באמצעות רנטגן קריסטלוגרפיה, ביופיזיקה, מבחנים תפקודיים לקביעת הכרת קולטן מנגנוני שלטון תאי T של אנטיגנים הסרטן

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטות שאנו משתמשים בהן בדרך כלל במעבדה כדי לקבוע כיצד אופי האינטראקציה בין קולטן תאי T לאנטיגנים של גידול, המוצגים על ידי אנטיגנים של לויקוציטים אנושיים, שולט בפונקציונליות של תאי T; שיטות אלה כוללות ייצור חלבונים, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ביופיזיקה וניסויים פונקציונליים בתאי T.

תקציר

לימפוציטים ציטוטוקסיים CD8+ אנושיים (CTLs) ידועים כממלאים תפקיד חשוב בבקרת הגידול. על מנת לבצע פונקציה זו, קולטן תאי T (TCR) המתבטא על פני התא חייב לזהות תפקודית פפטידים שמקורם בגידול (pHLA) של אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA). עם זאת, אנו ואחרים הראינו שרוב ה-TCRs נקשרים באופן תת-אופטימלי לאנטיגנים של הגידול. חשיפת המנגנונים המולקולריים המגדירים את ההכרה הלקויה הזו יכולה לסייע בפיתוח טיפולים ממוקדים חדשים העוקפים את החסרונות הללו. אכן, טיפולים קיימים שחסרים את ההבנה המולקולרית הזו לא היו יעילים באופן אוניברסלי. כאן, אנו מתארים שיטות שאנו משתמשים בהן בדרך כלל במעבדה כדי לקבוע כיצד אופי האינטראקציה בין TCRs ו-pHLA שולט בפונקציונליות של תאי T. שיטות אלו כוללות יצירת TCRs מסיסים ו-pHLA ושימוש בריאגנטים אלה לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ניתוח ביופיזיקלי וצביעה של תאי T ספציפיים לאנטיגן עם מולטימרים pHLA. באמצעות גישות אלה ובהנחיית ניתוח מבני, ניתן לשנות את האינטראקציה בין TCRs ל-pHLA ולאחר מכן לבדוק כיצד שינויים אלה משפיעים על זיהוי אנטיגן תאי T. ממצאים אלה כבר עזרו להבהיר את מנגנון זיהוי תאי ה-T של מספר אנטיגנים לסרטן ויכולים לכוון את הפיתוח של פפטידים משתנים ו-TCRs מותאמים לטיפולים חדשים בסרטן.

מבוא

קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן כבר, ותמשיך להיות, טכניקה חזקה מאוד להבין את אופי האינטראקציות קולטן ליגנד. עצם העובדה שאנו רואים את יחסי הגומלין הללו בפירוט אטומי, לא רק שזה אפשרי לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים בתהליכים ביולוגיים רבים, אבל אפשר גם לשנות ממשקי מגע ישיר לטובת הטיפול. יחד עם טכניקות כגון תהודה plasmon פני השטח calorimetry טיטרציה בידוד תרמי (אם להזכיר רק כמה), שינויים כאלה לאחר מכן ניתן לנתח biophysically להעריך את ההשפעה הישירה על זיקה מחייבת, קינטיקה אינטראקציה, התרמודינמיקה. לבסוף, על ידי ביצוע ניסויים תפקודיים על סוגי תא רלוונטיים, תמונה מפורטת של ההשפעה המולקולרית ופונקציונלית של שינויי האינטראקציות ליגנד רצפטור ניתן לדלות, מתן מידע מכניסטית ספציפי מאוד. בסך הכל, אלו סוגים של שיטות לספק תמונה ברזולוציה אטומית המאפשרת להרתיע mination של איך ביולוגי מערכות לעבוד, עם השלכות דיילת התקדמויות אבחון וטיפול.

המעבדה שלנו שגרתי משתמשת בטכניקות הללו כדי ללמוד את קולטנים אשר מתווכים חסינות תאי T אנושיים לפתוגנים וסרטן, למחלות אוטואימוניות, ובמהלך ההשתלה. כאן, אנו מתמקדים בתגובה CD8 ⁺ T-cell האדם לסרטן, בתיווכו של אינטראקציה בין רצפטור תאי T (TCR) ו אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) פפטידים -restricted הנגזרות הגידול (pHLA). זה חשוב כי, אם כי תאי CD8 ⁺ T מסוגלים למקד תאים סרטניים, אנו ואחרים הראו בעבר כי TCRs נגד הסרטן להיקשר תת-אופטימלית כדי pHLA ¹ מאותו המקור ^{שלהם, 2.} לפיכך, במעבדות רבות ניסו לשנות גם את ^{3 TCR, 4, 5} או ליגנד פפטיד ^6,class = "Xref"> ^{7, 8} על מנת להגדיל immunogenicity ו לתאי סרטן מטרה טובה יותר. עם זאת, גישות אלה אינן תמיד יעילות יכולות להיות תופעות לוואי חמורות, כולל רעילות מחוץ היעד ^{4, 9, 10.} מחקר נוסף לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים הכרה תא T של אנטיגנים סרטניים יהיה חיוני להתגבר הגירעונות הללו.

במחקר הנוכחי, התמקדנו התגובות נגד תאים מלנומה עצמיים על ידי תאי CD8 ⁺ T ספציפיים עבור שבר של אנטיגן מלנוציט בידול גליקופרוטאין 100 (gp100), gp100 _280-288, שהציגו HLA-A * 0201 (הנפוץ ביותר אני אדם pHLA בכיתה -expressed). אנטיגן זה כבר מטרה למדה נרחב עבור חיסונים מלנומה פותח פפטיד שנקרא "heteroclitic" שבו ולין מחליף אלאניןעוגן בעמדה 9 כדי לשפר את יציבות pHLA ^11. גישה זו הייתה לשמש כדי לשפר את הגיוס של תאי-ההרג תגובתי מלנומה במבחנה שמשה בהצלחה בניסויים קליניים ^12. עם זאת, שינויי שאריות פפטיד יכולים להיות השפעות בלתי צפויות על סגוליות תאי T, שהפגינו את היעילות הירודה של רוב פפטידים heterolitic במרפאת ^{6, 13.} ואכן, עוד טופס heteroclitic של gp100 _280-288, שבו שאריות פפטיד Glu3 הוחלף עבור עלא, ביטל הכרה על ידי האוכלוסייה polyclonal של gp100 _280-288 תאים -specific T ^{14, 15.} אנחנו הוכחנו בעבר כי אפילו שינויים קלים שאריות עוגנות פפטיד יכולים לשנות T-cell הכרה משמעותי בדרכים בלתי צפויות ^{6, 16.} לפיכך, המחקר התמקד לבנותing תמונה מפורטת יותר של אופן שבו תאי CD8 ⁺ T מכירים gp100 וכיצד שינויים של האינטראקציה בין TCRs ו pHLA יכול להשפיע בפונקציה זו.

הנה, אנחנו שנוצרנו מאוד טהורות, צורות מסיסות של שתי TCRs הספציפית gp100 _280-288 שהציג HLA-A * 0201 (A2-YLE), כמו גם צורות הטבעיות ושינה של pHLA. ריאגנטים אלה שמשו להפקת גבישי חלבון כדי לפתור את המבנה האטומי המשולש של TCR אדם מורכב עם טופס heteroclitic של A2-YLE, וכן השנייה של pHLAs המוטציה בצורת unligated. לאחר מכן השתמשו בגישת סריקת פפטיד כדי להדגים את ההשפעה של החלפות פפטיד על TCRs ידי ביצוע מעמיק ניסויי biophysical. לבסוף, שעוררנו קו מהונדס גנטי CD8 + T-cell, ישכתב להביע אחד TCRs A2-YLE הספציפי, על מנת לבצע ניסויים תפקודיים כדי לבדוק את ההשפעה הביולוגית של השינויים פפטיד השונים. נתונים אלה מראים כי אפילו מודיםfications כדי פפטיד שאריות כי הם מחוץ מוטיב מחייב TCR יכול להיות עקום על בלתי צפויות השפעות על שאריות פפטיד סמוכים לבטל TCR מחייב והכרה T-cell. הממצאים שלנו מייצגים את הדוגמא הראשונה של המנגנונים המבניים שבבסיס הכרה תא T של מטרה הטיפולית חשובה זו למלנומה.

פרוטוקול

1. ביטוי חלבון

1. הפוך בונה גן לייצור המסיס TCRs ו pHLAs, כמתואר בפירוט בעבר ^{17, 18.} לעצב כל לבנות עם 'BamH1 וכן 3' 5 אתר EcoR1 הגבלה להכנסה לתוך וקטור pGMT7.
2. Transform E. coli רוזטה (DE3) pLysS עם וקטור הפלסמיד הנגזרות pGMT7 המכיל את רצף המקודד את החלבון של הריבית על ידי דוגרים 1 μL של 50-200 ng / פלסמיד μL עם 5 μL של E.coli במשך 5 דקות ב 4 ° C , 2 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, 5 דקות ב 4 ° C, ואת הצלחת החוצה לילה בשעה 37 ° C על צלחת אגר LB בתוספת 50 מ"ג / L carbenicillin.
3. פיק מושבות הפרט לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד ב 30 מ"ל של התקשורת TYP (tryptone 16 גר '/ ל, 16 גר' / ל תמצית שמרים, ו -5 גר '/ ל HK ₂ O ₄₎ בתוספת 100 מיקרומטר carbenicillin עד ההשעיה מגיע דה אופטיnsity (OD ₆₀₀₎ של בין 0.4 ו -0.6.
4. להשרות ייצור החלבון aliquot 5 מ"ל על ידי החדרת 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) למשך 3 שעות. שמור 20 μL של ההשעיה עם ובלי אינדוקציה עבור ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן ניתוח (SDS-PAGE) ו להכתים את הג'ל.
5. להוסיף תרבויות המתנע עד 1 ליטר של TYP בתוספת 100 מיקרומטר carbenicillin ולגדול תאים כמתואר לעיל בשלב 1.3 עד ההשעיה מגיע OD ₆₀₀ בין 0.4 ו -0.6.
6. להשרות ביטוי חלבון במשך 3 שעות עם 0.5 מ"מ IPTG. צנטריפוגה התאים במשך 20 דקות ב 3000 XG ויוצקים את supernatant בזהירות.
7. ממיסים את גלולה ב 40 מ"ל של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס, pH 8.1; 10 מגנזיום כלוריד מ"מ, MgCl _2; 150 מ"מ NaCl; ו -10% גליצרול), sonicate על קרח למשך 30 דקות בהספק 60% בהתבסס על רווח של 2 , ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות עם 0.1 g / L DNase.
8. פנקו את susפנסיה המכיל חלבונים בצורת גופים הכללה (IB) עם 100 מ"ל של חיץ לשטוף (0.5% טריטון X-100; 50 מ"מ טריס, pH 8.1; 100 mM NaCl ו -10 מ"מ EDTA).
9. צנטריפוגה מדגם במשך 20 דקות ב 4 ° C ו- 8,000 XG ויוצקים את supernatant בזהירות. Re- להשעות גלולה ב 100 מ"ל של חיץ מחדש ההשעיה (50 מ"מ טריס, pH 8.1; 100 mM NaCl ו -10 מ"מ EDTA, pH 8.1), צנטריפוגות כמו קודם ב 8000 XG, ויוצקים את supernatant בזהירות.
10. לבסוף, לפזר את גלולה ב 10 מ"ל של חיץ guanidine (6 M guanidine; 50 מ"מ טריס, pH 8.1; 2 מ"מ EDTA, pH 8.1; ו 100 מ"מ NaCl) ולמדוד את ריכוז החלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

2. pHLA ו TCR refolding

1. עבור מקפלת pHLA, לערבב 30 מ"ג של HLA-A2 (או HLA-A2 עם תג ביוטין) IBS, 30 מ"ג של β2m IBS, ו -4 מ"ג של פפטיד למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים בנפח סופי של 6 מ"ל של חיץ guanidine בתוספת 10 מ"מ dithiothreitol(DTT).
2. ליזום חלבון refolding ידי דילול תערובת הקודם 1 ליטר של חיץ ולקפל HLA מראש צונן (50 מ"מ טריס, pH 8.1, 400 מ"מ L- ארגינין; 2 מ"מ EDTA, pH 8.1; 6 מ"מ cysteamine; ו -4 מ"מ cystamine).
3. השאירו את HLA ולקפל ערבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ולאחר מכן להעביר אותו לתוך 12.4 kDa MWCO (משקל מולקולרי חתוכים) צינור דיאליזה דיאליזה פעמיים במשך 24 שעות נגד 20 L של 10 מ"מ טריס, pH 8.1.
4. עבור מקפלת TCR, לערבב 30 מ"ג של שרשרת α TCR IBS ו -30 מ"ג של שרשרת TCR β IBS במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ב 6 מ"ל של חיץ guanidine בתוספת 10 מ"מ DTT.
5. ליזום refolding חלבון על ידי דילול התערובת TCR מפוגל ב 1 ליטר של חיץ ולקפל TCR מראש צונן (50 מ"מ טריס, pH 8.1, 2.5 M אוריאה; 2 EDTA מ"מ, pH 8.1; 6 cysteamine מ"מ; ו -4 מ"מ cystamine) עבור 3 ח.
6. מעבירים את ולקפל לתוך צינור דיאליזה 12.4-kDa MWCO ו dialyze פעמיים במשך 24 שעות נגד 20 L של 10 מ"מ טריס, 8.1 pH.
7. סנן הוא pHLA או נ"צ TCRבני באמצעות מסנן הממברנה 0.45 מיקרומטר עבור השלבים לטיהור.

3. טיהור ידי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC)

1. טען את הכנת ולקפל מסוננים (או pHLA או TCR) על טור שרף חילוף 7.9 מ"ל, 50 מיקרומטר אניון מראש equilibrated עם 20 מ"ל של 10 מ"מ טריס, pH 8.1 על מערכת כרומטוגרפיה גמיש ואינטואיטיבי.
2. Elute החלבון ב 5 מ"ל / דקה עם שיפוע מלח (0-500 מ"מ NaCl ב 10 מ"מ טריס, pH 8.1, מעל 8 כרכים עמודה) ולאסוף שברים 1 מ"ל.
3. לנתח את השברים המתאים החלבון של עניין על ידי SDS-PAGE, בריכת שברים המכיל את החלבון של עניין יחד, ולרכז אותם למטה כדי 500 μL עם 10 kDa MWCO 20 או 10 kDa MWCO 4 על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 4000 XG , השליך את הזרימה דרך.
4. טען את הכנות חלבון המרוכזות ללולאת הזרקת מיליליטר 2 על עמודת כרומטוגרפיה הדרת גודל 24 מיליליטר מראש equilibrated עם האפליקציהחיץ elution ropriate: בופר פוספט (PBS), HBS (10 HEPES מ"מ, pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 3.4 mM EDTA; ו 0.005 פעילי שטח%), או חיץ קריסטל (10 מ"מ טריס, pH 8.1, ו -10 מ"מ NaCl ).
5. Elute החלבונים בקצב זרימה של 0.5 mL / min מעל 1 נפח הטור; לאסוף 1 שברים מ"ל המכיל את החלבון של עניין מאומת על ידי SDS-PAGE.
   הערה: שיטות אלה שימשו להפקת TCRs PMEL17 TCR ו gp100 מסיסים, כמו גם את כל pHLAs השתמשו במחקר זה: HLA-A * 0201 עם YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), או YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

ניתוח 4. Surface Plasmon תהודה (SPR)

1. ביצוע ניתוח מחייב שיווי משקל או ניתוח תרמודינמי באמצעות מערכת ניתוח אינטראקציה מולקולרית מצויד בשבב חיישן CM5 ^19.
2. הפעל את שבב CM5 ידי fגועות של 1: תערובת 1 של 100 מ"מ N-hydroxysuccinimide (NHS) ו -400 מ"מ 1-אתיל-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) במשך 10 דקות בקצב זרימה של 10 μL / דקה ב -25 ° ג
3. כ טען 5,000 יחידות התגובה (RU) של streptavidin (110 μL של 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​אצטט 10 מ"מ, 4.5 pH) על ידי קוולנטיים המקשר אל פני השטח שבב בכל ארבעת זרימה תאים ולהשתמש 100 μL של 1 M hydrochloride ethanolamine לנטרל באף אחת מקבוצות תגובתי נותרים.
4. הזוג כ 500-600 RU של pHLA, ב ~ 1 מיקרומטר חיץ מסחרי (המסופק על ידי היצרן), לשבב חיישן CM5 בכל בספיקה איטית של 10 μL / דקה כדי להבטיח פיזור אחיד על פני השבב.
5. להרוות את פני השבב עם 1 ביוטין מ"מ במאגר מסחרי (המסופקים על ידי היצרן) עבור 60 s.
6. להזריק עשרה דילולי סדרה של TCRs המסיס רחב תא הזרימה הרלבנטיים בספיקה גבוהה של 30 μL / דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
7. חשב את קבוע מחייב שיווי משקל(K _D (E)) ערכים באמצעות התאמת עקומה ליניארית (y = (P1x) / (P2 + x)) ^20.
   הערה: יחידות y = תגובה, x = ריכוז אנליסט, _{מקסימום} P1 = r, P2 = K _D.
8. ביצוע ניתוח קינטיקה בהנחה 1: לאנגמיור 1 מחייב להתאים את הנתונים באמצעות אלגוריתם גלובלי-fit בחבילת התוכנה ^2.
9. בצע ניסויי תרמודינאמיקה על ידי חזרה על שיטה זו בטמפרטורה הבאה: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, 30 ° C ^19.
10. השתמש ערכי _D K נקבע על ידי SPR בטמפרטורות שונות לחשב ΔG ° באמצעות המשוואה התרמודינמית סטנדרטי (ΔG ° = -RTlnK _D) ^19.
    הערה: R = גז קבוע, T = טמפרטורת K, ln = לוג טבעי.
11. חשב את הפרמטרים התרמודינמית פי המשוואה גיבס-הלמהולץ (ΔG ° = ΔH - TΔS °) ^19.
12. מגרש את האנרגיות חינם מחייב, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), כנגד הטמפרטורה (K) באמצעות רגרסיה ליניארית כדי להתאים את המשוואה שלוש פרמטר (y = ΔH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) ^19.
    הערה: y = הטמפרטורה K, x = ΔG °.

5. Calorimetry טיטרציה איזו תרמים (ITC)

1. בצע ניסויים ITC באמצעות קלורימטר טיטרציה בידוד תרמי. להזריק 30 מיקרומטר pHLA לתוך התא קלורימטר והעומס 210 מיקרומטר מסיסים TCR לתוך המזרק. השתמש התנאים חיץ הבאים: 20 מ"מ Hepes (pH 7.4) המכיל 150 mM NaCl.
2. בצעו 20 זריקות TCR, כל אחד בנפח 2 μL. לחשב ΔH ו- K _D באמצעות תוכנת ניתוח.

6. התגבשות, איסוף נתוני השתברות, ואת דגם חידוד

1. בצע ניסויי התגבשות באמצעות רובוט התגבשות.
2. לגדול גבישים ידי VAPאו דיפוזיה על 18 מעלות צלזיוס באמצעות טכניקת הירידה יושבת בצלחת 96-היטב עם מאגר המכיל 60 μL של חיץ התגבשות (לייקר אמא) ^21.
3. לרכז את pHLA המסיס לכ -10 מ"ג / מיליליטר (0.2 מ"מ) במאגר קריסטל על ידי ספינינג ב 3000 XG ב concentrator צנטריפוגלי מולקולרי 10-kDa משקל חתוך.
4. עבור המבנים שיתוף מורכבים, לערבב את TCR ו pHLA ביחס של 1: 1 יחס טוחנת כדי להשיג פתרון חלבון כ 10 מ"ג / מ"ל ​​(0.1 מ"מ).
5. הוספת 200 nL של pHLA לבד, או 1: תערובת יחס טוחנת 1 של TCR ו pHLA, 200 nL של כל פתרון מאגר ממסך ההתגבשות באמצעות רובוט התגבשות וציון עבור גבישים תחת מיקרוסקופ לאחר 24 שעות, 48 שעות, 72 h, ולאחר מכן פעם בשבוע.
6. גבישים יחידים קציר ידי מקבע אותם באופן ידני קריו-לולאות תחת מיקרוסקופ קריו-לקרר אותם על ידי השריית ואחסונם בחנקן נוזלי (100 K).
   הערה: גבישים טוענים לוקח קצת pracטייס, והחלטה אשר גבישים הם טובים מספיק עבור איסוף נתונים בא עם הניסיון. ככלל אצבע, הגדול יותר קבוע גביש, כן ייטב.
7. אסוף נתונים זרם של גז חנקן ב 100 K.
   הערה: נתונים אלה נרכשו על מקור אור היהלום (DLS) המתקן הלאומי למדע סינכרוטרון בבריטניה.
8. לנתח את הנתונים על ידי אומדן עוצמות השתקפות עם xia2 הן באמצעות ²² MOSFLM ואת XDS חבילות ^23, ולאחר מכן קנה המידה של נתונים עם SCALA או ללא מטרה ²⁴ ואת חבילת CCP4 ^25.
9. לפתור את המבנים עם החלפה מולקולרית באמצעות PHASER ^26.
10. התאם את המודל עם קרסול ²⁷ ולשכלל את המודל עם REFMAC5 ^28.
11. כן ייצוגים גראפיים עם PyMOL ^29.
12. חשב את המגעים באמצעות "צור קשר"תכנית בחבילת CCP4. השתמש חתוך 4 עבור אנשי קשר ואן דר ואלס ו 3.4 Å חתוכים לאג"ח מימן וגשרי מלח.
13. חישוב השלמת שטח באמצעות התכנית "SC" בחבילת CCP4.
14. חשב את זווית המעבר של המתחם TCR-pHLA, כמתואר ^30.
    הערה: במחקר זה, הנתונים השתקפות קואורדינטות המודל הסופי הופקדו עם מסד הנתונים PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4, ו- A2 PDB -YLE-5A: 5EU5).

תוצאות

באמצעות השיטות שתוארו לעיל, שעוררנו מסיסים TCR (טבלה 1) ומולקולות pHLA לנהל מעמיק בניתוחים מולקולריים של הכרה gp100 _280-288 ידי תאי CD8 ⁺ T. מערכת ביטוי החיידק שונה שימש ליצור IBS מסיס לכל שרשרת נפרדת של שני TCRs (שרשראות α ו β) ו pHLAs (שרשרת α ו β2m). שיטה זו יש את היתרון של להיות זול יחסית וקל להקים ומייצרת תשואות גדולות של חלבון (100-500 מ"ג / L של תרבות). כמו כן, החלבונים המסיסים הם יציבים מאוד אם מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמשו בטכניקת refolding וטיהור ומבוססת לייצר חלבונים פונקציונליים, הומוגנית, מסיסים. שיטה זו שימושית ליצירת חלבונים לניסויי biophysical, מבניים והמכשירים סלולריים, כמו גם חומרים כימיים שיכול לשמש לאבחון או רפוי.

-together.within-page = "1"> כאן, השתמשתי חלבונים אלה לבצע ניסויי mutagenesis סריקת אלאנין פני עמוד השדרה פפטיד ומוערך TCR מחייב זיקה באמצעות תהודת plasmon פני השטח (SPR) ניסויים (טבלה 2). assay זה הוכיח בו שאריות של פפטיד היו חשוב ביותר לכריכת TCR. ברזולוציה גבוהה המנתח של זיקות מחייבות שימוש בטכניקה זו הוא מאוד שימושי לקביעת מנגנונים ביולוגיים השולטים אינטראקציות חלבונים, כמו גם לניתוח הזיקה המחייבת של מולקולות טיפוליות.

לאחר מכן, אנו גבשנו TCR המסיס ספציפי מלנומה (PMEL17 TCR) בקומפלקס עם שונה גידול נגזר pHLA (A2-YLE-9V) כדי לחקור את המצב המחייב ברזולוציה אטומית (איורים 1 ו -2 ולוח 3). ניסויים אלה מספקים ראיה ישירה של הממשק המחייב בין שתי מולקולות, providinמידע מפתח g על העקרונות שבבסיס המסדירים את האינטראקציה. בנוסף, אנו ערכנו ניתוח תרמודינמי של האינטראקציה היא באמצעות SPR ו- ITC, חושף את התרומות האנרגטיות שאפשרו מחייב (איורים 3). ניתוחים אלה נתמכו עוד יותר על ידי תיאור ברזולוציה גבוהה של טביעת רגל הקשר בין שני החלבונים (איור 4 ולוח 4).

לאחר מכן, אנו לפתור את המבנים של מולקולות pHLA unligated, הצגת טפסי מוטציה של הפפטיד, חושפים כי מתג מולקולרי יכול להסביר מדוע מוטציות מסוימות בטלו TCR מחייב (איורים 5).

בסך הכל, טכניקות אלה סיפקו נתונים חדשים להדגים את מנגנון המסביר כיצד תאי T מזהים אנטיגן נגזר מלנומה כי הוא מטרה חשובה עבור תרופות נגד סרטן. במובן רחב יותר, טכניקות אלהיכול לשמש כדי לחקור כל אינטראקצית קולטן ליגנד כמעט, בחשיפת מנגנונים ביולוגיים חדשים שעשויים להיות ממוקד עבור מקדמות טיפוליות חדשניות.

איור 1: ניתוח חלקת צפיפות. התוכניות בעמודה השמאליות להשמיט מפות, בה נראית הדוגמנית הייתה מעודנת בהעדר הפפטיד. צפיפות הבדל היא קווים מתארת ​​על 3.0 סיגמא, קווי מתאר חיוביים מוצגים ירוקים, וקווי מתאר שלילי הם אדומים. העמודה הימנית מציגה את המפה שנצפתה 1.0 סיגמא (כפי שמוצגת רשת אפורה סביב ייצוגים מקלים של שרשרות החלבון) לאחר עידון עוקב באמצעות מעצורי סימטריה בלתי crystallographic אוטומטיים מיושמים על ידי REFMAC5. (א) מודל PMEL17 TCR-A2-YLE-9V עם CDR3 TCR לולאות בצבע כחול (שרשרת α) וכתום (שרשרת β) ואת פפטיד בירוק. (ב) מודל A2-YLE עםהפפטיד בצבע ירוק כהה. (ג) מודל A2-YLE-3A עם כתום פפטיד צבעוני (עבור A2-YLE-3A, היו 2 מולקולות ביחידה סימטרית, אך אלה היו כמעט זהים מבחינת מפות להשמיט וצפיפות, כך שרק להעתיק 1 מוצג כאן). (ד) מודל A2-YLE-5A עם ורוד צבעוני פפטיד. הודפס מחדש באישור בהפניה ^31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: מבט כולל של TCR PMEL17 בקומפלקס עם A2-YLE-9V. (א) ייצוג קריקטורה של המתחם PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. TCR הוא בצבע שחור; לולאות TCR CDR מוצגים (אדום, CDR1α; ירוק כהה, CDR2α; כחול, CDR3α; צהוב, CDR1β; אקווה, CDR2 ^6 ;; כתום, CDR3β); ואת-A HLA * 0201 מתואר באפור. הפפטיד YLE-9V מיוצג על ידי מקלות ירוקים. (ב) שטח ולתקוע ייצוגים של שאריות של CDR PMEL17 TCR לולאות (בצבעים כמו א) כי קשר עם משטח A2-YLE (A2, אפור; YLE-9V, מקלות ירוקים). הקו האלכסוני השחור מציין את זווית המעבר של TCR ביחס לציר הארוך של הפפטיד YLEPGPVTV (46.15 °). (C) טביעת רגל לתקשר של TCR PMEL17 על משטח A2-YLE-9V (A2, אפור); סגול וירוק (משטח ומקלות) מצביעים על-A HLA * 0201 ושאריות YLE, בהתאמה, פונה על ידי TCR gp100. Cut-off של 3.4 Å לאג"ח מימן 4 עבור אנשי קשר ואן דר ואלס. הודפס מחדש באישור ההפניה 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: ניתוח תרמודינמיים של PMEL17 אינטראקציה TCR-A2-YLE. (א) שיווי משקל מחייב PMEL17 TCR התגובות A2-YLE ב 5, 12, 18, 25, ו -37 מעלות צלזיוס על פני תשעה לעשרה דילולים סדרתי TCR. נתונים גולמיים מצויד SPR (בהנחה 1: 1 לאנגמיור מחייב) מוצגים הבלעה של כל עקומה ושימשו לחישוב K _על ו- K _את הערכים באמצעות אלגוריתם גלובלי-fit (BIAevaluation 3.1). הטבלה מציגה שיווי משקל מחייב (K _D (E)) וקבועים הקינטית מחייב (K _D (K) = K _off / K _on) בכל טמפרטורה. שיווי המשקל מחייב קבוע (K _D, מיקרומטר) ערכים חושבו באמצעות התאמה ליניארית (y = (P1x) / (P2 + x)). (ב) הפרמטרים התרמודינמית חושבו על פי המשוואה גיבס-הלמהולץ (ΔG ° = ΔH ° - TΔS °). אנרגיות חינם מחייבות, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK _D), היו זממו נגד טמפרטורה (K) באמצעות רגרסיה ליניארית כדי להתאים את המשוואה שלוש פרמטר (y = ΔH ° + ΔCp ° * (x-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). אנתלפיה (ΔH °) ואנטרופיה (TΔS °), בעמ '298 K (25 מעלות צלזיוס) מוצגים קלוריות / mol ו חושבו על ידי רגרסיה שאינו ליניארי של הטמפרטורה (K) זממו נגד אנרגיה חופשית (ΔG °). (C) טיטרציה קלוריות איזו תרמים (ITC) מדידות לאינטראקציה PMEL17 TCR-A2-YLE. אנתלפיה (ΔH °) ואנטרופיה (TΔS °), בעמ '298 K (25 מעלות צלזיוס) מוצגים קלוריות / mol. הודפס מחדש באישור בהפניה ^31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אונג> איור 4: פוקוס לולאות CDR PMEL17 על Pro4 שאריות פפטיד, Val7, ו Thr8. (א) ייצוג סכמטי של הקשר בין הפפטיד YLE-9V ואת שאריות לולאה CDR PMEL17 (בצבעים כמו איור 2 א). המספרים בתחתית בלוח להראות את הקשר המוחלט בין TCR ואת פפטיד. (ב) מגעים בין TCR PMEL17 ואת פפטיד YLE-9V (מקלות ירוקים) מראה את ואן דר קשר ואלס (שחור קווים מקווקווים) ואת קשרי מימן (אדום קווים מקווקווים) שנעשו על ידי TCR CDR3α (הכחול), CDR1β (צהוב) , CDR2β (אקווה), ו CDR3β (כתום) לולאות. בחלונית התחתונה היא מבט מקרוב של המגעים בין YLE Pro4, Val7, ו Thr8, בהתאמה, ושאריות לולאה TCR CDR (מקלות בצבעים כמו באיור 1 א). Cut-off של 3.4 Å לאג"ח מימן 4 עבור אנשי קשר ואן דר ואלס. הודפס מחדש באישור בהפניה ^31.rge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: השוואה קונפורמציה של YLE, YLE-3A, ו- A2-YLE-5A פפטידים מוגש ע"י HLA-A * 0201. (א) YLE (מקלות ירוקים כהים) ו YLE-3A (ומקלוני) יישור פפטיד על ידי החפיפה של HLA-A * סליל α1 0201 (קריקטורה אפורה). שאריות ארוזות מצביעים על מוטציה של Glu3 לתוך אלאנין. את ריבועי להראות כיצד החלפת Glu3Ala גורמת לשינוי בעמדה (חץ שחור) של Pro4 שאריות שכן במבנה A2-YLE-3A לעומת מבנה A2-YLE. (ב) YLE (מקלות ירוקים כהים) ו YLE-5A (מקלות ורודים) יישור פפטיד על ידי החפיפה של HLA-A * סליל α1 0201 (קריקטורה אפורה). שאריות התאגרף לציין את המוטציה של גליצין 5 לתוך אלאנין. הודפס מחדש באישור מהתייחסות ^{אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

טבלה 1: יישור של TCR CDR3 אזורים של PMEL17, gp100, MPD, ו 296 TCRs ספציפי gp100. הודפס מחדש באישור בהפניה ^31.

רצף פפטיד	פפטיד	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 זיקה K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 אפיnity K D
YLEPGPVTA	YLE	7.6 ± 2 מיקרומטר	26.5 ± 2.3 מיקרומטר
YLEPGPVT V	YLE-9V	6.3 ± 1.2 מיקרומטר	21.9 ± 2.4 מיקרומטר
LEPGPVTA	YLE-1A	15.9 ± 4.1 מיקרומטר	60.6 ± 5.4 מיקרומטר
י.ל. PGPVTA	YLE-3A	לא מחייב	לא מחייב
YLE GPVTA	YLE-4A	19.7 ± 1.3 מיקרומטר	144.1 ± 7.8 מיקרומטר
YLEP PVTA	YLE-5A	> 1 מ"מ	> 1 מ"מ
YLEPG VTA	YLE-6A	11.4 ± 2.7 מיקרומטר	954.9 ± 97.8 מיקרומטר
YLEPGP ת"א	YLE-7A	31.1 ± 4 מיקרומטר	102.0 ± 9.2 מיקרומטר
YLEPGPV A A	YLE-8A	38.1 ± 7.4 מיקרומטר	121.0 ± 7.5 מיקרומטר

טבלה 2: ניתוח זיקה (K _D) של PMEL17 TCR ו gp100 TCR כדי gp100 _280-288 גרסאות פפטיד. הודפס מחדש באישור בהפניה ^31.

פרמטרים	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
קוד PDB </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
סטטיסטיקת מערך נתונים
קבוצת Space	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
פרמטרי תא יחיד (א)	a = 45.52, ב = 54.41, c = 112.12, a = 85.0 °, ב = 81.6 °, G = 72.6 °	a = 52.81, ב = 80.37, c = 56.06, ב = 112.8 °	a = 56.08, ב = 57.63, c = 79.93, a = 90.0 °, ב = 89.8 °, G = 63.8 °	a = 56.33, ב = 79.64, c = 57.74, ב = 116.2 °
מקור קרינה	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
אורך גל (א)	.9763	.9999	.9763	.9763
צפחותמגוון ברזולוציה אדומה (א)	51,87 - 2.02	45.25 - 1.97	43.39 - 2.12	43,42 - 1.54
Outer ההחלטה Shell (א)	2.07 - 2.02	2.02 - 1.97	2.18 - 2.12	1.58 - 154
השתקפות שנצפתה	128.191 (8.955)	99.442 (7.056)	99.386 (7.463)	244.577 (17.745)
השתקפויות ייחודיות	64.983 (4.785)	30.103 (2.249)	49.667 (3.636)	67.308 (4.962)
שלמות (%)	97.7 (96.7)	98.5 (99.3)	97.4 (96.7)	99.6 (99.9)
ריבוי	2.0 (1.9)	3.3 (3.1)	2.0 (2.1)	3.6 (3.6)
I / סיגמא (אני)	5.5 (1.9)	7.2 (1.9)	6.7 (2.3)	13 (2.3)
Rpim (%)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4.5 (35.4)
R מיזוג (%)	7.8 (39.6)	9.8 (50.2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
סטטיסטיקת חידוד
רזולוציה (א)	2.02	1.97	2.12	1.54
אין השתקפויות בשימוש	61,688	28557	47,153	63,875
אין השתקפות סט Rfree	3294	1526	2514	3406
R cryst (לא חתוך) (%)	18.1	19.7	17.2	17.0
R חינם	22.2	25.5	21.1	20.1
שורש ממוצע סטייה רבועה מן הגיאומטריה אידיאלית
אורכי בונד (א)	0.018 (0.019) *	0.019 (0.019) *	0.021 (0.019) *	0.018 (0.019) *
זוויות בונד (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
בסך הכל לתאם שגיאה (א)	.122	.153	.147	.055
סטטיסטיקת ראמאצ'אנדראן
רוב מועדף	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
מוּתָר	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
חריג	2 (0%)	3 (1%)	1 (0%)	2 (0%)

טבלה 3: הפחתת נתונים ועידון לסטטיסטיקה (החלפה מולקולרית). הודפס מחדש באישור בהפניה ^31. הערכים בסוגריים הם עבור פגז הרזולוציה הגבוהה ביותר.

^OH

HLA / פפטיד שאריות	שאריות TCR	מס vdW (≤4Å)	H-אג"ח מס (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tyr1

לוח 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V לתקשר טבלה. הודפס מחדש באישור בהפניה ^31.

דיון

הפרוטוקולים המפורטים כאן מספקים מסגרת לנתיחה מולקולרית תאית של תגובות תאי T בהקשר של כל מחלות אנושיות. למרות שהסרטן היה המוקד העיקרי של מחקר זה, השתמשנו גישות דומות מאוד לחקור תגובות תאי T לוירוסי ^{32, 33, 34, 35, 36, 37} ובמהלך אוטואימוניות ^{38, 39, 40.} יתר על כן, השתמשנו בטכניקות האלה בהרחבה כדי להבין את העקרונות המולקולריים אשר שולטים אנטיגן T-cell הכרה ^{2, 19, 41, 42.} אכן, אופי שינויים בלתי צפויים כדי פפטיד שאריות, אפילו אלהמחוץ של שאריות מגע TCR, הכרת T-cell משפיע יש השלכות חשובות על העיצוב של פפטידים heteroclitic. ממצאים אלו תרמו באופן ישיר לפיתוח של טיפולים T-cell רומן, כולל חיסונים פפטיד ^{6, 43} ו TCRs גבוהה זיקה מלאכותית ^{3, 4, 5, 20, 44,} כמו גם אבחון משופר ^{45, 46, 47.}

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
הדור של חלבון טהור, מאוד פונקציונלי חיוני לכל מהשיטות המתוארות במאמר זה.

שינויים ופתרון בעיות
קשיים ביצירת חלבון טהור מאוד מרבים להתייחס בעת ביותר-pure, מסיס IBS ממערכת ביטוי E. coli. בדרך כלל, שינוי פרוטוקול הביטוי (למשל, גרימה בצפיפויות אופטיות שונות, תוך שימוש קולי זנים שונים א, או באמצעות תצורות מדיה שונות) פותר בעיות אלה.

מגבלות הטכניקה
טכניקות אלה להשתמש מולקולות חלבון מסיס (TCR ו pHLA) אשר מתבטאות בדרך כלל על פני התא. לכן, חשוב להבטיח כי מבניים / ממצאי biophysical עולים בקנה אחד עם גישות הסלולר כדי לאשר משמעות ביולוגית.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
באמצעות השימוש קריסטלוגרפיה וביופיסיקה רנטגן תימוכין באמצעות ניתוח פונקציונלי, אנו ואחרים הוכחנו כי ספציפי TCRs עבור אפיטופים סרטן מאופיינים לרוב זיקות מחייבות נמוכות ^48. זיקה נמוכה זו TCR עשויה לעזור להסביר מדוע תאי T arדואר לא יעיל באופן טבעי בפינוי הסרטן. מבנים אטומיים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים בין TCRs נגד סרטן ו אנטיגנים סרטניים מאותו מקור מתחילים לחשוף את הבסיס המולקולרי זיקה חלשה זו. יתר על כן, מחקרים אלה עשויים להיות מועילים לקביעת המנגנונים העומדים בבסיס ההתערבויות הטיפוליות שנועדו להתגבר על בעיה זו, זריעה לשיפורים עתידיים ^16. במחקר זה, בחנו את המבנה הראשון של αβTCR טבעיים המתחוללים בקומפלקס עם epitope מלנומה-A HLA gp100 * 0201-מוגבל. המבנה, בשילוב עם בחינה המעמיקה biophysical, חשף את מצב המחייב הכולל של האינטראקציה. גם חשפנו מתג מולקולרי בלתי צפוי, אשר התרחש בצורת מוטציה של הפפטיד, כי בטל מחייב TCR (הוערך באמצעות תהודת plasmon פני שטח) ו CD8 ⁺ T-cell הכרה (ניסויים תפקודיים). זה היה אפשרי רק כדי להדגים מנגנון חדש זה של presentati אנטיגן HLAעל שימוש בשיטות ברזולוציה גבוהה המתואר.

יישומים עתידיים או כיוונים אחרי מאסטרינג טכניקה זו
ככלל, התוצאות שלנו להפגין את כוחו של קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ושיטות biophysical בשילוב עם ניתוחים תפקודיים חזקים. באמצעות גישות אלה, אפשר לנתח את מנגנונים מולקולריים שולטים מדויקים הכרת אנטיגן T-cell. אכן, אפשר גם להשתמש בגישה זו כדי לפתור את המבנה של unligated TCRs, המדגים כיצד שינויים מרחביים יכול לשחק תפקיד במהלך אפליה אנטיגן ^{49, 50, 51.} הבנה טובה יותר של הטבע מורכב ודינמי מאוד כי בבסיס אינטראקציות TCR-pHLA יש גם משמעות ברורה לגבי עיצוב טיפול. היכולת ישירות "לראות" את מולקולות ממוקדות טיפולית, כמו גם את ההשפעה שיש שינויים על recognitio אנטיגןn, ישפר את פיתוח בבירור של תרופות אלה הולכים קדימה. במחקר זה, אנו מראים כי אפילו שינויים משקעים פפטיד יחיד שאינו מעורב בכבדות על ידי TCR יכולים לשדר שינויים מבניים בלתי צפוי שאריות אחרות הפפטיד הנכנס HLA, אשר, בתורו, באופן דראמטי שמשנה הכרת T-cell. הבנה שלמה יותר של המנגנונים המולקולריים המועסקים במהלך הכרת אנטיגן T-cell תהיה לנו יתרון משמעותי בעת תכנון טיפולים עתידיים עבור מגוון רחב של מחלות אנושיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
S.O.C. MEDIA	Invitrogen
Orbi-Safe חממת ניו אורביט	Sanyo
carbenicillin	סיגמא
IPTG	פישר
קוויק קומאסי כתמים SafeStain	Generon
Legend RT	סורוול
טריס	פישר
מגנזיום כלוריד	ארקוס
נאקל	פישר
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'
סונופולס HD 2070	של בנדלין
	פישר
טריטון	סיגמא-אולדריץ'
EDTA	פישר
גואנידין	פישר
ננו-דרופ ND1000	פפטידים תרמו
	מחקר
פפטיד, דיתיותרייטול	סיגמא-אולדריץ'
L-ארגינין	SAFC
ציסטאמין	פישר
ציסטמין	של פישר
	אוריאה סיגמא-אולדריץ'
	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μ m מסנן ממברנה	Pall
POROS 10/100 HQ	יישומי ביו-סיסטמס
ו-Auml; מערכת FPLC טהורה KTA	GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Sartorius
Superdex 200 עמודה 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline	מאגר אוקסואיד
BIAcore HBS	GE Healthcare Life Sciences
ערכת ביוטינילציה	Avidity
BIAcore T200	Healthcare Life Sciences
CM5 ערכת צימוד שבבים	GE Healthcare Life Sciences
סטרפטווידין	סיגמא-אולדריץ'
מיקרוקל סמנכ"ל ITC	GE Healthcare Life Sciences
Hepes	סיגמא-אולדריץ'
גריפון	ארט רובינס אינסטרומנטס אינטלי
פלייט	ארט רובינס אינסטרומנטס
מסכי התגבשות וריאגנטים	מידות
75 ס"מ2 flask	גריינר ביו-וואן
0.22 μ m מסננים	Miller-GP, Millipore
צינור אולטרה-צנטריפוגה אולטרה-קליר	בקמן קולטר
אופטימה L-100 XP עם רוטור SW28	בקמן קולטר
CD8 מיקרו-חרוזים	Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads	Invitrogen
	Miltenyi Biotec
CK מדיום, PHA	Alere Ltd
נגד TCRV ובטא; mAb
dasatinib	Axon
MIP-1β ו-TNFα אליסה	מו"פ D מערכות
51Cr	PerkinElmer
1450 דלפק מיקרובטא	PerkinElmer