מאמר שיטה

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54902

⸱

11 באפריל 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

במאמר זה

סיכום

לאחרונה פותחו מספר חיישני כוח מבוססי FRET, המאפשרים רזולוציה ספציפית לחלבון של כוח תוך-תאי. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש באחד מהחיישנים הללו, המיועד לקישור של החלבון הקומפלקס Nesprin-2G Nesprin-2G כדי למדוד את כוחות האקטומיוזין על קומפלקס ה-LINC הגרעיני.

תקציר

קומפלקס ה-LINC הועלה כמבנה הקריטי המתווך את העברת הכוחות המכניים מהשלד הציטולוגי לגרעין. Nesprin-2G הוא מרכיב מרכזי בקומפלקס LINC המחבר את השלד הציטולוגי של האקטין לחלבוני ממברנה (חלבוני תחום SUN) בחלל הפר-גרעיני. חלבוני הממברנה הללו מתחברים ללמינים בתוך הגרעין. לאחרונה, שוכפלה בדיקה של כוח העברת אנרגיה תהודה (FRET) של Förster למיני-Nesprin-2G (Nesprin-TS (חיישן מתח)) ושימשה למדידת מתח על פני Nesprin-2G בפיברובלסטים חיים של NIH3T3. מאמר זה מתאר את תהליך השימוש ב-Nesprin-TS למדידת כוחות מורכבים של LINC בפיברובלסטים NIH3T3. כדי לחלץ מידע FRET מ-Nesprin-TS, מוצג גם מתווה כיצד לערבב ספקטרלית תמונות ספקטרליות גולמיות לתעלות פלואורסצנטיות מקבלות ותורמות. באמצעות תוכנת קוד פתוח (ImageJ), תמונות מעובדות מראש והופכות לתמונות רציומטריות. לבסוף, מוצגים נתוני FRET של Nesprin-TS, יחד עם אסטרטגיות כיצד להשוות נתונים בין קבוצות ניסוי שונות.

מבוא

חיל-רגיש, חיישני סריג מקודדים גנטיים צמחו לאחרונה ככלי חשוב למדידת כוחות מבוסס מתיחה בתאים חיים, ומספקים תובנות איך מכני כוחות מוחלים על פני חלבוני 1, 2, 3, 4. באמצעות כלים אלה, חוקרים יכולים דימוי הלא פולשני כוחות תאיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופי פלורסנט קונבנציונליים. חיישנים אלה מורכבים-זוג סריג (פלורסנט תורם acceptor חלבונים, בתדירות הגבוהה ביותר תורם כחול acceptor הצהוב) המופרדים על ידי פפטיד אלסטי 3. בניגוד C- או N-terminal תיוג, חיישן זה מוכנס לתוך אתר פנימי של חלבון כדי למדוד את הכח המכאני ישודר החלבון, מתנהג כמו מד לחץ מולקולרי. גברת מתח מכאני על פני תוצאות החיישן בעל טווח מוגדל בין-p הסריגאוויר, דבר שגרם לפגיעה סריג 3. כתוצאה מכך, הסריג הוא ביחס הפכו כוח מתיחה.

חיישנים פלורסנט מבוסס אלו פותחו עבור חלבונים דבקים מוקדים (vinculin 3 ו תלין 4), חלבוני cytoskeletal (α-actinin 5), וחלבוני צומת תא-תא (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, ו PECAM 8). הנפוץ ביותר בשימוש היטב מאופיין ומקשר אלסטי ב חיישנים אלה נקרא TSmod והוא מורכב מרצף חוזר ונשנה של 40 חומצות אמינו, (GPGGA) 8, אשר נגזרו flagelliform חלבון משי עכביש. TSmod הוכח להתנהג כמו היענות ננו-אביב אלסטי ליניארי, עם סריג 1 עד 5 pN בכוח מתיחה 3. באורכים שונים של flagelliform יכולים לשמש כדי לשנות את r הדינמיתAnge של TSmod סריג כוח רגישות 9. בנוסף flagelliform, spectrin חוזרת 5 ו פפטיד כיסוי ראש villin (המכונה HP35) 4 שימשו כמו פפטידים אלסטי בין-זוגות סריג ב חיישנים כוח דומה 4. לבסוף, דו"ח אחרון הראה כי TSmod יכול לשמש גם כדי לזהות כוחות דחיסה 10.

אנחנו לאחרונה פיתחה חיישן כוח עבור והמקשר של-שלד התא Nucleo (LINC) חלבון מורכב Nesprin2G באמצעות TSmod מוכנס לתוך חלבון שפותחו בעבר קטועה Nesprin2G המכונה מיני-Nesprin2G (איור 2 ג), אשר מתנהג באופן דומה אנדוגניים Nesprin-2G 11. קומפלקס LINC מכיל חלבונים מרובים מפנים מבחוץ לחלק הפנימי של הגרעין, המקשר את שלד תא ציטופלסמית אל למינה הגרעיני. Nesprin-2G הוא חלבון מבני מחייב הוא אתcytoskeleton אקטין בציטופלסמה וכדי חלבונים SUN במרחב perinuclear. שימוש biosensor שלנו, הצלחנו להראות כי Nesprin-2G כפוף מתח actomyosin התלוי NIH3T3 פיברובלסטים 2. זו הייתה הפעם הראשונה בכח כי נמדד ישירות דרך חלבון במתחם LINC גרעיני, וזה עשוי להיות כלי חשוב להבין את התפקיד של כוח על הגרעין ב mechanobiology.

פרוטוקול להלן מספק מתודולוגיה מפורט של אופן השימוש בחיישן כוח Nesprin-2G, כולל את הביטוי של חיישן המתח Nesprin (Nesprin-TS) בתאי יונקים, כמו גם רכישת וניתוח של תמונות סריג של תאים המבטאים Nesprin- TS. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד בגלאי ספקטרלי, תיאור של איך למדוד פליטה רגישה סריג באמצעות unmixing רפאי הדמית סריג ratiometric מסופקת. תמונות ratiometric הפלט ניתן להשתמש כדי להפוך קואה יחסיתהשוואות כוח ntitative. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בביטוי של Nesprin-TS ב פיברובלסטים, זה ניתנת להתאמה בקלות לתאי יונקים אחרים, כולל שתי שורות תאים תאים ראשוניים. יתר על כן, פרוטוקול זה בכל קשור לרכישת תמונה וניתוח סריג ניתן להתאים בקלות חיישני כוח סריג מבוסס אחרים שפותחו עבור חלבונים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. השג Nesprin-2G חיישן דנ"א האחר פלסמיד דנ"א

  1. השג Nesprin-2G TS (חיישן המתח), Nesprin-2G HL (ללא ראש) מלאה, mTFP1, ונוס, ו TSmod ממקור מסחרי. הפץ כל פלסמידים DNA ולטהר אותם באמצעות זני חיידק סטנדרטיים, כגון-α DH5, כפי שתואר לעיל 12, 13.

2. תאי Transfect עם Nesprin-2G ו- DNA פלסמיד אחר

  1. לגדל תאי פיברובלסטים NIH 3T3 כדי מפגש 70-90% בצלחת תרבית תאי 6-היטב בתוך חממת תרבית תאים סטנדרטית עם טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) ו 2 CO (5%) תקנה. עבור מדיום צמיחת תאים, השתמש בינוני נשר Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום עגל עובר.
  2. במנדף תרבית תאים, להסיר את המדיום ולשטוף היטב עם כל כ 1 מ"ל של מדיום התא מופחת-סרום. הוספת 800 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום היטב כלומקום בתא 6-היטב החממה.
  3. פיפטה 700 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום לתוך צינור 1.5 מ"ל עם 35 μL של פתרון המוביל השומנים כדי ליצור את "lipomix". מערבבים ידי pipetting. סמן הצינור עם "ל"
  4. אסוף שישה 1.5 צינורות מ"ל ו לתייג אותם 1 עד 6. פיפטה 100 μL של המדיום הסלולרי מופחת-סרום לתוך צינור אחד.
    1. באמצעות ריכוז פלסמיד דנ"א משלב 1, פיפטה 2 מיקרוגרם של Nesprin 2G-TS לתוך צינורות 1 ו 2. פיפטה 2 מיקרוגרם של Nesprin-HL לתוך צינורות 3 ו 4. פיפטה 1 מיקרוגרם של mTFP לתוך צינור 5. פיפטה 1 מיקרוגרם של mVenus לתוך הצינור 6. אל תשתמש שוב טיפים פיפטה כאשר pipetting סוגים שונים של דנ"א.
  5. פיפטה 100 μL של lipomix מהצינור "L" לתוך צינור אחד שכותרתו (1-6) ומערבבים על ידי pipetting חזר. השתמש פיפטה נקייה עבור כל צינור. דגירה של 10-20 דקות.
  6. הוספת 200 μL מצינור כל שכותרתו באר בתא 6-היטב עם 70-90% ומחוברותתאים. סמן בראש כל טוב עם DNA המקביל הוסיף. מניח את חדר 6-היטב באינקובטור במשך 4-6 שעות.
  7. לשאוב בינונית ומוסיפים 1-2 מ"ל של המדיום הסלולרי מופחת-סרום כדי לשטוף. לשאוב את המדיום הסלולרי-סרום מופחת, להוסיף 2 מ"ל של טריפסין לכל היטב, ומניחים בצלחת 6-היטב החממה (5-15 דקות).
  8. בעוד תאים לנתק בחממה, זכוכית התחתונה מעיל 6 לצפייה מנות עם שכבה של פיברונקטין בריכוז של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​מומס מלוחים פוספט שנאגרו (PBS). אפשר את הכלים כדי מעיל השטח בשכונה תרבית תאים (כ 20 דק ').
  9. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM פעם התאים מנותקים.
  10. מעבירים את תכולת כל מהבאר אל צינור צנטריפוגה 15 מ"ל שכותרתו ומסובב ב 90 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה הרוטור מתנדנד. לשאוב supernatant מחדש להשעות כל גלולה תא 1000 μL של DMEM ידי ערבוב פיפטה.
  11. לשאוב את תערובת פיברונקטין מןמנות זכוכית פיפטה 1000 μL של כל השעית תא על צלחות הזכוכית.
  12. אחרי התאים ליישב לתחתית של מנות זכוכית (~ 15 דקות), להוסיף 1 מ"ל של DMEM + 10% FBS + 1% פן-סטרפ היטב כל מקום בחממה התא. אפשר התאים לצרף ולהביע חיישן לפחות 18-24 h.
    הערה: תאים הם transfected באמצעות ריאגנטים transfection השומנים מסחרי קטיוני (ראו טבלה של חומרים). לחלופין, שורות תאים יציבות ניתן לבחור באמצעות פלסמיד עם גן המקנה עמידות רעלן (פלסמידים pcDNA עבור Nesprin-TS ו -HL זמינים באתר מאגר DNA (ראה טבלה של חומרים) לספק תאים המבטאים התנגדות geneticin ). בנוסף, שיטות זיהום ויראלי (lentivirus, רטרו-וירוס, או אדנו) יכול להיות מנוצל כדי להביע את החיישן בתאים שקשה transfect.
  13. בנוסף Nesprin-TS, transfect תאים נוספים עם Nesprin HL אפס עבורמלא CE, כמתואר בשלבי 2.1-2.12; TSmod יכול לשמש גם כשלט אפס כוח צריך להפגין סריג דומה Nesprin-HL.
  14. תאים Transfect עם mTFP1 ו ונוס ליצור טביעות אצבעות ספקטרלי (ראה שלב 4).
    הערה: mTFP1 ו ונוס בדרך כלל לבטא ברמות גבוהות יותר מאשר Nesprin-TS, וככזה, כמויות נמוכות של DNA ייתכן שיהיה צורך טרנספקציה להשיג רמות ביטוי דומה.

3. בדוק יעילות transfection

  1. בערך 18-24 שעות לאחר השלמת transfection, להשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה כדי לבחון את היעילות של transfection ידי השוואת מספר התאים פלורסנט למספר הכולל של תאים לאור (בדרך כלל 5-30%).
    1. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד תדר עירור ליד 462 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס) ו מסנן פליטה מרוכז ליד 492 ננומטר (mTFP1) או 525 ננומטר (ונוס).
      הערה: לחלופין, מערכות סינון GFP תהיה ללכוד שילוב של mTFP1 ו veפליטת Nus ותאפשר את האישור של יעילות transfection.
  2. תאי תמונת חיה בתוך 48 שעות לאחר transfection.
    1. לחלופין, לתקן תאים paraformaldehyde 4% (ב PBS עם סידן ומגנזיום) עבור 5 דקות, חנות PBS, ולהציג לאחר 48 h 8.
      הערה: Beyond 48 h, איכות האות וכוח דועך. תיקון התאים משמר המדינה שלהם, כולל סריג לידי ביטוי 8; עם זאת, תאים צריכים להיות צלמו רק ב- PBS, כמו הרכבה בינונית עשויה להשפיע 14 סריג. תאים קבועים ניתן להשוות רק לתאים קבועים אחרים, כמו ייתכנו שינוי הביטוי.
      זהירות: Paraformaldehyde רעיל. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE).

4. לכידת ספקטרלי טביעות אצבעותיהם של mTFP1 ו ונוס fluorophores עבור ספקטרלי unmixing

  1. במנדף תרבית תאים, להחליף את המדיום הסלולרי עם mediu הדמיהמ '(HEPES שנאגר) השלים עם 10% בסרום שור עובר.
  2. מניחים את הכלים הצפייה באופן מבוקר טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) בשלב מיקרוסקופ confocal.
  3. מניח את צלחת הצצה מהזכוכית עם תאים-טרנספקציה mTFP1 מעל המטרה השמנה בהגדלה 60X עם צמצם מספרי של 1.4.
    הערה: שמן משמש על מיקרוסקופ סורק לייזר על המטרה 60X להידמות מקדם השבירה מקרוב של מצע זכוכית. השמן הוא מונח על גבי העדשה האובייקטיבית שבא במגע ישיר עם coverslip הזכוכית.
  4. אתר mTFP1 לבטא בתאים עם מקור עירור 458 ננומטר ו מסנן bandpass פליטה המרוכז ב 500 ננומטר.
  5. עם תא פלורסנט בתחום הראייה, לבחור את מצב זיהוי ספקטרלי ( "מצב למבדא" בתוכנה המשמשת כאן) ו ללכוד את התמונה ספקטרלי (איור 3-1); כל החדרים כוללים תדרים מעבר 458 ננומטר באמצעות 10 במרווחים ננומטר (איור 3-3). בחר fluoresc בהירבאזור אף אוזן גרון (ROI) על התא (רדיוס 20-פיקסל).
    הערה: צורת הספקטרלית של ROI mTFP1 להביע צריכה להישאר קבועה יחסית על פני התא. אם הצורה משתנית במידה ניכרת, מחדש ולהתאים את הליזר ולהשיג הגדרות כדי לשפר את יחס אות לרעש.
  6. מוסיפים את ההחזר על ההשקעה פלורסנט אומר, עוצמת מנורמל למסד הנתונים ספקטרלי על ידי לחיצה על "שמור ספקטרום למסד הנתונים."
  7. ייעל את כוח הליזר ולהשיג כזה כי מושגת יחס אות לרעש טוב. הגדרות תשתנינה עבור ציוד שונה. השימוש הלא-ניאון, תאים untransfected כהפניה רקע, להגדיל את הרווח ואת הכוח עד תאים בהירים, אך לא מעבר לטווח הדינמי של גלאי (נקודת הרוויה). תאי רקע לא צריכים קרינה לזיהוי לאחר החישוב ממוצע.
  8. חזור על התהליך עבור תאי ונוס-טרנספקציה עם החריגים הבאים:
    1. ודא כי תדירות העירור היא 515 ננומטר וכי מסנן bandpass הוא CEntered ליד 530 ננומטר כאשר איתור תאי-להביע ונוס.
    2. "מצב ספקטרלית," להשתמש בתדירות עירור של 515 ננומטר במקום 458 ננומטר.

5. לכידת תמונות צרופות

  1. לעבור את המצב הלכיד "ספקטרלי unmixing."
  2. מוסיפים את טביעות האצבעות ספקטרלי של ונוס mTFP1 לתוך ערוצי unmixing (איור 3, חץ-2).
  3. הגדר את הלייזר עירור בחזרה למקור ארגון 458 ננומטר.
  4. מניחים את צלחת לצפייה Nesprin-TS מעל המטרה שמן 60X.
  5. לאחר התמקדות תא פלורסנט עם ביטוי בהיר מספיק, להתאים את הכוח רווח לייזר כדי לייעל את יחס אות לרעש.
    הערה: מאז הסריג היעיל של Nesprin-TS הוא ליד 20%, התמונה ונוס הצרופה צריכה להיות דימר משמעותי יותר מתדמית mTFP1 הצרופה. לאחר הגדרת כוח ורווח מקובל נקבעה באופן איטרטיבי, פרמטרים אלה חייבים להישאר קבועים עבור כל סרן התמונותured.
  6. לכידת מינימום של 15-20 תמונות של תאי Nesprin-TS עם בהירות דומה יחסית ולהימנע הרוויה פיקסל מוגזמת (כל פיקסלים הרוויים מוסרים במהלך עיבוד תמונה).
  7. חזור על התהליך לכיד תמונה עם תאי Nesprin-HL באמצעות פרמטרי הדמיה זהים.

6. עיבוד תמונה וניתוח תמונה רציו

  1. שימוש בתוכנות קוד פתוח ImageJ (פיג'י) (http://fiji.sc/), תמונות בפורמט טבעיות פתוחות באמצעות קורא BioFormats.
  2. בתהליך קדם התמונות ולחשב את התמונות יחס באמצעות פרוטוקולים הוקמו בעבר 15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות בפרוטוקול לעיל, פלסמיד דנ"א נרכשה מהמאגר דנ"א להפוך לתאי חיידק. E. coli להביע הדנ"א חיישן נבחרו מתוך LB / צלחות אמפיצילין ו מוגבר במרק LB נוזלי. בעקבות ההגברה של הווקטורים, פלסמידים DNA היו מטוהרים לתוך חיץ טריס-EDTA באמצעות תקן, ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי. באמצעות ספקטרופוטומטר, DNA מטוהרים היה לכמת לתוך ריכוז רמת מיקרוגרם / מ"ל (איור 1A, ימים 1-2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה והדגמה של הדמיה תא חי של מתח מכני על פני Nesprin-2G, חלבון במתחם LINC גרעיני, היה שתוארו לעיל. לפני עבודה זו, טכניקות שונות, כגון שאיפת micropipette, מגנט חרוז cytometry, ליזר-אבלציה מיקרוסקופי, שמשו ליישם עומס על גרעין התא כדי למדוד תכונות החומר בתפזורת שלה 16, 17, 18. עם זאת, עד העבודה האחרונה שלנו, אין מחקרים הראו ישירות כי כוחות מתיחה מועברים ישירות על חלבון מורכב LI...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תומאס פ וקייט מילר Jeffress Memoria Trust (עד דצמבר) ו- NIH להעניק R35GM119617 (עד דצמבר). הדמית מיקרוסקופ confocal בוצעה לעבר Core אפיון ננו VCU (NCC) המתקן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Nesprin-TS DNAAddgene68127אחזר מ- https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNAAddgene68128אחזר מ- https://www.addgene.org/68128/
mTFP1DNA Addgene54613אחזר מ- https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNAAddgene27793אחזר מ- https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNAAddgene26021אחזר מ https://www.addgene.org/26021/
תאים מוכשריםBiolineBIO-85026
Liquid LB MediaThermoFisher10855001https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
צלחות תרבית חיידקים מוצקותLB Sigma-AldrichL5667http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US
AmpicillinSigmaA9518
ספקטרופוטומטרBiorad273 BR 07335SmartSpec Plus
קוורץ קובטBiorad1702504Cuvette לערכת בידוד DNA SmartSpec Plus
Macherey-Nagel740412.5NucleoBond Xtra Midi Plus
צלחת תרבית תאים 6 בארותFalcon-Corning353046Multiwell צלחת תרבית פוליסטרן 6
בארות מדיום הנשר השונה של דולבקו, (DMEM) מדיה תאיתGibco11995-065DMEM(1x)
BovineSerum Life Technologies16170-078
מדיה מופחתת של תאי סרוםGibco31985-070מדיום סרום מופחת, "optimem"
ליפיד תמיסת נשאinvitrogen11668-019מגיב שומנים, "ליפופקטמין 2000"
1.5 מ"ל צינור פלסטיק סטרילידנווילc2170
טריפסיןגיבקו25200-0560.25% טריפסין-EDTA (1x)
זכוכית תחתון מיקרוסקופ צפייה צלחתבמבחנה מדעיתD35-20-1.5-N35 מ"מ צלחת עם 20 מ"מ באר תחתונה #1.5
זכוכית פיברונקטיןThermoFisher33016015חלבון אנושי פיברונקטין פלזמה
פוספט (PBS)Gibco14190-144Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 מ"ל צינור צנטריפוגה סטריליGreiner bio-one188261
צנטריפוגת רוטור מתנדנדת תרמו אלקטרוןCentra CL2רוטור מתנדנד תרמו אלקטרון 236
מכסה מנוע לבטיחות ביולוגית תרבית תאיםForma Scientific1284
חממת תרבית תאים מבוקרת אקליםThermoFisher3596
מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED רחב שדה הפוךטכנולוגיות חייםEVOS FL
Clear HEPES מדיה הדמיה חוצצתבדיקות מולקולריות
Fetal BovineSerum Life Technologies10437-028
בקרת טמפרטורה קונפוקלית הפוכה עם מקורות לייזר 458 ו-515 ננומטר צייס  LSM 710-w/גלאי
Outgrowth MediaNewengland BiolabsB9020s
NIH 3T3 פיברובלסטיםATCCCRL-1658
A14291DJMETA ספקטרלי

מקורות

  1. Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
  2. Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
  3. Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  4. Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  5. Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
  6. Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  7. Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
  8. Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
  9. Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  10. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
  11. Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
  12. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  13. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247(2007).
  14. Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
  15. Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
  16. Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
  17. Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
  18. Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
  19. Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
  20. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
  21. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  22. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FRETNesprin 2GSpectral UnmixingImageJNIH 3T3

מאמרים קשורים