מאמר שיטה

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

13.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54972

⸱

16 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

במאמר זה

סיכום

לשיטות הקיימות לשינוי צמחים יש ישימות מוגבלת. הטכנולוגיה החדשנית שמקורה בפפטיד המוצעת כאן מבטיחה הן פשטות והן יעילות בהחדרת חלבון או גנים אקסוגניים לתאים התוך-תאיים הרצויים של צמחים שלמים.

תקציר

היכולת להכניס חלבונים אקסוגניים ולבטא (או לווסת) גנים ספציפיים בצמחים מספקת כלי רב עוצמה למחקר בסיסי כמו גם ליישומים חדשים בתחום הביוטכנולוגיה של הצמח. לשיטות ברות קיימא הקיימות כיום להעברת חלבונים או גנים לתאי צמחים, כלומר אגרובקטריום והפצצת מיקרו-קליעים, יש חסרונות של תדירות טרנספורמציה נמוכה, טווח מארח מוגבל או עלות גבוהה של ציוד ומיקרו-נשאים. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה פשוטה ורב-תכליתית, המשתמשת בפפטידים שתוכננו באופן רציונלי כסוכני העברה למגוון מטענים מבוססי חומצות גרעין וחלבונים לצמחים. פפטידים נבחרים ככלים לפיתוח המערכת בשל יכולתם להתכלות, גודלם המופחת, תכונותיהם המגוונות והניתנות לכוונון וכן היכולת להשיג גישה תוך-תאית/אורגנית. מתוארים ההכנה, האפיון והיישום של ניסוחים מותאמים לכל סוג של מגוון רחב של מטענים שנמסרו (DNA פלסמיד, DNA או RNA דו-גדילי וחלבון). נדונים גם שלבים קריטיים בפרוטוקול, שינויים אפשריים ומגבלות קיימות של השיטה.

מבוא

הנדסה גנטית של צמחים משמשת באופן קונבנציונלי להעברת תכונות מועילות לצמחים. בשנים האחרונות יושמה טכנולוגיה זו להמרת צמחים למפעלים ביולוגיים לייצור חלבונים בעלי חשיבות פרמצבטית ובעלי ערך מסחרי, שרבים מהם אינם ניתנים לסינתזה כימית והם יקרים מאוד לייצור באמצעות מערכות בעלי חיים או מיקרוביאליות1. על ידי הכנסת גנים חדשים, ניתן לתמרן את חילוף החומרים של הצמח עצמו לייצור תרופות ביולוגיות שונות כמו נוגדנים, אנזימים מטבוליים, הורמונים, אנטיגנים או חיסון2.

טכנולוגיות העברת גנים מבוססות לצמחים הן אספקה בתיווך אגרובקטריום 3, הפצצה במיקרו-קליעים מצופים DNA (ביוליסטיקה)4, ואלקטרופורציה5 או פוליאתילן גליקול6 טיפול בפרוטופלסטים. טכניקות הדורשות פרוטופלסטים נמנעות בדרך כלל מכיוון שהן גוזלות זמן, מסורבלות ומניבות תוצאות לא עקביות7. כתוצאה מכך, כמעט כל עבודות שינוי הצמח כיום משתמשות באגרובקטריום או במיקרו-קליעים להעברת גנים. שיטת Agrobacterium נמצאת בשימוש נרחב יותר אך אינה ישימה למיני צמחים רבים בעלי חשיבות כלכלית. בינתיים, הפצצת מיקרו-קליעים היא מגוונת יותר בשל מגוון רחב של צמחים רגישים, אך דורשת ציוד מיוחד ולעתים קרובות גורמת לנזק חמור לרקמות. יתר על כן, שיטות אלה כוללות מנגנון אספקה אקראי (ביוליסטיקה) או מורכב (אגרובקטריום) ויש להן שיעורי טרנספורמציה משתנים8. לפיכך, נדרשת טכנולוגיה חדשה לשינוי צמחים שהיא פשוטה אך יעילה, וישימה לסוגי צמחים שונים.

נכון לעכשיו, צמחים נתונים לשינוי גנטי בעיקר על ידי אספקת DNA אקסוגני המקודד תכונה רצויה, ולא על ידי אספקה ישירה של חלבון מטרה. היציבות הגבוהה יותר של DNA על פני חלבונים היא יתרון עיקרי; עם זאת, בעיות פוטנציאליות הקשורות להעברת DNA כוללות החדרה אקראית של DNA אקסוגני לגנום הצמח והעברה לא מכוונת של גנים עמידים לאנטיביוטיקה לחיידקים פתוגניים באמצעות העברת גנים אופקית9. למטרות עריכת גנום, היכולת לערוך גנומים של צמחים מבלי להכניס DNA זר לתאים עשויה לעקוף חששות רגולטוריים הקשורים לצמחים מהונדסים גנטית. לפיכך, אסטרטגיה חלופית נטולת DNA לשינוי צמחים על ידי אספקה ישירה של חלבון תוכל לספק את הצרכים הללו.

כאן אנו מציגים מערכת מבוססת פפטיד, שפותחה במקור עבור ריפוי גנטי אנושי10-14, לאספקה ממוקדת של גנים או חלבונים אקסוגניים בצמחים שלמים. פפטידים מסוגלים להגן על ה-DNA מפני פירוק נוקלאז ויכולים לתווך העברת גנים בין תאים כמו גם ממברנות אורגניות15-17. יש להם גם תכונות מגוונות וניתנות לכוונון מלבד היותם לא ציטוטוקסיים18-20. חשוב מכך, עם השימוש בפפטידים, ניתן למקד גנים במדויק לאברונים תוך-תאיים כגון המיטוכונדריה21 או פלסטידים (כלורופלסטים)22 לביטוי - משימה שאינה ניתנת להשגה על ידי טרנספורמציה ביוליסטית או בתיווך אגרובקטריום. בהתאם לסוג המטען, ניתן לנצל את טכנולוגיית שינוי הצמח החדשה הזו כדי לספק חלבונים23 ולבטא (פלסמיד21,24 או DNA דו-גדילי25) או לווסת למטה (RNA דו-גדילי26) גנים ספציפיים בתוך הצמח, בכל החלל הציטוזולי שלו24-26 או בתוך תא אורגנלרי ספציפי21. פפטידי הנשא המתוכננים מורכבים מתחום קטיוני בצורת פוליליזין (K8) או פוליליזין-קו-היסטידין (KH)9 לקשירה ו/או עיבוי של מטענים בעלי מטען שלילי, המצומד לרצפי חדירת תאים (פפטיד BP100) או מעבר מיטוכונדריה (פפטיד Cytcox).

פרוטוקול

1. הכנת פורמולציות מבוסס פפטיד

  1. הכינו פתרונות המניות של כל פפטיד כדלקמן: (KH) 9 -BP100 (1 מ"ג / מ"ל או 800 ננומטר), Cytcox- (KH) 9 (1 מ"ג / מ"ל), BP100 (1 מ"ג / מ"ל) ו (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר). לשקול את הכמות הנדרשת של כל פפטיד צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ולהוסיף מים ultrapure autoclaved לפזר את הפפטיד. מערבבים היטב על ידי pipetting חוזר על עצמו עד פתרון ברור מתקבל.
  2. להגביר ולטהר את ה- DNA פלסמיד (pDNA), פעמיים גדילי דנ"א (dsDNA) ו- RNA פעמיים תקועים (dsRNA) על פי מתודולוגיות מולקולרי רגיל. ב 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge, להפוך פתרונות מניות עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​(pDNA ו dsDNA) או 400 ננומטר (dsRNA).
  3. הכן את פתרון חלבון מניות עם ריכוז של 7 מיקרומטר, על ידי המסת 1 מ"ג של חלבון (למשל., Dehydrogenase אלכוהול, ADH) אבקה ב 1 מיליליטר של תמיסת סודיום קרבונט (0.1 M, pH 9). לייבל החלבון עם fבדיקות luorescent כגון rhodamine B (RHB) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לאפשר להדמיה מיקרוסקופית של החלבון אל תאים.
  4. מערבבים את המרכיבים השונים בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    1. על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד הציטופלסמה, להוסיף 6.4 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ"ג / מ"ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ"ג / מ"ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 773.6 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי גרעינית (P35S-RLuc-TNOS, טבלה 1).
    2. על ניסוחים פפטיד-pDNA מיקוד המיטוכונדריה, להוסיף 6.6 μl של Cytcox- (KH) 9 (1 מ"ג / מ"ל) עד 20 μl של pDNA (1 מ"ג / מ"ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 ° C ולאחר מכן להוסיף 2.4 μl של BP100 (1 מ"ג / מ"ל). אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 256; צלזיוס במשך 15 דקות אחרות. להוסיף 771 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl. השתמש מבנה pDNA המיועד ביטוי המיטוכונדריה (pDONR-COX2: rluc, טבלה 1).
    3. על ניסוחים פפטיד-dsDNA, להוסיף 5.1 μl של (KH) 9 -BP100 (1 מ"ג / מ"ל) עד 8 μl של dsDNA (1 מ"ג / מ"ל) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 786.9 μl מים ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl.
    4. על ניסוחים פפטיד-dsRNA, להוסיף 50 μl של (KH) 9 -BP100 (800 ננומטר) 50 μl של dsRNA (400 ננומטר) ומערבבים היטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. הוסף 700 μl של RNase ללא מים כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl.
    5. על ניסוחים-חלבון פפטיד, להוסיף 16 μl של (BP100) 2 K 8 (70 מיקרומטר) ל -16 μl של ADH (7 מיקרומטר) ומערבביםהיטב על ידי pipetting. אפשר התערובת לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף 768 μl של מי ultrapure autoclaved כדי לדלל את התמיסה לנפח סופי של 800 μl.
  5. אפשר הניסוחים לייצב במשך 15 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.

.2 אפיון פורמולציות מבוסס פפטיד

  1. העברת כל פתרון (800 μl) לתוך קובט לניתוח דינמי פיזור אור (DLS). לקבוע את מדד בקוטר polydispersity הידרודינמית של מתחמי הקים עם nanosizer זטה, באמצעות לייזר 633 ננומטר הוא Ne-של 25 מעלות צלזיוס עם זווית גילוי backscatter של 173 מעלות.
  2. בעקבות מדידות גודל, להעביר כל פתרון (800 μl) לתוך תא נימי מקופל למדידות פוטנציאל זטה ב פרמטרים ברירת המחדל של קבוע דיאלקטרי, מקדם השבירה ואת צמיגות המים במהירות של 25 ° C.
  3. שים נפח קטן של פתרון מורכב, המשמש ניתוח DLS, על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הפקדה של 10 μl של פתרון מורכב על גבי המשטח בקע חשוף הטרי של גיליון יציץ ולהשאיר את המיקה לאוורר לילה יבש בצלחת פטרי פלסטיק מכוסית.
  4. לרכוש תמונה של המתחמים באוויר ב 25 מעלות צלזיוס באמצעות שלוחת סיליקון עם קבוע קפיץ של 1.3 N / מ 'קשה במצב 27,28.

הסתננות 3. עלי צמח

  1. השתמש 3 צמחי קרקע-הזדקנו שבוע (ארבידופסיס thaliana 24, ניקוטיאנה benthamiana 24 או 26 צפצפה). Transfect לפחות 3 עלים לשמש בשלושה עותקים עבור כימות של ביטוי גנים או מסירת חלבון.
  2. טען מזרק פלסטיק מחטים 1 מ"ל עם 100 μl של פתרון מורכב עבור transfection של עלה אחד. מקם את קצה המזרק על פני שטח abaxial של העלה.
  3. לחץ על קצה המזרק נגד עלה מעט לוחץ על מתג המזרק לאט תוך הפעלת א-לחץ נגדי עם iאצבע ndex של יד לטקס בכפפות מהצד ההפוך. ניתן לצפות חדירה מוצלחת כמו הפצת אזור ספוגת מים עלה. לייבל העלים הסתננו על מנת להקל על הזיהוי.
  4. דגירה עלה טרנספקציה משכי אופטימיזציה הבאים חדירה עם-pDNA פפטיד (12 שעות), פפטיד-dsDNA (12 שעות), פפטיד-dsRNA (9 - 48 שעות) ו-חלבון פפטיד (6 שעות) ניסוחים בתנאים הבאים: 16 hr אור / 8 שעות בחושך ב 22 מעלות צלזיוס למשך א thaliana ו צפצפה, או 24 שעות אור קבוע ב 29 מעלות צלזיוס למשך נ benthamiana.

הערכת 4. יעילות Transfection

  1. והבלו כולו עלה טרנספקציה של שהמפעלים הקטנים יותר (למשל., Thaliana א) או סעיף 1 ס"מ 2 של האזור הסתננו לצמחים גדולים (למשל., נ benthamiana).
  2. בניסויים transfection באמצעות בלוציפראז Renilla (Rluc) וקטור הכתב, לקבוע את transfectioיעילות n כמותית באמצעות ערכת Assay Rluc.
    1. מניחים כל עלה נכרת או סעיף עלה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. הוספת 100 μl של 1 × Rluc Assay הצפת תמוגה לכל צינור. באותו אופן, להכין lysates עלי שליטה הלא transfected (בשלושה עותקים).
    2. טוחן את העלים באמצעות עלי המגון דגירת lysate כתוצאה במהירות של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 - 10 שעות.
    3. צנטריפוגה lysate ב g 12,470 × ב microcentrifuge דקות 1. העברת 20 μl של lysate פינה אל באר בתוך microplate 96-היטב, ולהשתמש נפח הנותרים כימות של ריכוז החלבון הכולל באמצעות ערכת Assay חלבון BCA פי פרוטוקול של היצרן.
    4. הוספת 100 μl של 1 × המצע Assay Rluc (מדולל באמצעות הצפת Assay Rluc) לתוך הבאר ומערבבים ידי pipetting איטי. מניחים את microplate ב קורא microplate multimode וליזום המדידה.
    5. הפחת את הארת הרקע (ממוצע של לאn-טרנספקציה בשלושה עותקים) מכל ההארה של מדגם הניסיון. חשב את היחס בין photoluminescence (יחידות אור יחסי, RLU) לסכום של חלבון (מ"ג).
  3. בניסויים transfection באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקטור הכתב או שכותרתו fluorescently חלבון (למשל., ADH-RHB), ולבחון את הקרינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal.
    1. חותכים את הקצוות של עלה שלם (כדי לסייע להסרת חללי האוויר), בעוד עלה מחולק יכול לשמש הוא. הסר את הבוכנה של מזרק 10 מ"ל ומניח כל חלק לעלה או עלה ניכר בתוך המזרק.
    2. החזר את הבוכנה ולחץ עליו בעדינות לתחתית המזרק ללא ריסוק העלה. לשאוב מים לתוך המזרק עד שהוא כמחצית מלאה.
    3. כוון את המזרק כלפי מעלה ודוחפים את הבוכנה כדי להסיר אוויר מן המזרק דרך קצה. מכסה את קצה המזרק ולמשוך את הבוכנה כלפי מטה לאט לגרש אוויר מן לאהf. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד העלה נראה שקוף.
    4. מכסים את פני השטח של המיקרוסקופ שקופית עם דבק. חותכי שטח מרובע בקלטת הגדולה מספיק כדי להכיל את המדגם עלה באמצעות סכין, לקלף את הפיסה הרבועה של קלטת את עם מלקחיים כדי ליצור תא דגימה. הקלטת תשמש spacer בין השקופיות coverslip.
    5. מניחים את עלה בתא עם המשטח abaxial פונה כלפי מעלה ולמלא באזור תא הנותרים עם מים. חותם את העלה בתוך תא עם coverslip זכוכית ולאבטח את הקצוות של coverslip עם סרט דביק.
    6. בדוק את המדגם עלה באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר confocal תחת מטרה 40X או טבילה אובייקטיבי מים 63X. GFP או קרינת RHB ניתן דמיין באורכי גל עירור של 488 ננומטר או 555 ננומטר, בהתאמה.

תוצאות

מערך מטעני חומצה וחלבון גרעין הוכנס בהצלחה לתוך צמחים שונים באמצעות פפטידים תוכננו וקטורי משלוח. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין פפטידים קטיוני ומטענים-טעונים שלילי הביאו להיווצרות של מתחמי transfection כי יכול להיות שחדר ישירות לתוך בעלים הצמח באמצעות מזרק מחטים (איור 1). ניסוחים אופטימליים (נקבע באופן אמפירי במחקרים אלה 21,23-26) עבור transfection של בתאי צמח מפורטים בטבלה 1, כאשר כל סוג של מגוון רחב של מטענים נמסר (pDNA, dsDNA, dsRNA וחלבון) מיוצגת. בקטרים ​​הממוצעים של כל הניסוחים מבוססים פפטיד היו בטווח המשוער של 150 - 300 ננומטר. בהתבסס על ניתוח DLS, כל הניסוחים מוצגים polydispersities גודל נמוך יחסית, המעיד כי אגרגטים פפטיד המטען נוצרו יש חלוקה בגודל אחידה. המורפולוגיות שלמתחמי בין פפטיד pDNA (איור 2 א) או חלבון (תרשים 2B), על מיקה, הם צילמו על ידי AFM. מתחמי כדוריים הומוגנית נצפו הן שילובים פפטיד-pDNA פפטיד-חלבון, בהסכמה עם נתונים ממדידות DLS. מבחינת הפוטנציאל זטא של מתחמים (טבלה 1), pDNA- ומכלולים הנגזרות dsDNA היו חיובי שטח נטו שלילי בעוד מתחמים מבוססים dsRNA היה מטען משטח ליד ניטראלי. מתחמי פפטיד-חלבון, ומצד שני, היו בעלי מטען חשמלי חיובי.

הנצילות של pDNA פפטיד ניסוחים-dsDNA פפטיד בתיווך transfection של thaliana א או נ benthamiana כמערכות צמח המודל הוערכו כמותית וכן איכותית. את assay ביטוי גנים RLuc הועסק כימות של רמות ביטוי גנים (טבלה 1), ולכן, עבור pDNA בניסוי זה אוdsDNA קידוד הגן RLuc חייב לשמש complexation עם פפטידים המוביל בהתאמה. שימוש (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA, משלוח גרעיני במיקוד וביטוי של pDNA יכול להיות מושג, לאחר תקופת דגירה של 12 שעות, עם ערך מ"ג RLU / מוערך של כ 1 × 10 5. למסירה במיקוד המיטוכונדריה וביטוי של pDNA, שילוב של פפטידים, Cytcox- (KH) 9 ו BP100, נדרש ליצירת מורכבות. עם תקופת הדגירה באותו אופטימיזציה של 12 שעות, עם זאת, ברמה הרבה יותר נמוכה של transfection (כ 1 × 10 3 RLU / מ"ג) הושגה. בינתיים, תקופת דגירה דומה (12 שעות) ורמת ביטוי גנים (כ 1 × 10 3 RLU / מ"ג) נדרשו / מוקלטת עבור מתחמים מבוססים dsDNA, אף התגבשו באמצעות (KH) 9 -BP100 פפטיד. הערכות איכותיות של ביטוי גנים בוצעו על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה של עלים שטופלה prepar מתחמיםed באמצעות pDNA או dsDNA קידוד גן כתב GFP. בתאים transfected עם מתחמים הלא ממוקד פפטיד-pDNA, מפוזר פלואורסצנטי ירוק להתכתב עם הביטוי של GFP נצפה בבירור ונמצא למקם ב (איור 3 א) cytosol. הבדלים ברורים דפוס לוקליזציה של הקרינה GFP ניכרו תאים הסתננו עם מתחמי pDNA-פפטיד במיקוד המיטוכונדריה. הנה, פלואורסצנטי ירוק punctate כי colocalize עם הכתם המיטוכונדריה היה גלוי, המאשר את הספציפיות של ביטוי גנים באופן בלעדי בתא המיטוכונדריה של תאים (איור 3).

במקרה של ניסוחים-חלבון פפטיד, נטייה של מטען החלבון (ADH) על fluorophore (RHB) תאפשר להדמיה של החלבון נשא בתא התאי. בתוך תקופת דגירה קצרה של 6 שעות, ADH-RHB חלבון (כחול) נמצא שיחולקו לאורךcytosol ו vacuole של תאים הסתננו (איור 3 ג). בינתיים, מהיר ויעיל למטה בקרת גנים יכול להיות מושלם בצמחים שונים באמצעות ניסוחים פפטיד-dsRNA. בניסוי הראשון, עלה thaliana א הסתנן עם פפטיד-dsRNA קומפלקסים להשתיק את גן synthase chalcone (CHS) האחראי אנתוציאנין (פיגמנט האדום) ביוסינתזה בתנאי בצורת. ההבדל במראה של thaliana א עלים תחת נורמלי (האיור 3D, א) ותנאי בצורת (איור 3D, ב) ספק אמצעי קל להעריך CHS השתקה באמצעות ניסוח פפטיד-dsRNA אופטימיזציה (חץ 1 מציין באזור הסתנן). בניסוי השני, מתחמי פפטיד-dsRNA הסתננו לתוך העלים של thaliana א המהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). הפחתה ניכרת ביטוי YFP ניתן היה לראות את התאים אפידרמיס 9 שעות pOST-transfection (איור 3E, F). האפקטיבי של הניסוח בביטוי גני ויסות למטה במערכת צמחים שונה (צפצפה, 12 שעות שלאחר transfection) גם אושר (האיור 3G, H).

figure-results-1
איור 1: פורמולציות מבוססים פפטיד עבור משלוח חומצות גרעין ומטעני חלבון לתוך חיים וצמחים.
פפטידים המובילים שנועדו להכיל polycations מצומדות כדי חודר לתא או רצפי מעבר organellar. Polycations מאפשר מחייב ו / או התעבות של מטענים-טעונים שלילי כמו גם בריחה מתא endosomal הבא הפנמה לתאים. משלוח מטענים לתאים ובהמשך ל אברונים ספציפי מתווך על ידי רצפים חודרים לתא רצפי מעבר organellar, בהתאמה. מטענים שונים שיכולים להיות successfully נמסר לתוך הצמח כוללים חומצות גרעין כגון pDNA, dsDNA ו dsRNA, כמו גם חלבונים מודל כמו אלבומין בסרום שור (BSA), dehydrogenase אלכוהול (ADH) סיטרין (וריאנט של חלבון פלואורסצנטי צהוב). מולקולות ביו מסוגלים להקים מתחמי transfection עם conjugates פפטיד באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, אשר מוכנסים עלי הצמח על ידי חדירת מזרק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: מורפולוגיות של פורמולציות המבוססות פפטיד.
(א) AFM משרעת תמונה של (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA ב N / P 0.5. (ב) תמונה גובה AFM של (BP100) 2 K 8 / ADH ניסוח בבית רטי טוחנתo 10. לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 23,24. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: הערכה מיקרוסקופית של יעילות transfection באמצעות פורמולציות פפטיד מבוססי אופטימליים.
(א) ביטוי GFP Cytosolic (ירוק), להבדיל בין autofluorescence הכלורופלסט (אדום), נצפה בתאי mesophyll הספוגיים של thaliana א עלים הסתנן עם (KH) 9 ניסוח -BP100 / pDNA (N / P 0.5; 12 שעות ). (ב) ביטוי של GFP (ירוק) זוהה במיטוכונדריה (אדום) בתאי האפידרמיס של עלים א thaliana הסתננו עם Cytcox- (KH) 9 / BP100 / ניסוח pDNA (N / P 0.5 לכל peptidדואר; 12 שעות). תמונות מוגדלות של המיטוכונדריה עם ביטוי של GFP מוצגים בלוח הימין הקיצוני. משלוח (C) של ADH-RHB (כחול) לתוך התאים mesophyll הספוגית של thaliana א עלים בתיווך (BP100) 2 K 8 ביחס טוחנת פפטיד / חלבון של 10, דמיינו 6 שעות-חדירת הפוסט. (ד) עלה א thaliana לפני (א) ואחרי (ב) טיפול (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 48 שעות), אשר הביא דיכוי המסלול ביוסינתזה אנתוציאנין. ניסוח דומה המכיל GFP5 dsRNA הסתנן לתוך עלה כפי בקרה שלילית (ג). חצי 1 ו -3 מצביעים באזור הסתנן בעוד חצים 2 ו -4 עולים לאזור שאינו הסתנן בתוך העלה. (ה) א thaliana משאיר לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (ו) את הקרינה YFP פחתה בעקבות חדירת עם (קרן היסוד) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחנת 2; 9 שעות). (G) עליי צפצפה מהונדסת מבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- (H) חדירה הבאים קרינת YFP פחתו עם (KH) 9 -BP100 / ניסוח dsRNA (יחס טוחן 2; 12 שעות). לשכפל באישור ממקורות שפורסמו 21,23,24,26. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4: וריאציה פפטיד-ל-דנ"א (N / P) יחס והשפעתם על מאפייני biophysical של מכלולים.
עם הגדלת פפטיד יחס DNA, ניסוחים מבוססים פפטיד להקטין בגודלו בשעת מעבר הערכים זיטה-פוטנציאל שלהם משלילי לחיובי./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
טבלה 1: אפיון והערכה של פורמולציות פפטיד המבוסס השונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

figure-results-6
טבלה 2: השוואה בין פפטיד מבוסס ואחרים טכנולוגיות משלוח DNA קיימים עבור צמחים שלמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול אשר זוהו באופן אמפירי נדונים. על ידי חדירת מזרק, הניסוחים מבוססי פפטיד המוכנסים הנאדיות בתוך עלה הצמח דרך הפיוניות. כדי להבטיח ספיגה מקסימלי של הפתרון, בתהליך החדיר צריכה להתבצע כאשר הצמחים נמצאים תחת תנאים שהם תורמים פתיחת הפיוניות כלומר., מסופקים עם מספיק מים ובתקופת האור. באשר להכנת מתחמי transfection, על ניסוחים שכוללים שילוב של שני פפטידים (למסירת DNA במיקוד המיטוכונדריה), הרצף עבור תוספת של כל רכיב חיוני ולא צריך להיות הפוך.

ישנם שינויים רבים סבירים לנוהל. אופציה נוספת עבור חדירת תאי צמח היא השימוש של חדירת אבק, אשר מסוגל להציג את הפתרון המורכב לתוך צמחים שלמים ו / או רקמות חלקיות כוללmeristems הפסגה. עבור הליך חלופה זו, שתילי שקועות הפתרון transfection, ובהתבסס על הלחץ שנוצר על ידי ואקום, מתחמי מטען הפפטיד נאלצים דרך הפיוניות ולתוך בתאי צמח (Yoshizumi, ט, נתונים שלא פורסמו).

ביטוי גני חלוף, בהתבסס על מחקרים באמצעות תאים מן החי, מוכיח להגדיל עם ריכוזי DNA גבוהים 29-31. חשוב לציין כי היחס של פפטיד ל- DNA משפיע על מאפייני biophysical (גודל, פריצת שטח) של מתחמים (איור 4), אשר משפיע יעילה transfection; ומכאן, היחס האופטימלי צריך להישמר גם עם ריכוז ה- DNA מוגבר.

אחד היתרונות העיקריים באמצעות פפטידים כסוכן למסירת גן / חלבון הוא כי הרצף שלה ניתן כוונון למלא תפקיד רצוי. לדוגמא, תחום מיקוד-המיטוכונדריה של הפפטיד המוביל מתואר הרבעה זוy יכול להיות מוחלף עם רצפים chloroplastic או peroxisomal מיקוד עבור לוקליזציה אברונים אלה. בעוד שתמורה הכלורופלסט אפשרי בכמה צמחים באמצעות biolistics 32-34, לא Agrobacterium ולא שיטת biolistic יכול להציג גנים לתוך המיטוכונדריה או אברונים אחרים מלבד גרעין (טבלה 2).

אין מגבלות מארח לטווח קשיחים transfection מבוססי פפטיד, בשונה משיטת מבוססי Agrobacterium (טבלה 2). עד כה, ניסוחים עבור transfection של thaliana א, נ benthamiana וצפצפה מוטבו (טבלה 1), אבל השיטה יכול להיות מיושם גם עבור טבק, זן עגבניות מיקרו-טום, אורז (מבוסס על ניסויים ראשוניים), וצמחים ובי-dicotyledonous אחרים.

נכון לעכשיו, אין שום מגבלה ידועה בגודל transgene כאשר פפטידים הם השתמשווקטורי transfection הים. לעומת זאת, מולקולות דנ"א גדולות נמצאו להפחית את יעילות השינוי של שיטות בתיווך Agrobacterium 35,36, ו מגבלת גודל עליון transgenes של כ 200 kb דווח 37-39. שימוש biolistics, מצד השני, קטעי דנ"א גדולים עשויים להיות טעונים במהלך הכנה או מסיר לתוך צמחי 38. אמנם אין גבול עליון נקבע לטרנספורמציה biolistic עד כה, אילוצים פיזיים נמצאו להגביל את הגודל של ה- DNA כי ניתן להעביר הרבה פחות מ -150 KB 40. היתרונות העיקריים של שימוש במערכת מבוססת-פפטיד עבור העברת גנים לעומת הגישות קיימות העסקה או Agrobacterium או הפגזת microprojectile, שנדונו לעיל, מסוכם בטבלה 2.

במוגבלות מעטיבשביל שיטה זו כפי שהיא עומדת. ראשית, ממוקד משלוח של pDNA כדי האברונים ספציפיים, כגון mitochondria, הוכח אפשרי על ידי שילוב פשוט של ה- DNA מחייבת חודר תאים רצפים במעבר אברון למרות היעילות הייתה נמוכה. הביטוי transgene ניתן היה לזהות, על ידי מיקרוסקופ confocal, רק אוכלוסייה קטנה של המיטוכונדריה בתוך התאים. לפיכך, שינויים נוספים נחוצים כדי: (i) לשפר את טרנסלוקציה של מתחמים יותר על פני התא / קרום organellar, וכן (ii) לשפר את הניתוק והעברת pDNA מן פפטיד המוביל לתוך אברון היעד לביטוי. שנית, באמצעות מערכת מסירת DNA זה, הביטוי החולף של גני כתב אקסוגניים הושג בהצלחה בתא cytosolic ו המיטוכונדריה של תאים. התאגדות וביטוי יציב של הגנים הציגו את הכור הגרעיני / הגנום organellar לא הוקמו עדיין, עם זאת, בשל העדר של אסטרטגיות בחירה מתאימות.

אף שהוא מודה כי ישנם אזורים לשיפור או ד נוסףevelopment, האסטרטגיה נגזרת פפטיד המתוארת כאן נשארת טכניקה פשוטה צדדית סללה את הדרך עבור משלוח מטענים שונים לסוגי צמח מגוונים.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות במימון מדע יפן וטכנולוגית סוכנות גישוש מחקר לטכנולוגיה מתקדמת (JST-Erato), האנרגיה החדשה התעשייתי טכנולוגית הפיתוח הארגוני (NEDO), וצלב-משרדי אסטרטגי חדשנות קידום התכנית (SIP), יפן .

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(KH)9-BP100 פפטידמסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKENN/Aרצף: KHKHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 פפטידמסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKENרצף: פפטיד KKLFKKILKYLKKLKKIL-
KYLKKKKKKKK
BP100מסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKENרצף N/A: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 פפטידמסונתז בהתאמה אישית על ידי מכון מדעי המוח RIKENN/Aרצף: MLSLRQSIRFFKKHKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS ו-P35S-RLuc-TNOSN/AN/Aמקודד גנים של חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים של Renilla luciferase, בהתאמה, תחת שליטת המקדם המכונן CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp ו-pDONR-cox2:rlucN/AN/Aמקודד גנים של חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים של Renilla luciferase, בהתאמה, תחת שליטת המקדם הספציפי למיטוכונדריה cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR מוגבר מ-pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/AN/Aמקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים Renilla luciferase, בהתאמה, תחת שליטת מקדם מכונן CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/Aלהשתקה מתווכת הפרעות RNA של חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/Aלהשתקה מתווכת הפרעות RNA של סינתאז כלקון (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 מ"ל ו-10 מ"ל מזרקי פלסטיקTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהAS ONE Corporation151212
96 בארות צלחת תחתונהשטוחה Asahi Glass Co., Ltd.3860-096
סרט דבקSekisui כימיקלים ושות', בע"ממס' 835
אלכוהול דהידרוגנאזסיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.A-7011
מיקרוסקופ כוח אטומיסייקו אינסטרומנטס בע"מSPI3800, SPA 300HV
מיקרוסקופ כוח אטומיHitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
ערכת בדיקת חלבון BCAThermo Fisher Scientific Inc.23227
CantileverHitachi High-Tech Science CorporationK-A102001593
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליCarl ZeissLSM700
Cork BorerSigma-Aldrich Co., LLC.Z165220לכריתת עלים לדיסקים בקוטר 1 ס"מ
CoverslipMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
CuvetteSarstedt759116
נימי מקופלMalvern Instruments, Ltd.
מלקחייםשימיזו אקירה בע"מנירוסטה 150
הומוגניזציה עליIeda Trading Corp.9993
מיקהנישין EM ושות', בע"מLC23Z
מיקרוצנטריפוגהבקמן קולטרBKA46472
קורא מיקרופלייטמכשירים מולקולריים תאגידספקטרה מקס M3
מיקרוסקופ שקופיתמטסונאמי זכוכית תעשייתית, בע"מ
PipetteEppendorf Research® בתוספת3120000909
טיפים לפיפטהAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
צלחת פטרי מפלסטיקAS ONE Corporation1-7484-01
ערכת בדיקת רנילה לוציפראזתאגיד PromegaE2810
רודמין B איזותיוציאנטסיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.
ללא RNaseQiagen129112
נתרן קרבונטWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-01585
להב וידית כירורגייםFEATHER Safety Razor Co., Ltd.נירוסטה מס' 14 (להב), מס' 3L (ידית)
מכסה קצה מזרקמוסאשי הנדסה בע"ממאזן שקילה NC-3E
SartoriusCPA225D
Zeta PotentiometerMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS
תא DTS1070S011120283924מים

מקורות

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751(2015).
  22. Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081(2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379(2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים