הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54984

⸱

23 באפריל 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biomechanical Engineering, Faculty of Mechanical, Maritime, and Materials Engineering, Delft University of Technology (TU Delft), 2Department of Orthopedics, UMC Utrecht, 3Department of Rheumatology, UMC Utrecht

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציעים פרוטוקול לחקור את התחבורה של מולקולות טעונות uncharged פני סחוס במפרק בעזרת שיטות ניסיוניות שפותחו לאחרונה מספריות.

תקציר

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא מחלה מתישה המשויך ניוון של הסחוס במפרק ואת עצם subchondral. ניוון של סחוס במפרק פוגע בתפקוד לטעון הנושאות שלה באופן משמעותי כפי שהוא חווה השפלה כימית עצומה, שיבוש הפיברילות אובדן וקולגן proteoglycan כלומר. אחת הדרכים המבטיחות לחקור מנגנונים נזק כימי במהלך OA היא לחשוף את דגימות סחוס אל המומס חיצוניים ולפקח הדיפוזיה של מולקולות. מידת הנזק בסחוס (ריכוז כלומר ותצורה של מקרומולקולות חיוניים) קשורה לאובדן אנרגיה collisional של מומסים חיצוניים תוך כדי תנועה על פני הסחוס במפרק יוצר המאפיינים דיפוזיה שונים לעומת סחוס בריא. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול, אשר מורכב מכמה שלבים, והוא מבוסס על ניסיוני שפותחו בעבר מיקרו-C14px; "> omputed T omography (מיקרו-CT) ו דוגמנות אלמנטים סופיים הובלת מולקולות יוד טעונה uncharged נרשם לראשונה באמצעות מיקרו-CT, אשר מלווה החלים-המומס פאזי ומודלים אלמנטים סופיים מרובה מצבים לקבל מקדמי דיפוזיה. וקבוע צפיפויות מטען על פני אזורי סחוס.

מבוא

תחבורה מולקולרית ממלא תפקיד חיוני הומאוסטזיס של המפרקים לבטא, משלוח של תרופות כדי במפרק סחוס ודימות סחוס משופר ניגודיות 1, 2, 3. גורמים כגון אינטגרצית סחוס תקינות, המומס תשלום וגודל וכן osmolality וריכוז האמבטיה במגע עם סחוס עשוי להשפיע על שיעור התחבורה 4, 5, 6. ההובלה מומסת, ניטראלי או טעון, יכולה להיות שונה בין אזורי סחוס במפרק, כי כל אזור מורכב ריכוזי אורינטציות שונים של מולקולות תא מטריקס גדולה, כלומר proteoglycans (PGS) וקולגן סוג II 1, 7, 8, 9,נַעֲרָה = "Xref"> 10, 11. וחשוב יותר, התחבורה של מומסים טעונים יכולה להיות תלויה במידה רבה את הריכוז של proteoglycans הכולל שעבודים קבועים שליליים בתוך מטריקס אשר מגביר פני סחוס במפרק 8, 9. פרמטרים אלה צפיפות שעבוד קבוע במיוחד (FCD), האוריינטציה של סיבי קולגן וריאציה תכולת מים על פני הסחוס עשוי לעבור שינויים כמו דלקת מפרקים ניוונית (OA) מתקדמת, אשר סימנה באמצעותם את החשיבות של לימוד דיפוזיה פני הסחוס.

במחקר הנוכחי, פרוטוקול המבוסס על מחקרי ניסויים הקימו בעבר חישובית 6, 8, 9 מוצע לחקור דיפוזיה במדויק בתנאי גבול שונים באמצעות מומסים ניטראליים והואשמו ב מודל סופי-אמבטיה של דיפוזיה. Tהוא הציע שיטות מורכבות הדמית טומוגרפיה ממוחשבת מייקרו (micro-CT) של מערכת כולל סחוס ואמבט סופי הנתמך על ידי-המומס פאזי מתקדם ומודלי אלמנטים סופיים מרובים מצבים. מודלים אלה מאפשרים קבלת מקדמי דיפוזיה של מולקולות ניטראליות וטעונות כמו גם FCDs פני אזורים שונים של סחוס במפרק. שימוש במודלים אלה, אפשר לקבל הבנה טובה יותר של ההתנהגות של מולקולות ניטראליות והואשמו לשדר שיכול לשמש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הסחוס שכיסה-אמבטיה סופית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול המובא כאן הוא אימץ מן הפרוצדורות ו חישובית של מחקרים אחרונים 6, 8, 9. הפרוטוקול מתואר באיור 1.

החומרים cadaveric נאספו באישור הסגל וטרינרי של אוניברסיטת אוטרכט.

1. לדוגמא הכנת אמבט

  1. לקדוח החוצה תקעי osteochondral גליליים (קוטר של 8.5 מ"מ) מן condyles ירך סוסי cadaveric באמצעות מקדח מחוייט (איור 1), תוך התזה מגניב פוספט שנאגר מלוח (PBS) כדי למנוע התחממות יתר ופגיעה בסחוס עוקבת.
  2. לכווץ את המצתים osteochondral עם פלסטיק מתכווץ שרוול כדי למזער את דיפוזיה לרוחב האמבטיה שכיסה.
    1. הר תקע osteochondral עם סחוס בבית הדואר העליון בתחילה בתוך שרוול מתכווץ פלסטיק ופעל ידי נושבת באוויר חם אליו. להוסיף חתיכות צמר גפן רטוב על פני השטח של סחוס כדי למנוע נזק חום-קשורים.
  3. כן-אמבטיות סופיות של טיעונים (למשל, 650 μL, 420 מ"מ, ioxaglate, משקל המולקולרי (MW) = 1269 Da, תשלום = -1) ו ניטראלי (650 μL, 420 מ"מ, iodixanol, MW = 1550 Da) מומס בנפרד.
  4. טען את הסופים-האמבטיות הכינו על פני השטח של סחוס באמצעות מזרק ולמקם תקע פקק על המדגם העטוף כדי למנוע אידוי במהלך ניסויים ב RT (איור 2 א). כדי ללמוד את התחבורה המומסת הניטראלית, למקם את אמבטית iodixanol וכדי ללמוד באמבטית ioxaglate מקום בתחבורה מומסת הטעונה השלילי על גבי משטח הסחוס.

הדמיה 2. ועיבוד תמונה

  1. מניח את הדגימות העטופות מבודדות עם תקע פקק על בעל מחוייט מצורף הבמה הממונעת של א-CT מיקרו. מקום tהוא לדגום כך משטח הסחוס מכוסה פתרון חומר ניגוד פונה כלפי מעלה.
  2. סרוק באמצעות מיקרו-CT (גודל voxel של 40 × 40 × 40 מיקרומטר 3, סריקה בזמן של 2 דקות, מתח צינור של 90 קילו ו הנוכחי צינור של 180 מיקרו-אמפר) שדה הראייה המורכבת של הסחוס, צלחת subchondral, ו finite- אמבטיה בכמה נקודות זמן עד מדינת שיווי משקל (48 ח) הוא הגיע (איור 2 א). מדינת שיווי המשקל מושגת כאשר ערכי ריכוז אינם משתנים לאורך זמן.
  3. רשום את תמונות 3D בנקודות זמן שונות המבוססות על התמונה הראשונית כדי להקל מיצוב של האזור של העניין (ROI) באמצעות התוכנה של היצרן (למשל, לנתח).
  4. המר את 3D משוחזר תמונות מיקרו-CT לתוך פורמט קובץ תמונה Tagged 2D (TIFF) מחסנית לפני עיבוד אותם באמצעות תוכנה של היצרן.
  5. גלובלי פלח (ImageJ> התאם> Threshold) הסחוס מן העצם subchondral ושובשוכב באמבטיה בתוכנה.
  6. השג את הערך האפור הממוצע של סחוס בנקודות זמן שונה (ImageJ> לנתח מדוד>) באמצעות מסכת סחוס שנוצרה בשלב הקודם.
  7. בהינתן ריכוז אמבטיה הראשוני וריכוז חומר ניגוד ראשוני הסחוס, להשתמש עקומת כיול ליניארית להמיר הערכי האפור הממוצע של ריכוז בפועל של מומסים. נתונים קודמים תומכים בעובדה ערכית אפור לשמור על קשר לינארי עם הריכוז של חומר ניגוד.
  8. שרטט את ריכוזי המומס לעומת נקודות זמן הניסוי.

3. מודלים חישוביים

הערה: דיפוזיה בעיה זו הנחה היא להתקיים 1D (לאורך ציר z), אשר עולה בקנה אחד עם המצב בגבול הניסיון. לכן, הגיאומטריה יכולה להיווצר באופן שרירותי.

  1. לבנות סחוס מבוסס סופית-אמבטית מודלים רב אזור: 1) סחוס מורכב אזור השטחי (20% מעובי הסחוס סה"כ), אזור הביניים (50% מעובי הסחוס הכולל) ואת אזור עמוק (30% מעובי הסחוס הכל) 12 ו 2), אמבטיה סופי ב FEBio 13, 14 (איור 2B).
  2. הקצה את התכונות המכאניות ופיסיות של אזורים השונים של סחוס אמבטית FEBio. מודול יאנג (10 MPA) הונח להיות גבוה מספיק כדי לעמוד בלחץ האוסמוטי שמפעיל באמבטיה שמעליה ולכן להגן על הסחוס מפני עיוותים מוגזמות.
    1. השתמש חדירות הידראוליות של 10 -3 מ"מימ 4 / NS ו מקדם פואסון של 0. מקדם דיפוזיה המומס השתמש בפועל של האמבט בסימולציות 8, 9.
  3. צור רשת (אלמנטי hexahedral טריליניארי 8-צומת) ולעדן אותה ליד הגבולות (איור 2B)class = "Xref"> 8, 9.
  4. מודל דו-פאזי-המומס
    1. החל ריכוז מומס ראשוני לחץ האמבטיה ויעיל המתאים לו. תראה את התיאור של לחץ אפקטיבי 9, 15.
    2. הפעל את המודל במצב חולף להשיג ריכוז מומס מול עקומות זמן על פי מקדמי דיפוזיה שנקבעו באזורי סחוס שונים.
  5. מודל מרובה מצבים
    הערה: התנודות החשמליות בין אמבטית רקמות ניתן לעקיפה על ידי הוספת שני חד ערכי נגד יונים הוא באמבטיה ואת הרקמות.
    1. עבור דגמים יציבים: להשתמש באותה לחצי נוזל יעילים וריכוזי סחוס האמבטיה שמעליה תוך הגדלת FCD כדי הערך הרצוי שלה.
    2. עבור דגמים חולפים: ליצור סופי-אמבטיה-בחש היטב על ידי שמירה על מקדם דיפוזיה המומס באמבטיה הגבוהה מספיק. להזריק אתמומס מהממשק-האוויר באמבטיה לאמבטיה כדי להגיע לערך הריכוז הרצוי שלה.
    3. חלוף: להסיר את המצב בגבול מומס ריכוז שנקבע בשלב הקודם ולחזור קדם הדיפוזיה של מהמרחץ הסופי אל מקדם הדיפוזיה שלה בפועל.
    4. הפעל את המודל כדי להשיג עקומות ריכוז בזמן מומסות מבוססות על FCDs שיושמה מקדמי דיפוזיה באזורי סחוס שונים.
  6. ממשק FEBio-MATLAB
    1. לפתח קוד MATLAB לבצע סימולציה אוטומטית FEBio ועקומות הריכוז בזמן העלילה (ממשק FEBio-MATLAB) 8, 9.
    2. שינוי מקדם דיפוזיה FCDs באזורי סחוס באמצעות ממשק FEBio-MATLAB. הפעל מודלי FEBio ולחלץ עקומות ריכוז בזמן מומס 8, 9.
    3. השווה את עקומות ריכוז בזמן המומסת שהושג עם ניסיוניערכות נתונים ולקבל של מקדמי דיפוזיה FCDs באזורי סחוס שונים המבוססים על שורש מינימום טעות ריבועית ממוצעת (RMSE) 8, 9.

figure-protocol-1
איור 1: הגדרת ניסוי. א) הליך החילוץ לדוגמא באמצעות מקדח מחוייט. B) Micro-CT הליך הדמיה לפקח תהליך דיפוזיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-protocol-2
איור 2: סכמטי.א) עיצוב ניסיוני. B) מודל חישובי Multi-zone מורכב באמבטיה הסופית, שטחי, באמצע העמוק האזורית של סחוס הרשת מזוהית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות הנציג הניתנות כאן הם אמצו מן המחקרים קודמים 6, 8, 9, 16.

בשנת OA, הסחוס במפרק עובר שינויים משמעותיים והכי חשוב אובדן GAG, ונזק קולגן הפיברילות 17, 18,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצגנו פרוטוקול ניסוי בשילוב עם הליך דוגמנות אלמנטים סופי ללמוד את הדיפוזיה של מומסים ניטראליים והואשמו פני סחוס במפרק. על פי המחקרים האחרונים שלנו, הדגמים המוצעים יכולים לתאר במדויק את ההובלה של שניהם ניטראלי (-המומס פאזי) טעון שלילי (מרובה מצבים) מומס פני אזורים שונים של סחוס במפרק 8, 9. הוא האמין נרחב כי סחוס במפרק הופך למוגבל תפקודי דרך אובדן הרכיבים החיוניים שלה כגון מקרומולקולות GAG הטעונה שלילי כמו גם סיבים קולגן במה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להביע את תודתם ואן דן ברג מר Jeroen ומר מתאייס Wassink מקבוצת מכניקה פיתוח ב UMC אוטרכט על עזרתם גלישת תהליך של אטמי osteochondral. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם קרן דלקת פרקים הולנדית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
HexabrixGuerbet15HX005Dחומר ניגוד טעון שלילי
VisipaqueGE בריאות12570511חומר ניגוד Nuetral
PBS (Phosphate-buffered Saline)טכנולוגיות חיים10010023
בינוני מיקרו-CTפרקין אלמרניטור דיפוזיה
אוסמומטר נקודת הקפאהמתקדם מכשיריםמדידת אוסמולליות תמיסה

מקורות

  1. Arkill, K. P., Winlove, C. P. Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).
  2. Chin, H. C., Moeini, M., Quinn, T. M. Solute transport across the articular surface of injured cartilage. Arch Biochem Biophys. 535 (2), 241-247 (2013).
  3. Leddy, H. A., Guilak, F. Site-specific effects of compression on macromolecular diffusion in articular cartilage. Biophys J. 95 (10), 4890-4895 (2008).
  4. Leddy, H. A., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Annals of Biomedical Engineering. 31 (7), 753-760 (2003).
  5. Gu, W. Y., Yao, H. Effects of hydration and fixed charge density on fluid transport in charged hydrated soft tissues. Ann Biomed Eng. 31 (10), 1162-1170 (2003).
  6. Pouran, B., Arbabi, V., Zadpoor, A. A., Weinans, H. Isolated effects of external bath osmolality, solute concentration, and electrical charge on solute transport across articular cartilage. Medical Engineering and Physics. 38 (12), 1399-1407 (2016).
  7. Kulmala, K. A. M., et al. Diffusion coefficients of articular cartilage for different CT and MRI contrast agents. Medical Engineering & Physics. 32 (8), 878-882 (2010).
  8. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of Neutral Solute Across Articular Cartilage: The Role of Zonal Diffusivities. Journal of Biomechanical Engineering. 137 (7), 071001-071001 (2015).
  9. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. J Biomech. 49 (9), 1510-1517 (2016).
  10. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined artificial neural networks for robust estimation of the diffusion coefficients across cartilage. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
  11. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined inverse-forward artificial neural networks for fast and accurate estimation of the diffusion coefficients of cartilage based on multi-physics models. Journal of Biomechanics. , (2016).
  12. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  13. Holzapfel, G. A., Kuhl, E. Ch. 17. Computer Models in Biomechanics. , Springer. Netherlands. 231-249 (2013).
  14. Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Multiphasic Finite Element Framework for Modeling Hydrated Mixtures With Multiple Neutral and Charged Solutes. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (11), 111001-111001 (2013).
  15. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of neutral solute across articular cartilage and subchondral plate. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
  16. Pouran, B., Arbabi, V., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of multiphysics models to efficient design of experiments of solute transport across articular cartilage. Comput Biol Med. 78, 91-96 (2016).
  17. Hosseini, S. M., Wu, Y., Ito, K., Donkelaar, C. C. The importance of superficial collagen fibrils for the function of articular cartilage. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 41-51 (2013).
  18. Alexopoulos, L. G., Williams, G. M., Upton, M. L., Setton, L. A., Guilak, F. Osteoarthritic changes in the biphasic mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix in articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (3), 509-517 (2005).
  19. Felson, D. T., et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: the disease and its risk factors. Ann Intern Med. 133 (8), 635-646 (2000).
  20. Kokkonen, H. T., Jurvelin, J. S., Tiitu, V., Toyras, J. Detection of mechanical injury of articular cartilage using contrast enhanced computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 19 (3), 295-301 (2011).
  21. Raya, J. G., et al. Diffusion-tensor imaging of human articular cartilage specimens with early signs of cartilage damage. Radiology. 266 (3), 831-841 (2013).
  22. Tavakoli Nia, H., et al. Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties. ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).
  23. Arbabi, V., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Estimation of cartilage properties using indentation tests, finite element models, and artificial neural networks. 11th World Congress on Computational Mechanics & 5th European Conference on Computational Mechanics, Barcelona, Spain, , (2014).
  24. Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks. Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).
  25. Kokkonen, H. T., et al. Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).
  26. Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage. Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).
  27. Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro. Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).
  28. Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).
  29. Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).
  30. Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Micro CT
ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.