הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות

15.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54914

⸱

11 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

במאמר זה

סיכום

ההערכה שלאחר המוות של אוטם שריר הלב (MI) במכרסמים מבוססת על כימות האוטם בקטעי לב מוכתמים. אנו מתארים שיטה מדויקת לכימות גודל האוטם באמצעות דגימה שיטתית של לבבות חולדות שנקטפו מהבסיס לקודקוד וניתוחי תמונה של חתכים היסטולוגיים מוכתמים בטריכרום.

תקציר

אוטם שריר הלב מוגדר כמוות קרדיומיוציטים עקב איסכמיה ממושכת; תגובה דלקתית והיווצרות צלקת (פיברוזיס) עוקבות אחר הפגיעה האיסכמית. לאחר השלב האקוטי הראשוני, שיפוץ כרוני של החדר השמאלי (LV) משנה את מבנה ותפקוד הלב. קשירה כלילית קבועה בבעלי חיים קטנים שימשה באופן נרחב כמודל ייחוס למודל כרוני של MI. דילול הדופן האוטם מתפתח בהדרגה לפיברוזיס טרנסמורלי. הערכה היסטולוגית של גודל האוטם מבוצעת בדרך כלל; עם זאת, חסרה סטנדרטיזציה של שיטות הכימות ואכן, היבטים מתודולוגיים חשובים, כגון מספר הקטעים שנותחו ושיטות הדגימה והכמות, אינם מתוארים בדרך כלל ולכן מונעים השוואה בין חקירות. לעתים קרובות מדי, כימות מתבצע על קטע בודד המתקבל ברמת השרירים הפפילריים. מכיוון שאסטרטגיות חדשות שמטרתן להפחית את התרחבות האוטם ועיצוב מחדש נמצאות בבדיקה, יש צורך חשוב בסטנדרטיזציה של פרוטוקולי דגימת לב מדויקים. אנו מתארים שיטה מדויקת לכימות גודל האוטם באמצעות דגימה שיטתית של לב חולדה שנקטף וניתוחי תמונה של חתכים היסטולוגיים מוכתמים טריכרומטיים המתקבלים מהבסיס לקודקוד. אנו מספקים גם ראיות לכך שחישוב מדד ההתפשטות (EI) איפשר הערכת גודל אוטם, תוך התחשבות בשינויים של החדר השמאלי לאורך השיפוץ.

מבוא

אוטם שריר הלב (MI) הוא הגורם המוביל למוות ונכות בעולם. מחלת לב כלילית היא הגורם העיקרי; MI נובע איסכמיה רצוף לאירועים כליליים כגון חסימה. כאשר רה-פרפוזיה לא מבוצע בתוך 6 שעות, איסכמיה הראשון גורם נמק שריר הלב בלתי הפיך. בחולים, האפיון של MI מסתמך על כלי אבחון שונים, לרבות סימנים קליניים, electrocardiography, הערכת רמות הפלזמה של סמנים ביולוגיים, אקו, הדמית MRI, היסטולוגית מנתח 1. אקוטי וכרוני MI מסווגים לשני שלבים שונים של פגיעה, בהתאם לעיתוי של יחסי נמק שריר הלב אל זמן של חסימה כלילית. בשלב החריף, המתרחשים במהלך 7 הימים הראשונים, מזוהה עם הפסד של cardiomyocytes, דלקת נרחבת, ועל הגיוס של פיברובלסטים. השלב תת-חריפים, מאופיינת הריפוי של רקמת לב ואת היווצרות צלקת, מתרחשבין 1 ל -4 - 6 שבועות. הרחבת האוטם, דליל קיר החדר, ואת התרחבות החדר לאפיין בשלב הכרוני. שיפוץ נרחב של החדר השמאלי תוצאות בהדרגה אי ספיקת לב חמורה 2.

MI המושרה על ידי קשירת העורק השמאלי הקדמי היורד קבע (LAD) מייצג את המודל מכרסם רמת אוטם לבבי כרוני. מחק ליגטורה כלילית החסימה כלילית. גודלו של האוטם תלוי באתר של המיתר. אפיון של פגיעת איסכמית שריר לב במודל מכרסם מבוצע באופן קלסי באמצעות רמות פלזמת סמן ביולוגיות, כגון טרופונין I ו- T 3, אקו, MRI, היסטולוגיה 4,5. רמות ביומרקר מתואמות עם היקף הרג cardiomyocyte. אקו מעריך את ירידת הערך השמאלית הפונקציה חדרית הנובע הפרעות תנועת קיר אזוריות. בנוסף, טכניקות הדמיה לא פולשנית, כגון MRI או ברזולוציה גבוההאקו, לאפשר ההערכה של הירידה בתנועת קיר, ההיקף באזור הצלקת עם זלוף מופחת שריר לב קיימא, ואת דליל הקיר. ממדים LV להתיר הערכה מדויקת של גודל האוטם. לבסוף, כימות של שריר לב קיימא והמת יכולה להתבצע לאחר מוות באמצעות כתמים ספציפיים סעיפים היסטולוגית של לבבות שנקטפו ומאפשרת אימות של גודל האוטם (IS). תכונה חשובה נוספת היא ההערכה של מדד ההתרחבות האוטמת (EI) 6. EI קשורה אוטם transmural והתחלות בתוך 3 הימים הראשונים. EI מאופיין הפחתה הדרגתית עובי דופן, גידול בגודל חלל LV, ושינויים סוגרים בכושר LV.

על מנת להעריך את היעילות הטיפולית של טיפולים חדשניים - בפרט, אסטרטגיות המשובים מבוססים על תאים, מטריצות, והערכת משלוח-מדויק גן של MI במכרסמים היא בעלת חשיבות עליונה.כאשר נמדדו על חתך יחיד שהושג ברמת שריר פפילרי, הגודל הוא עלול להיות מוטה בשל ההשתנות הגדולה שמקיים בפיתוח האוטם הבא קשירת LAD; ייתכן אוטם איפקס אז וטשטש. חשוב לציין, יותר מתודולוגיות מדויקת לגודל נקבע MI תוארה עבור עכברים 7-9 או חולדות 10. אף על פי כן, IS אינו מספיק כדי לכמת LV שיפוץ במדויק או הפחתות מושרות טיפולי (או סיכולים) של השיפוץ. ואכן, היא מתבטאת בדרך כלל כאחוז נפח LV הכולל הוערך על חתכי רוחב של הלב. אמנם שיטה זו תקפה עבור אוטם לבבי חריף, הדילול של קיר LV המתרחשים במהלך השיפוץ נשאר תחת הערכת 11,12. כימות morphometric מלאות של גודל אוטם ושינויים מבניים צריכות לכמת מספר פרמטרים, כגון אורכי endocardial ו epicardial ובקטרים, כמו גם אוטם ואזורים בריאים. אנו מתארים appr מתודולוגייםאוח כדי להעריך נכון MI שיפוץ במודל חולדה כרונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החיות קיבלו טיפול אנושי בהתאם לאמנה האירופית על טיפול בבעלי חיים. הליכים כירורגיים בוצעו בהתאם לחוק צער בעלי חיים השוויצרי לאחר קבלת אישור של משרד וטרינר ממשלתי, פריבורג, שאושר על ידי משרד וטרינרית הפדרלי השוויצרי, שוויץ.

קציר לב 1.

הערה: כל התערבות כירורגית בוצעו תחת הרדמה isoflurane. נעשו מאמצים להקטין סבל לבעלי חיים. בפרט, כל החיות קיבלו הזרקה תת עורית של 0.1 מ"ג /-הרדמה מראש עצירות ק"ג. הפרוטוקול כירורגית עבור inducting אוטם שריר לב תואר בעבר במקום אחר 13.

  1. בצע sternotomy על חית myocardially אוטמת בהרדמה (חיה מחוברת לצינורות, 2.5% isoflurane, הרדמה תקינה אושר על ידי רפלקס קמצוץ כפה).
    1. פתח את החיה על ידי חיתוך העור ולאחר מכן את השריריםעם מספריים כירורגיות. חותכים את הצלעות על ימין ועל שמאל, ולאחר מכן הסר את החזה.
    2. הסר את ההידבקויות הנותרות לאחר הניתוח הקודם (קשירת LAD). חותכים את אבי העורקים ולהסיר את הלב. שים את רקמות 1 M KCl (PBS), ולאחר מכן לשטוף אותו עם PBS.

2. רקמות הכנה

  1. שים לב אוטם אורכי מטריקס לב עכברוש אקריליק. שמור את זה ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  2. חותכים את הלב ישירות במטריצה ​​באמצעות סכין גילוח עם משוכל. ודא כל פרוסה הוא בעובי 2 מ"מ. חותך כ 5 - 7 שקופיות עבור כל לב (בהתבסס על רמת השיפוץ); זה נקרא דגימה שיטתית.
  3. בשלב זה, ביצוע כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium מכתים (TTC) הוא אופציונלי (לשמור על הכיוון של base-to-איפקס פרוסות הלב).
    1. מדגירים TTC 1% ב PBS במשך 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. דגירה זה paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות עד 1 שעה. שים את הסעיפים between שני לוחות זכוכית עם מפרידי 2 מ"מימ ומצלמים עם מיקרוסקופ stereological מצמיד עם מצלמה בהגדלה 15X.
      זְהִירוּת! Paraformaldehyde רעיל.
  4. הקפאת שקופיות (אפשרות st 1)
    1. שים כל שקופית בתוך תבנית פלסטיק (10 x 10 x 5 מ"מ) עם הרכבה בינונית עבור cryotomy (הטמפרטורה חיתוך אופטימלי, אוקטובר), לשמור על האוריינטציה (למקם את הצד איפקס מונחה של הסעיף למטה בחלק התחתון של עובש). להקפיא את אובניים עם אדי 2-methylbutane תחת חנקן נוזל קירור במשך 10 - 15 דקות. לבסוף, לאחסן את הרקמה ב -80 ° C.
  5. Paraffinization (2 אפשרות nd)
    1. מניח כל שקופית הטבעת קלטות (לשמור על האורינטציה על ידי נחת צד אורינטציה-איפקס של הסעיף למטה בחלק התחתון של הקלטת) ולאחר מכן ב 4% PFA למשך 24 שעות. שים את זה בתוך לילה מכונה מעבד רקמות.
      1. דגירה זה 70% אתנול עבור שעה 2. דגירה זה ethanol 95% עבור 2 שעות. דגירה זה 100% אתנול עבור 3 שעות. דגירה זה xylol עבור 4 שעות. דגירה זה פרפין (מותכת ב 60 ° C בתנור) במשך 5 שעות. לבסוף, לעשות בלוקים על ידי הטבעת כל שקופית לב פרפין.

3. מסון-גולדנר Trichrome מכתים

  1. הפוך קטעי רקמה מבלוקים פרפין עם microtome ידנית (עובי: מיקרומטר 5) או מבלוקים אוקטובר עם cryostat מוגדר -18 ° C (עובי: מיקרומטר 7).
  2. כתם שקופיות אחד מכל חלק לב לכל חולדה (3 - 4 חלקים משוכל לכל שקופית) עם מסון-גולדנר trichrome מכתים (ראה נספח).
    הערה: התחל שלב זה עבור חלקי פרפין.
    1. ממיסים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור. מתחת למכסה מנוע קטר, deparaffinize אותם xylol פעמים במשך 10 דקות כל אחד. רעננותם אותם אתנול 100%, 95% אתנול, 70% אתנול, ומים מזוקקים במשך 3 דקות כל אחד.
      הערה: התחל שלב זה עבור cryosectionים.
    2. תקן אותם לילה פתרון Bouin. לאחר מכן, לשטוף אותם במים זורמים מהברז במשך 10 - 15 דקות. יש לשטוף אותם במים מזוקקים. דגירה אותם hematoxylin של מאייר במשך 3 דקות.
    3. הסר את השקופיות ולהשאיר אותם במים מזוקקים למשך 5 דקות. לאחר מכן, דגירה אותם בחומצה Fuchsin-Ponceau למשך 5 דקות. יש לשטוף אותם 1% חומצה אצטית 1 דקות.
    4. לאחר מכן, דגירה אותם בחומצה phosphomolybdic אורנג G דקות 1. יש לשטוף אותם 1% חומצה אצטית דקות 1, דגירה אותם לצבוע בצבע ירוק בהיר במשך 10 דקות, ולשטוף אותם בחומצת 1% אצטית דקות 1.
    5. מייבש אותם אתנול 70% (30 שניות), 95% אתנול (30 שניות), ו -100 אתנול% (5 דקות). לשים טיפה אחת של הרכבה בינונית שרף על סעיפי רקמות, לכסות אותם עם coverslips, ולתת להם להתייבש.

4. ניתוח גודל האוטם

  1. סריקתתמונה אחד מכל להחליק על (בהגדלה 15X) סטראו יחד עם המצלמה. לצלם שליט עם אותה הגדרהים.
  2. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד את עובי הצלקת באמצע האוטם, עובי מחצה, חדר השמאלי באזור החלל (LV), באזור האוטם, ואזור רקמת LV משתמש.
    1. הגדר את קנה המידה עם התמונה השלטת (איור 1 א).
      1. הקישו על מדידות ולאחר מכן בחר Set המרה גורם. צייר קו בסרגל הכיול. קליק ימני על התמונה ולחץ על כיול הסוף. הערת הערך הבר, ולאחר מכן לחץ על אישור.
    2. בחר את LV מתמונת הלב המוכתם (האיור 1B). השתמש בכלי סגמנטים רבים. בחר את הנקודה-ידי נקודות LV, קליק ימני ואז העתק / הדבק בכל מקום.
    3. מדוד את עובי הצלקת מחצה באמצעות כלי מדידה למגזר אחד (איור 1 ג ).
    4. זיהוי אוטומטי של החלל, אוטם LV, ואזורי LV שימוש באפשרות מדידת השטח האוטומטית במצב RGB (1D איור).
      1. לחץ על הכלי. הפעל רק גבולות רציף במצב RGB. לבסוף, לחץ בתוך השטח של עניין לזהות אותו. במידת הצורך, להשתמש בכלי דיוק.
  3. חשב את גודל האוטם כיחס באזור האוטם לאזור LV.
  4. חישוב המדד הרחבה כדלקמן: [אזור חלל LV / כל אזור LV] / [עובי אוטם / עובי מחצה], עם אזור LV כולו כולל הוא את חלל LV ואזורי רקמות LV.
  5. לבסוף, חשב "ממוצע" עבור כל לב כדלקמן: [ממוצע של מדד הרחבה מן השקופיות האוטמות] [מספר השקופיות אוטמות / סה"כ שקופיות] *.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שישה שבועות קשירה שלאחר LAD, לבבות נבצרו חולדות לואיס. 2 מ"מ סעיפי רקמות התקבלו מן הקודקוד לבסיס. הליך מכתים TTC בוצע על מנת להמחיש את האזור האוטם, המופיע בלבן, ואת שריר לב הבריא, המופיע באדום (איור 2). בהתאם לאתר של קשירת LAD, גודל האוטם משתנה. עבור MI גדול, אוטמים transmural נצפו מן הקודקוד לבסיס (איור 2 א). קטן אוטמים הציג רקמה לבנה אוטם גלויה מן הקודקוד אל אמצע הקטע של הלב (איור 2 ב). לקבל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

רקמת פיברוטית ניתן להעריך במדויק במודל חולדה כרוני MI באמצעות דגימה שיטתית של לב שנקטף ותמונת מנתח סעיפים היסטולוגית מוכתמת טריים-כרומטית המתקבלים בסיס לקודקוד. שני צעדים חשובים במיוחד עבור יישום פרוטוקול מוצלח. ראשית, השימוש KCl לקציר הלב מאפשר שריר הלב להישמר במצב רגוע. שלב זה חשוב להשוואות של ממדים אוטמים מלבבות שונות. שנית, קיבעון הלילה של הסעיף בתמיסת Bouin הוא ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית השוויצרית [SNF 310030-149986 ל-MNG], אוניברסיטת פריבורג ובית החולים פריבורג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מטריצת לב חולדה אקרילית 2 מ"מ72-5015הרווארד Appartus
Inspira מאוורר מתקדם מבוקר נפחהרווארד557058
צנתר אינסיט 14 GBD381267
O.C.TBDHA361603EVWR
TTCT8877-10Gסיגמא אולדריץ'
מאייר המטוקסיליןMHS32-1Lסיגמא חומצה אולדריץ
פוקסין
CI 42685		F8129-50Gסיגמא אולדריץ'
פונסו קסילידין
CI 16150		P2395-25Gסיגמא אולדריץ'
תפוז G
CI 16230		O3756-100Gסיגמא אולדריץ'
ירוק בהיר
CI 42095		L5382-25Gסיגמא אולדריץ'
KClP9333-500Gסיגמא אולדריץ'
קסילול10315083HoneyWell
אתנול מוחלט10303990HoneyWell
2-מתילבוטןM32631-1Lסיגמא אולדריץ'
SM2800קלטת הטבעה של Nikon
Formaldehyde99340Reactolab
K113.1קארל רוט
ברסופט תוכנתBersoft.comתוכנה מורשית
מכשיר ' מיקרוסקופ סטריאוגי מדידת תמונה

מקורות

  1. Amsterdam, E. A., et al. AHA/ACC Guideline for the Management of Patients with Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 64, e139-e228 (2014).
  2. Konstam, M. A., Kramer, D. G., Patel, A. R., Maron, M. S., Udelson, J. E. Left ventricular remodeling in heart failure: current concepts in clinical significance and assessment. JACC Cardiovasc Imaging. 4, 98-108 (2011).
  3. Frobert, A., et al. Prognostic Value of Troponin I for Infarct Size to Improve Preclinical Myocardial Infarction Small Animal Models. Front Physiol. 6, 353(2015).
  4. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17, 268-272 (2012).
  5. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, 2996-3006 (2014).
  6. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117, 1388-1396 (2008).
  7. Valente, M., et al. Optimized heart sampling and systematic evaluation of cardiac therapies inmouse models of ischemic injury: Assessment of cardiacremodeling and semi-automated quantification of myocardial infarctsize. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 359-391 (2015).
  8. Csonka, C., et al. Measurement of myocardial infarct size in preclinical studies. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 163-170 (2010).
  9. Zornoff, L. A., Paiva, S. A., Minicucci, M. F., Spadaro, J. Experimental myocardium infarction in rats: Analysis of the model. Arq. Bras Cardiol. 93, 434-440 (2009).
  10. Lichtenauer, M., et al. Myocardial infarct size measurement using geometric angle calculation. Eur J Clin Invest. 44, 160-167 (2014).
  11. Lutgens, E., et al. Chronic myocardial infarction in the mouse: cardiac structural and functional changes. Cardiovasc Res. 41, 586-593 (1999).
  12. Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, L., Giraud, M. N. Cell-based therapy for heart failure in rat: double thoracotomy for myocardial infarction and epicardial implantation of cells and biomatrix. J Vis Exp. , e51390(2014).
  13. Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. J Appl Physiol (1985). 102, 2104-2111 (2007).
  14. Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101, 593-600 (1981).
  15. Weisman, H. F., Bush, D. E., Mannisi, J. A., Weisfeldt, M. L., Healy, B. Cellular mechanisms of myocardial infarct expansion. Circulation. 78, 186-201 (1988).
  16. Mannisi, J. A., Weisman, H. F., Bush, D. E., Dudeck, P., Healy, B. Steroid administration after myocardial infarction promotes early infarct expansion. A study in the rat. J Clin Invest. 79, 1431-1439 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסתלקות שריר הלבכימות גודל השחורדגימה שיטתית של הלבצביעת טריכרוםניתוח תמונהחישוב מדד התרחבותעיצוב מחדש של החדר השמאלימודל לב של חולדהחיתוך היסטולוגיצביעת TTC
כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.