Method Article

פיתוח מודל ישיר מכסת-זול עבור הערכת pulpal ריפוי פצע גיבוש מתקנת הדנטין של עכברים

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטת צעד אחרת צעד ביצוע עיסה ישירה מכסה על שיני עכברים להערכת ריפוי פצע pulpal והיווצרות הדנטין מתקן in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוך השן הוא איבר חיוני בשן המוגן באופן מלא על ידי אמייל ודנטין. כאשר מוך השן נחשף עקב פציעות קריוגניות או יאטרוגניות, הוא מכוסה לעתים קרובות בחומרים תואמים ביולוגית על מנת לזרז את ריפוי פצעי המוך. המטרה הסופית היא לחדש את הדנטין המשקם, מחסום פיזי שמתפקד כ"אטימה ביולוגית" ומגן על רקמת מוך השן הבסיסית. למרות שהליך כיסוי ישיר זה של מוך השן נמצא בשימוש מזה זמן רב ברפואת שיניים, המנגנון המולקולרי הבסיסי של ריפוי פצעי מוך השן והיווצרות דנטין משקם עדיין אינו מובן היטב. כדי לגרום לדנטין מתקן, מכסת מוך השן בוצעה באופן ניסיוני בבעלי חיים גדולים, אך פחות בעכברים, ככל הנראה בשל גודלם הקטן והקשיים הטכניים הנובעים מכך. כאן, אנו מציגים שיטה מפורטת, שלב אחר שלב, לביצוע הליך מכסת מוך בעכברים, כולל הכנת חלל דמוי Class-I, מיקום חומרי מכסה מוך השן והליך השיקום באמצעות חומר מרוכב דנטלי. מודל העכבר שלנו יהיה חיוני בחקירת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של ריפוי פצעים במוך השן בהקשר של דנטין in vivo מתקן, על ידי מתן אפשרות לשימוש בעכברים טרנסגניים או נוקאאוט הזמינים באופן נרחב בקהילת המחקר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עששת שיניים היא אחת ממחלות הפה הנפוצות ביותר והגורם המוביל להתערבויות כירורגיות לשיניים כמעט בכל האנשים1,2. הפרוגנוזה של התערבויות כירורגיות ושחזור שן תלויה במידה רבה בתגובה נכונה של מוך השן וריפוי פצעים מוצלח. ואכן, עששת שחודרת עמוק דרך האמייל והדנטין מובילה לעתים קרובות לחשיפת רקמת מוך השן הבסיסית שלעתים קרובות "מכוסה" בחומרים דנטליים, כגון סידן הידרוקסיד (Ca(OH)2) או צמנט סידן-סיליקט הידראולי (HCSCs), כולל אגרגטים מינרליים תלת-חמצניים (MTA). המטרה הסופית של הליך כזה של כיסוי מוך השן היא לזרז את ריפוי פצעי מוך השן על ידי חידוש דנטין מתקן, מחסום פיזי המתפקד כ"חותם ביולוגי" כדי להגן על רקמת מוך השן הבסיסית ולהגדיל את תוחלת החיים של השן ואת בריאות הפה הכללית. עם זאת, המנגנון הבסיסי של ריפוי פצעי מוך השן והיווצרות דנטין מתקנת אינו מובן במלואו.

כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של ריפוי פצעי מוך השן והיווצרות דנטין משקם in vivo, נעשה שימוש בעבר במספר בעלי חיים, כולל קופים, כלבים וחזירים3-5. ביניהם, חולדות משמשות לעתים קרובות מכיוון שהן קטנות יחסית בגודלן בהשוואה לבעלי החיים האחרים, אך שיניהן גדולות מספיק כדי לבצע כיסוי ישיר של מוך השן ללא כל קשיים טכניים6-10. מודלים אלה של בעלי חיים הם חלופות אידיאליות למחקרים בבני אדם לבחינת תגובות מוך השן והיווצרות דנטין מתקן. עם זאת, השימוש בהם מוגבל למחקרים תצפיתיים ברמה התאית, והם בקושי מספקים תובנות מכניסטיות במהלך היווצרות דנטין מתקנת ברמה המולקולרית.

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בהנדסה גנטית סיפקה כלי מחקר יקרי ערך וחיוניים - עכברים המכילים גן שמתבטא יתר על המידה או נמחק - שהם חיוניים לחקר מנגנונים מולקולריים של מחלות אנושיות in vivo. מספרם של זנים שונים של עכברים טרנסגניים או עכברי נוקאאוט הניתנים להשראה אסטרטגית באופן ספציפי לתא גדל ללא הרף בקהילה המדעית. לכן, בחינת ריפוי פצעי מוך השן והתחדשות דנטין מתקנת בעכברים אלה תעזור מאוד לזרז את הבנתנו את התהליכים הללו ברמה המולקולרית. עם זאת, השימוש בעכברים מצטמצם משמעותית, שכן ביצוע הליך כיסוי מוך השן על שן עכבר הוא מאתגר מבחינה טכנית בשל גודלו המיניאטורי. כאן, אנו מציגים את השיטה הניתנת לשחזור שלנו לביצוע מכסת מוך ישירה בעכברים להערכת ריפוי פצעי מוך השן והיווצרות דנטין מתקנת in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים נרכשו מ ג'קסון מעבדה ולעטוף ביבר חינם לפתוגן בחטיבת UCLA לרפואת בעלי חי מעבדה (DLAM). הניסויים בוצעו על פי ההנחיות מוסדיות המאושרות מן ועדת המחקר החי של הקנצלר (ARC # 2016-037).

1. עכבר הרדמה

  1. השתמש בן שמונה שבועות הנקבה C57 / BL6 עכברים (n = 3).
  2. להרדים את העכברים באמצעות קטמין (80-120 מ"ג / ק"ג של משקל העכבר) / xylazine (5 מ"ג / ק"ג של משקל העכבר) פתרונות ולנהל intraperitoneally (IP) במינון של 10 מ"ל / ק"ג.
  3. הכן קטמין (80 - 120 מ"ג / ק"ג) / xylazine (5 מ"ג / ק"ג) פתרונות ולנהלם intraperitoneally (IP) במינון של 10 מ"ל / ק"ג.
  4. ודא עכברים בהרדמה מלאה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן.

נוהל 2. מכסה-זולה

  1. מניחים את בעל הפה בפה של העכבר.
  2. אבטח את בעל פה על השולחן כך שהואהמודעה פונה כלפי מעלה.
  3. מניח את המיקרוסקופ (10X) על גבי הפה כך טוחן לסתי הראשונה הוא גלוי לחלוטין.
  4. באמצעות ¼ הסיבוב ספחת בתוך ידית במהירות גבוהה ב 200,000 סל"ד, הוצא את חלק האמייל של השן באמצע עד עיסת גלוי דרך הדנטין השקוף. אין לחשוף את העיסה עם הספחת.
  5. כשאתה משתמש בקובץ-K endodontic 15 # (בקוטר של 150 מיקרומטר), לנקב דרך הדנטין ולחשוף את העיסה.
    הערה: טיפול מיוחד צריכה להילקח כך פסול הדנטין לא לקבל דחף לתוך העיסה. זה יכול להימנע על ידי החלפה של קובץ K רבעונים ואז מושך את K-להגיש החוצה.
  6. מערבבים עם MTA סטרילי H 2 O על פי הוראות היצרן. לספק ומקום MTA על העיסה החשופה עם קצה Explorer. השתמש הצד האחורי של נקודת נייר (קנס) לארוז את MTA לתוך העיסה נחשפה על ידי הקשה עדינה. מן הצד הקהה של נקודת נייר שטוח ולכן מאפשרעבור העיבוי התקין של MTA לתוך העיסה החשופה.
  7. Etch השן במשך 15 שניות על ידי הנחת etchant חומצה זרחתית 35% שבו זה פשוט מכסה את השן. קח טיפול מיוחד כדי להגביל את המיקום של etchant, מכיוון שהוא עלול לגרום לגירוי רקמות חניכיים.
    הערה: etchant מגיע מזרק משמש לחספס את משטחי השן כך דבקים שיניים יכול לזרום לתווך מליטה micromechanical על השן. כי הם צמיגים, זה יכול להיות עצמאי על ידי החלת כמויות קטנות ישירות על גבי השן.
  8. השתמש יניקה שלילית בלחץ להסיר את etchant. השתמש גלול כותנה, כי הוא שרוי קל באות O H 2 להסיר את שאריות etchant. חזור על שלב זה עד etchant נמחק לחלוטין מן השן.
  9. באמצעות מטלית אוויר דחוס, לייבש את השן בעדינות.
  10. החל דבקי השיניים באמצעות הישבן של נקודת נייר.
  11. הפוך את שכבת דבק דקה באמצעות אוויר דחוס עבור 3 s.
  12. Cיור דבקי השיניים במשך 20 שניות באמצעות יחידת אור-ריפוי.
  13. מניחים את מרוכבים flowable בכמויות קטנות על השן והוא היה אטום עם MTA. השתמש בקצה של החוקר לזרום המשולב לתוך חריצי השן.
  14. לרפא את מרוכבים עבור 30 s באמצעות יחידת-ריפוי אור לפלמר אותו. ודא מרוכבים הוא נרפא לחלוטין וקשה באמצעות הסייר.

3. Post-op Care

  1. נהל carprofen (5 מ"ג / קילו) תת עורי (SC) מייד לאחר הליך מכסה-העיסה.
  2. מניח את העכברים על כרית חימום בהספק נמוך כדי לשמור על החיות חמות לפני שהם מתעוררים.
  3. החזר את עכברי הביבר לדיור.

רכש רקמות 4.

  1. לאחר 5 - 6 שבועות, להרדים את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם תחת תנאי הרדמה מלאה עם isoflurane.
  2. מוציאים בזהירות את maxilla והוצא אותו מבסיס הגולגולת והכניס אותו לתוך צינור 50 מ"ל. תקן את entirmaxilla דואר המכיל את שני שן העיסה-כתרי שן הסגורה והפתוחה הנגדית paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS, pH 7.4, ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן לאחסן אותו בתמיסת אתנול 70%.
    הערה: Paraformaldehyde הוא רעיל ומסרטן. Paraformaldehyde השימוש הנכון צריך להיות במעקב כפי שמתואר נהלי עבודה סטנדרטיים (SOP).
  3. סרוק את maxillae העכבר באמצעות סריקת μCT. להבטחת maxillae במהלך הסריקה, לעטוף את דגימות עם גזה ספוגה 70% אתנול ו למקם אותם בצינור תרבית תאים של 15 מ"ל.

5. סריקה μCT

  1. הכן את הדגימות לסריקת μCT. בקצרה, לעטוף את דגימות עם גזה ספוגה 70% אתנול ו לאבטח אותם בתוך שפופרת חרוטי תרבית תאים הגנרית של 15 מ"ל. הר הצינור לבמת סריקת μCT, כפי שמתואר בהוראות היצרן.
  2. הגדר את מקור רנטגן כדי זרם של 145 מיקרו-אמפר, מתח של 55 KVP ופעם חשיפת 200 ms.
  3. בצע רכישת התמונה עם סורק μCT ברזולוציה 20 מיקרומטר עם מסנן 0.5 מ"מ אל.
  4. לשחזר את התמונה ולדמיין אותו 11.
  5. לאחר הסריקה μCT ההתקנה, הפעל decalcification עם 5% EDTA ו -4 סוכרוז% ב PBS (pH 7.4) במשך 2 שבועות.

עיבוד רקמות 6. מכתים

  1. להטביע רקמות decalcified פרפין. לפני ההטבעה, חתוך את maxilla על ידי ביצוע חתך sagittal מייד קדמית הטוחן הראשונה. בעוד הטבעה, מקם המשטח הזה כלפי מטה, כך החתך לאורך של הטוחנת הראשונה הוא משטח החיתוך.
  2. באמצעות microtome, להכין 5 שקופיות מיקרומטר בעובי. האזורים המגבילים עיסת בדרך כלל בקנה אחד עם distopalatal (DP) השורש, אשר ניתן להשתמש בהם כנקודת ציון. לקבוע את האזור המדויק של עניין על ידי בחינת היסטולוגיה במיקרוסקופ אור השוואת תמונות μCT.
  3. עבור H & E מכתימה, deparaffinize ו רעננותם שקופיות עם קסילן (2x) ואתנול בדילול סדרתי (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x, ו -70% EtOH 1x).
  4. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מהברז.
  5. הכתם עם פתרון Hematoxylin עבור 2.5 דקות ולשטוף עם מי ברז.
  6. טובלים את השקופיות אתנול 95% דקות 1.
  7. כתם עם פתרון Eosin דקות 1 ולשטוף במים ברז.
  8. מייבשים עם אתנול בדילול סדרתי (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, ו -100% EtOH 3x) קסילן (3x).
  9. הר שקופיות עם פתרון הרכבה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנה, הראינו את שלב-אחר-צעד נהלים לבצע עיסת מכסת על השיניים עכברים. אחד ההיבטים המרכזיים של עיסת מכסה בעכברים הוא לקבל את המנגנון המתאים. בהקשר זה, שיש מיקרוסקופ עם הגדלה כוח 10X חיוני (איור 1 א). כדי ליצור הכנת Class-I-כמו השן, השתמשנו בר ¼-סיבוב במאבק ידית במהירות גבוהה חשמלית ב 200,000 סל"ד (איור 1B). לחלופין, כל מנועי החיפוש האחרים, כולל אלה שמשתמשים אוויר דחוס, שניתן להשתמש בהם כדי להכין שן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון לעכשיו, ישנם מספר דגמים ניסיוניים שונים זמינים כדי לאמת את השפעות in vivo של חומרים דנטליים, פיגומים, או גורמי גדילה על בידול odontogenic של תאי גזע עיסת שיניים (DPSCs) 13. מודלים אלה כוללים בהשתלה עצמית אקטופי של DPSCs לתוך איבר, כגון הקפסולה כליות, או השתלה תת עורית של DPSCs לעכברים בעלי דיכוי חיסוני עם פיגומים 14,15. עם זאת, שיטות אלו מוגבלים כי אפקט odontogenic שלהם על DPSCs לא מבוצע בסביבה עיסת orthotopic. מצד השני, השתלת orthotopic לתוך נה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי R01DE023348 (RHK) מ NIDCR / NIH ואת מענק מחקר הפקולטה (RHK) מהמועצה למחקר של הסנאט האקדמי של חטיבת לוס אנג'לס של אוניברסיטת קליפורניה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופ סטריאו BM-LEDMEIJI טכנומיקרוסקופ 
אופטימה MCX-LED Bien Air Dental1700588-001מנוע מנוע חשמלי
isofluraneהנרי שיין בריאות בעלי חייםNDC 11695-0500-2
1/4 עגול בורBrasseler001092T0
אנדודונטי K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
נקודת ניירהנרי שיין100-3941
Ultra-EtchUltradent מוצר בע"מתחריט חומצה זרחתית
OptiBond SoloPlusKerr29669דבקים
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115יחידת אור ריפוי
אפיון גווןBiscoT-14012זרימה מרוכבת
SkyscanBreuker1275uCT סורק
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
פתרוןהרכבהThermo Scientific8310-16
Cytoseal 60

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012. NCHS Data Brief. (197), 197(2015).
  2. Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. The global increase in dental caries. A pending public health crisis. Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).
  3. Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems. J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).
  4. Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps. Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).
  5. Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine. J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).
  6. Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide. Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).
  7. Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp. Head Face Med. 3, 40(2007).
  8. Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations. Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).
  9. Sela, J., Ulmansky, M. Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).
  10. Maurice, C. G., Schour, I. Experimental cavity preparations in the molar of the rat. J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).
  11. Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from: http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf (2011).
  12. Sohn, S., et al. The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).
  13. Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration. Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).
  14. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  15. Yu, J., et al. Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells. Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).
  16. Zhu, X., et al. Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration. J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).
  17. Iohara, K., et al. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).
  18. Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin. J Dent Res. , (2016).
  19. Hunter, D. J., et al. Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration. J Bone Miner Res. , (2015).
  20. Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. Dentin: structure, composition and mineralization. Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).
  21. Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth). Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).
  22. Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study. J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).
  23. Miller, R. A., Nadon, N. L. Principles of animal use for gerontological research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).
  24. Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions. J Dent Res. 95, 1503(2016).
  25. Williams, D. W., et al. Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice). Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).
  26. McPherson, J. D., et al. A physical map of the human genome. Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).
  27. Gregory, S. G., et al. A physical map of the mouse genome. Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).
  28. Hilton, T. J. Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature. Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).
  29. Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).
  30. Kalu, D. N., Chen, C. Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption. J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).
  31. Yokochi, T. A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury. Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).
  32. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Direct Pulp cappingPulpal Wound HealingReparative Dentin FormationMouse ModelCavity PreparationMTA PlacementDental CompositeMicro CT ScanHistological AnalysisDMP1 Staining

Related Articles