודד. לכן, assay היא מסוגלת לבחון יותר וירוסים ואת ההשפעות של מגוון רחב יותר של נוגדנים מ HI, וזה עוזר בצורה מקיפה יותר לשקף את הדמיון אנטיגני או הבדלים בין וירוסי 12. לדוגמא, כאשר carboxylate oseltamivir כלול, assay MN מושפע פחות NA התלוי מחייב, משקף את ההבדלים אנטיגני בצורה מדויקת יותר. במהלך הפיתוח של assay, נעשו מאמצים גדולים כדי לשפר את עקביות ניסוי, מהירות, וזיהוירגישות, כולל על ידי שליטת וירוסים קלט באמצעות טיטרציה ונרשמת, הדמית קצב העברת נתונים גבוהות עם סורק משטח אופקי, ויישום פלטפורמת עיבוד נתונים ידידותי למשתמש. התוצאות היו בדרך כלל בקנה אחד עם ואישר אלה של HI. יש לציין, כי התוצאות גם חשפו הבדלים אנטיגני בין הגירסות להיסחף אנטיגני של וירוסי סוג האחרונים ו- B חיסון, כמו גם שינויי אנטיגני נגרמים על ידי שינויים בתרבות שנבחרה או ספורדי, כגון החלפת G155E ב HA1 של מסוימים (H1N1) וירוסים pdm09 12.

הפרוטוקול מתאים לסוג הווירוס או תת-סוג עם מבחר של שורות תאים כי נתנו את הזיהום החזק, אשר משפר את אות ההדמיה. וריאציה ניסיוני הוחלקה עם העיצוב של כפילויות כי מאוזנת עם מספר נסיובי נבדק. חוסר ודאות יכולה גם לבוא איכות התמונה, אשר מושפעת בעיקר על ידי מכשיר ההדמיה. סורק הגון שטוח צבע יכול משמעותיficantly לשפר את הניגודיות בתמונה להפחית את הרעש. כמות וירוס קלט נטרול צריכה להיקבע באופן כמותי מראש מן טיטרציה המקביל ואילו וירוסים ועדיין לשמור על מצב דומה. במהלך נטרול, התגובה antiserum לזיהום הוא מנורמל נגד ההבדל בין וירוס הפניה (VC) ורמת רקע (CC). מדידות מדויקות של VC ו CC חיוניים ניסוי הניטרול. עוד כפילויות מומלצות (שמונה כפילויות ששמשו נציג התוצאות). לבסוף, הבנת התוכנה היא חיונית להצלחה של ניסוי. התוכנה נבדקה לאפיון וירוס שיגרתי של מרכז שפעת WHO, בבריטניה במשך יותר משנים. הוראות מפורטות להתמודדות עם מצבים שונים מסופק S1 משלים.

assay MN זו מתאימה עבור יישומים בהם דגימות לכסות שלוחהשדה גדול remely המבט אלא רק דורשים רזולוציית הדמיה מתונה. העלות הנמוכה התקנה פשוטה להפוך את המערכת זמינה למעבדות וירולוגיה ביותר. הווריאציה במדידות של המדגם הזהה הייתה פחות מ -3%, אשר בערך מגדיר הוודאות הציגה במהלך הסריקה 11. שחזור כזה הוא מספיק במחקרי virological רבים ניתן להפחית עוד יותר על ידי ממוצעי תמונות מסריקות מרובות.

לסיכום, המחקר הנוכחי מדגים assay MN חזקים שניתן להשתמש בהם באופן שגרתי במחקר אנטיגני ולתמוך נתונים HI בניתוחים מפורט של כרגע-מחזורי נגיפי שפעת, בעיקר עבור הבחירה הדו-שנתי של וירוסים להכללה החיסונים לשפעת האדם.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר מ. מטרוסוביץ' על אספקת קווי התאים האביים MDCK ו-MDCK-SIAT1 ול-Roche Pharmaceuticals על אספקת האוסלטמיביר קרבוקסילאט. אנו מעריכים גם את ד"ר אן וסטון על הצעות חשובות לגבי כתב היד. מחקר זה היה תלוי בשיתוף הפעולה המוערך של מרכזי השפעת הלאומיים של ארגון הבריאות העולמי ומרכזי ה-CC של ארגון הבריאות העולמי בתוך ה-GISRS של ארגון הבריאות העולמי, שסיפקו את נגיפי השפעת שבהם נעשה שימוש. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר הרפואי באמצעות תוכנית U117512723.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
VGMSigmaD6429, P0781500 מ"ל DMEM + 5 מ"ל עט/Strepb
PBS Aטבעי pH חוצץ פוספט מי מלח: NaCl 10  ז, KCl 0.25  g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g, ו-Dist. Water 1 L.
AvicellFMCRC-581F2.4 גרם ב-100 מ"ל מים מזוקקים מומסים על ידי ערבוב על מערבל מגנטי למשך שעה.
2x DMEMGibco 21935-028
TrypsinSigmaT1426
שכבת על (10 מ"ל/צלחת):5 מ"ל 2x DMEM, טריפסין 2  μ ריכוז סופי של גרם/מ"ל, אביסל 5  מ"ל
טריטון X- 100eSigma מאגר חדירות T8787: 0.2% ב-PBS A (v/v)
מאגר כביסה Tween 80SigmaP5188: 0.05% Tween 80 ב-PBS A (v/v)
סרום סוסיםPAA Labs LtdB15-021ELISA Buffer: 10% ב-PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80
Mouse MAb נגד שפעת מסוג ABioradMCA 4001st נוגדן: 1:1,000 ב-ELISA Buffer
Goat אנטי-עכבר IgG (H+L) HRP מצומדBiorad172-10112nd נוגדן: 1:1,000 ב-ELISA Buffer
True Blu peroxidase SubstrateKPL 50-78-02מצע: כחול אמיתי +0.03% H2O2g (1:1,000 של 30% תמיסה)
96-בארות לוחות מיקרוטיטר עם תחתית שטוחהCostar 3596
מכונת כביסה וסעפת 8 ערוציםSigmaM2656
Perfection Plate ScannerEpsonV750 Proניתן להוריד את תוכנת ההדמיה באופן חופשי מ-http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=הורדות.
סביבת תפעול תוכנה: חלון LabVIEWNational Instruments Corporationמבוסס על NI Vision Builderגרסה: LabVIEW2012 ומעלה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
  2. Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
  3. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  4. Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
  5. Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
  6. Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
  7. Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
  8. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
  9. Comley, J. High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
  12. Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro neutralization AssayInfluenza VirusVirus TitrationAntibody NeutralizationAntiviral ActivityFlatbed Scanner ImagingHigh throughput ImagingViral Antigenic StudiesVirus DilutionInfected Cell Population

Related Articles