מאמר שיטה

בדיקת היכולת פולשנית דם של תאים סרטניים דג הזברה (

11.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55007

⸱

3 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

במאמר זה

סיכום

בשיטה זו משתמשת עוברי דג זברה כדי לבדוק ביעילות את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים. תאים סרטניים פלורסנט מוזרקים לתוך שק סינוס או חלמון precardiac של עוברים בפיתוח. פלישת תאים סרטניים כלי דם extravasation נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אזור הזנב 24 כדי 96 שעות מאוחר יותר.

תקציר

פלישה ואקסטרוואזציה של תאי סרטן לכלי דם היא סימן היכר של התקדמות גרורתית. מודלים מסורתיים במבחנה של פלישת תאים סרטניים לאנדותל חסרים בדרך כלל את דינמיקת הנוזלים אליה נחשפים תאים פולשים in vivo. עם זאת, מערכות in vivo כגון מודלים של עכברים, למרות שהן רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית, דורשות טווחי זמן ניסויים ארוכים יותר ומציגות אתגרים ייחודיים הקשורים לניטור וניתוח נתונים. כאן אנו מתארים בדיקת דג זברה המבקשת לגשר על הפער הטכני הזה על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה של פלישת כלי דם של תאים סרטניים ואקסטרוואזציה. הגישה כוללת הזרקת תאי סרטן פלואורסצנטיים לסינוס הקדם-לבבי של עוברי דג זברה שקופים בני יומיים שכלי הדם שלהם מסומנים על ידי מדווח פלואורסצנטי מנוגד. לאחר ההזרקה, תאי הסרטן חייבים לשרוד במחזור הדם ולאחר מכן לצאת מכלי הדם לרקמות באזור הזנב של העובר. תאי סרטן מוזרמים מזוהים ביעילות ומקבלים ניקוד בעוברים חיים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בנקודת זמן קבועה. ניתן לשנות טכניקה זו כדי לחקור אינטרוואזציה ו/או תחרות בין תערובת הטרוגנית של תאים סרטניים על ידי שינוי אתר ההזרקה לשק החלמון. יחד, שיטות אלו יכולות להעריך התנהגות סימן היכר של תאים סרטניים ולסייע בחשיפת מנגנונים המעידים על התקדמות ממאירה לפנוטיפ הגרורתי.

מבוא

מחלה גרורתית הוא אחד הגורמים העיקריים לתמותה מסרטן ומנגנונים רבים המאפשרים הפצת תאים סרטניים להישאר להתגלות 1. על מנת תא סרטני לשלוח גרורות בהצלחה, צריך קודם לפלוש דרך stroma שמקיפה גידול ראשוני, זן (intravasate) לתוך מערכת הדם, לשרוד במעבר, יציאה (extravasate) מהמחזור, ולבסוף להקים מושבת קיימא ליד העוגב באתר 2 הרחוק. Intravasation ו extravasation הם ובכך צעדים מכריעים המפל גרורתי, ובכל זאת כל תא סרטני הוא לא מיומן מטבעו לשבש נודדות דרך צומת אנדותל 3. למעשה, יש שורה של לחצי מבחר ייחודיים מקיפי פלישת כלי דם תאים סרטניים ואת התהליך יכול להיות מושפע יותר על ידי מגוון של גורמי אנדוגני אקסוגניים 4. מסיבות אלה, טכניקות לחקור את ההתנהגות האגרסיבית של סרטן בשלב מתקדם לעתים קרובות להתמקד נascular יכולת פולשנית כאמצעי לחיזוי התפשטות גרורתית.

מערכות מודל שונות קיימות כדי להקל על המחקר של פלישת כלי דם תאים סרטניים במבחנה. לכל היותר בשימוש מבחני חוץ גופייה לכלול הן מערכות transwell להעריך נדידת תאים סרטניים באמצעות מחסום אנדותל 5 או תא-המצע חשמלי חישת עכבה (ECIS) בטכנולוגיה כדי לפקח על השיבוש בזמן האמת של monolayer שלם אנדותל ידי תאים סרטניים 6. מבחנים אלו בדרך כלל חסרים את הדינמיקה של נוזלים וגורמים סטרומה שאחרת להשפיע מצורפים תאים סרטניים לקיר האנדותל. בעיה זו לעקוף במידה מה על ידי רשתות כלי דם perfusable שעולות מן תרבות 3D של endothelia עם תאים תומכים סטרומה, ומערכות microfluidic 3D אלה מהוות כיום בחזית האפשרויות הנוכחיות במבחנת 7,8. ובכל זאת, גישות אלה להשמיט את המיקרו-הסביבה החזקה של מערכת דם פונקציונליתולכן רק תחליף חלק עבור מודלים in vivo.

הנפוץ ביותר במודל vivo של פלישת כלי דם היא של העכבר, שבו מבחני גרורות ניסיוני מבוצעים בדרך כלל משום שהם מתרחשים על לוחות זמנים יחסית קצרים מעידים בדרך כלל יכולת גרורתי 9. מבחנים אלו כרוכים הזרקה ישירה של תאים סרטניים למחזור ולכן מודל בשלבי הסיום של גרורות, כלומר תא extravasation וסרטן קולוניזציה של איברים. מבחני גרורות ניסיוני משתנים בהתאם באתר הזרקת תאים סרטניים האיברים בסופו מנותחים. בסוג assay הראשון, תאים סרטניים מוזרקים לוריד הזנב של עכברי זריעת תאי סרטן הריאות מנוטרים 10,11. את assay השנייה כוללת ביצוע זריקות intracardiac לכוון זריעת גרורתי לכיוון המיקרו-סביבה העצם 12-14, אבל גם 15 המוח. ב assay שלישי, ג סרטןאמות מוזרקות לתוך הטחול על מנת לאפשר קולוניזציה של הכבד 16 ואילו מסלול המשלוח הרביעי לעורק תרדמת נושאת תאים סרטניים למוח 17,18. בלי לשים לב את שיטת מסירת התאים הסרטניים, קולוניזציה האיברים היא נקודת הסיום הניסיון קבל והוא נקבע בדרך כלל באמצעות הארה, היסטולוגיה, או טכניקות מבוססות PCR. למרות היתרונות הפיסיולוגיים של ניצוח מבחני גרורות הניסיונות בתוך שורה בעכברים, ניסויים אלה עדיין דורשים שבועות עד חודשים כדי להשלים ולנתח.

דג הזברה (Danio rerio) המודל התפתח לאחרונה מערכת חדשה ללמוד התקדמות סרטן 19,20, ו מאפשר ההערכה של פלישת כלי דם תאי הסרטן בתוך מערכת דם תפקודית על לוח זמנים קצר בהרבה בהשוואה לעכברים 21-24. השיטה משתמשת זן דג הזברה שקוף אשר endothelia שלה מתויג עם fluo ירוק שונית אלמוגיםכתב חלבון rescent מונע על ידי אמרגן kdrl, הקולטן דג הזברה עבור פקטור גדילה של אנדותל כלי דם 25. ב assay, תאים סרטניים מסומנים בטוש ניאון אדום והזריקו לתוך הסינוס precardiac של עוברים ישנים 2-יום. בכל מקום בין 48 כדי 96 שעות לאחר ההזרקה, תאים סרטניים כי פלשו מתוך כלי הדם ולתוך באזור של עבר הזנב יכולים להיות בקיע ביעילות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו ליישם את הטכנולוגיה על פנל של שורות תאי סרטן השד אנושיות הנפוץ להפגין הבדלים מוחלטים ביכולת פולשני כלי הדם שלהם. יתר על כן, אנו מראים כי שינוי הזריקה אל שק העובר חלמון מאפשר לחקר אינטראקציות תא הטרוגנית, כמו אוכלוסיות תאים סרטניים יכולים להיות מתויג באופן דיפרנציאלי עם צבעי ניאון והזריקו לתוך עוברי דג הזברה חסר כלי הדם ניאון. ב assay זה האחרון, תאים סרטניים פלשו החלמון intravasated לתוך vasculaturדואר הם הבקיע באזור הזנב 24 עד 48 שעות לאחר ההזרקה. בהתאם ליעילות והנוחות של מודל זה, דג הזברה מועסקת ויותר לבדוק במהירות את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים תחת הגדרה פיזיולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

משפט ואתיקה: עוברי דג זברה נוצרו על פי פרוטוקול IACUC אושר. ניסויים אלה בוצעו בהתאם להמלצות ועדת טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ורג'טאון ושימוש.

1. ארגן עובר להזרקה צור פתרונות מניות

  1. צור זחלי דג זברה הנדרשים להעריך פלישת כלי דם תאים סרטניים.
    1. גדר מנת לסחור בצורה חכמה או קבוצה נגדית הזדווגות עם Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; דגי b140 ednrb1.
      הערה: יצרנו Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 דג הזברה b140, על ידי חציית Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, המבטאים שונית ירוק חלבון אלמוגים ניאון בתאי האנדותל, עם קו חסר תאי פיגמנט, mitfa b692; ednrb1 b140, שפותח במרכז המשאבים הבינלאומי דג הזברה.
    2. שיתוףביצי llect, נקיים, ולהסיר עוברים מופרים או מעווים למחרת 22.
    3. דגירה עוברים על 28.5 ° C עד מוכן להזרקה עם תאים סרטניים, להתרחש כאשר עוברי דג הזברה הם 2 ימים לאחר ההפריה (2 DPF).
  2. הפוך צלחות הזרקה.
    1. ממיסים 25 מ"ל של agarose 1.5% ב DH 2 O עבור כל צלחת.
    2. יוצקים 12 מ"ל של agarose לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ ולתת לו להתקשות.
    3. Re-להמיס ואז לשפוך את agarose שנותרו בצלחת.
    4. מיד למקם עובש קריסטל (3 מ"מ x 7.2 ס"מ רוחב X 7.5 ס"מ), כך שזה בזווית של 30 מעלות ביחס agarose וממוקמים במרכז הצלחת.
      הערה: פעולה זו תיצור תלול 60 ° קיר ו -30 ° שיפוע נוטה.
    5. קלטתי את תבנית זכוכית במקום ולתת להקשיח agarose.
    6. הוצא בעדינות את תבנית הזכוכית להיזהר שלא לקרוע את agarose.
      הערה: תבניות ניתן לאחסן ב DH 2 O ב 4 ° C.
  3. לאזן צלחת הזרקה במי דגים (מלח ים 0.3 גר '/ ל).
    1. צלחת לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים.
    2. לאזן צלחת על ידי הוספת 10 מ"ל של מים ודגים לצלחת ומניחים על שייקר במשך 10 דקות.
    3. לאזן צלחת בשנית עם מים ודגים.
  4. פיצול 2 ימים לאחר הפריה (DPF) עובר לקבוצות הזרקה באמצעות העברת לתוך במאכלים המכילים דגי מים 22.
  5. הכינו מאכלים התאוששות עבור כל קבוצה לנצל לאחר ההזרקה. ודא כי המאכל התאוששות מכיל 10 מ"ל מים דגים, בתוספת פניצילין (25 מיקרוגרם / מ"ל) ו סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
  6. הכן פתרון tricaine 2x ידי הוספת 4 מ"ל של המניה tricaine שנאגרו (4 מ"ג / מ"ל, 10 מ"מ טריס, pH 7) 50 מ"ל מים דגים בתוספת פניצילין סטרפטומיצין.
  7. ממיסים 15 מ"ג נמוך ההיתוך agarose-טעם 10 מ"ל של תמיסת tricaine 2x ליצור מדיום הרדמה הרכבה אשר לשתק עוברים לחיות עבור imaginז.
    הערה: הרכבה בינונית מורכב agarose 1.5%.
  8. משוך מחטים microinjection.
    1. מניח צינורות זכוכית נימים ב חולץ פיפטה אנכי. משוך ארוך טפטפות קונים באמצעות 20 נוכחי MAMP ו גוף חימום 2-סליל.

2. תאים סרטניים סימון lipophilic פלורסנט דיי

  1. שמור על תאים סרטניים בתנאי התרבות המומלצות.
    הערה: שורות אלה נשמרו DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, מד"א- MB-231, מד"א- MB-468, ו SK-BR-3. קווים אלה נשמרו RPMI + 10% FBS: HCC 1806 T-47D. כל שורות תאים נשמרו על 37 מעלות צלסיוס ו 5% CO 2 במהלך הדגירה.
  2. צור השעית תא בודד על ידי dissociating תרבות חסידה של תאים סרטניים.
    1. ראשון שטף תאים עם PBS ולאחר מכן לטפל עם פתרון 0.05% טריפסין- EDTA.
      הערה: זמן חשיפה טריפסין יהיה תלוי הקו הסלולרי.
    2. לנטרל את פתרון טריפסין עם seרום-המכיל התקשורת תרבית תאים לאחר שהתאים לנתק.
  3. צנטריפוגה השעית התא מנוטרל-טריפסין במשך 5 דקות ב 200 XG, ואז resuspend תא גלול בתקשורת תרבות הטריה ספירת תאים.
  4. ספירת השעית התא באמצעות מונה אוטומטי ולהכין 1 מיליון תאים ב 200 μl של תקשורת תרבית תאים.
    1. ודא כדאיות תא עם הדרת צבע כחול trypan לפני הזריקה לתוך עוברי דג זברה.
      הערה: רק אוכלוסיות תאי קיימא צריכים להיות מוזרקות לתוך עוברי דג זברה, כמו הזרקת תאים מתים לא תישקף פלישת כלי דם נכונה.
  5. הוסף 2 μl של צבע lipophilic אדום ההשעיה תאים סרטניים עבור דילול 1: 100, ומערבבים היטב, ואז דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: ריכוז של הזמן לצבוע וסימון ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה עבור כל קו התא.
  6. לאחר הדגירה, להוסיף 1 מיליליטר של תקשורת הטריה אל הצינור ואז צנטריפוגות במשך 5 דקות ב200 x גרם.
  7. לשטוף צבע פלואורסצנטי שיורית מתאי הסרטן.
    1. לשאוב supernatant מן התא גלולה, resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות טרי, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 x ז.
    2. חזור על שלב הכביסה בשנית: לשאוב supernatant, resuspend התא הגלול ב 1 מיליליטר של תקשורת הטריה ולאחר מכן צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 200 גרם x.
    3. חזור על הפעם השלישית שלב כביסה: לשאוב supernatant, resuspend התא הגלול ב 1 מיליליטר של תקשורת הטריה ולאחר מכן צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 200 גרם x.
  8. לשאוב supernatant ו resuspend התא הגלול המכיל 1 מיליון תאים סרטניים שכותרתו 500 μl של תקשורת הטריה.
    הערה: 0.5 מ"מ EDTA ניתן להוסיף התקשורת כדי למנוע clumping התא.

3. תאי סרטן ההזרקה לתוך הסינוס טרום הלב של עוברי דג הזברה

  1. צרף מערכת לוותר microinjection למקור אוויר דחוס ולהדליק המקור כוח מערכת לוותר דואר microinjection.
    1. לחץ בדיקה על-ידי לחיצה על דוושת הרגל. דופק קצר של אוויר צריך לפלוט מבעל המחט.
  2. לאזן את צלחות הזרקת פעמים עם פתרון 2x tricaine.
    1. לכל שלב איזון, להוסיף 20 מיליליטר של תמיסת tricaine 2x לצלחת ההזרקה ומניח על שייקר במשך 10 דקות.
  3. השתמש פיפטה פלסטיק להעביר קבוצה של עובר לצלחת קטנה המכילה את פתרון 2x tricaine.
  4. למילוי מחט זריקת microinjection עם תאים סרטניים באמצעות קצה pipet ג'ל טעינה.
    1. מניח את המחט בתוך צנצנת אחסון אלקטרודה עם הקצה המחודד פונה כלפי מטה כך תאים להתיישב ליד הקצה.
  5. העביר 20 - 30 עוברים הרדימו צלחת הזרקה ידי איסוף עובר עם שפע של tricaine 2x ב פיפטה פלסטיק.
    1. אפשר עובר להתיישב קצה פיפטה.
    2. ג'ֶנטֶלמֶןly לגרש עוברים לתוך השוקת של צלחת זריקה, להפיץ את העוברים לאורך השוקת.
    3. יישר עובר עם ראשים כלפי מעלה ובטנם מול הקיר התלול של השוקת.
      הערה: פתרון Tricaine צריך לכסות הוא את אורך השוקת לבין משטח agarose השטוח, עם עוברים המתגוררים רק בשוקת. עובר כעת מוכנים להזרקה.
  6. להזריק 50 - 100 תאים סרטניים (2 - 5 NL) לתוך הסינוס precardiac של עוברי דג הזברה באמצעות מערכת לוותר microinjection.
    1. צרף את המחט אל בעל מחט של micromanipulator.
    2. מקם את צלחת הזריקה מתחת סטריאוסקופ עם קיר 60 מעלות שמאלה ולהתמקד העובר העליון בהגדלה 25x.
    3. מקם את micromanipulator כך, כאשר מורחב, המחט תהיה לחדור את העובר.
    4. הארך את המחט על ידי העין עד כמעט נוגע העובר.
    5. מחפש מתחת למיקרוסקופ, ליישר את המחט כך tכובע זה יהיה לחדור את העובר על הארכה נוספת.
    6. פירס העובר דרך שק החלמון הצבת קצה בדיוק, אבל לא, הסינוס טרום הלב.
    7. להזריק תאים על ידי לחיצה על דוושת הרגל. הכח של הזריקה מגרש את התאים לתוך הסינוס הלב. לחזור בו מחט.
    8. באמצעות יד ימין, להאריך ו לחזור בו מחט הזריקה. עם יד שמאל, לבצע התאמות בסדר למקם העובר הבא.
    9. מחזירים את המחט אל קנקן האלקטרודה בעת הגדרת להזריק עוד צלחת.
  7. מעביר את העוברים כדי בצלחת ההתאוששות לאחר הצלחת כולה מוזרקת.
    1. הטה את צלחת ההזרקה לרכז את העוברים בתחתית, רחץ כל עוברים הנותרים מתוך השוקת, ואיסוף אותם עם פיפטה הפלסטיק.
    2. אפשר העוברים להתיישב התחתון של פיפטה.
    3. מעבירים את העוברים כדי בצלחת התאוששות בהיקף מינימלי של tricaine.
  8. אינקובטוריםte צלחת התאוששות ב 28 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
    1. עוברי דג הזברה קיימא נפרדים מעוברים מתים ופסולת אחרת.
  9. דגירת צלחת ב 33 מעלות צלזיוס עד מוכן ניקוד, בדרך כלל 24 - 96 שעות.
    הערה: טמפרטורה זו נקבעת כפשרה בין 37 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור תאים סרטניים, ו -28.5 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור דג זברה.

4. ניקוד extravasation

  1. להרדים את אצווה של עוברים כדי להיות הבקיע ידי הצבת אותם בצלחת עם פתרון tricaine.
  2. הוסף זחלים הרדימו בשקופית מיקרוסקופ דיכאון בטיפת tricaine.
    1. זחלי אוריינט רוחבי עבור הדמיה אופטימלית של אזור הזנב.
  3. ספירת תאים סרטניים פלשו בהצלחה מתוך כלי הדם על ידי התמקדות מעלה ומטה באמצעות באזור הזנב להבחין בתאים שלמים בבירור.
    הערה: זה הכי טוב שיש לפחות שני אנשים מעורבים tהתהליך שלו, שבו הפרט הבקיע את הדג עיוור תנאי הניסוי מוערך.
    1. ציון זחלים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם עם העדשה האובייקטיבית 10x. השתמש אובייקטיבי 20x עבור שיחות כלשהן קשות.

5. עוברים הרכבה על שקופיות ו דימות פלואורסצנטי לאחר

  1. ממיסים 1.5% agarose / tricaine פתרון ומביאים 37 ° C.
  2. להרדים את העובר להיות צילמו על ידי הצבת אותו פתרון tricaine.
  3. מעביר את העובר בטיפת פתרון tricaine אל פני שטח ההדמיה. לחלופין להשתמש שקופית צלחת או מיקרוסקופ זכוכית תחתונה.
  4. השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את פתרון tricaine העודף, שמירה על העובר על פני שטח ההדמיה.
  5. Overlay טיפה אחת של פתרון agarose מותכת על העובר.
  6. במהירות, לפני agarose polymerizes, להשתמש בכלי עדין, כמו מברשת עפעף, כדי לכוון את העובר רוחבי הדמיה, מתן טיפול נוסףכדי להבטיח את העובר בצורה שטוחה על פני שטח ההדמיה.
  7. להטביע את הירידה agarose polymerized כעת תחת פתרון tricaine.
  8. נושא עובר דג הזברה לחיות הדמיה מיקרוסקופית.

שינוי 6.: הזרקת תאים סרטניים לתוך שק חלמון של עוברי דג הזברה

  1. הכן את צלחות מערכת הזרקה לוותר microinjection כפי שתואר לעיל בסעיף (3) של פרוטוקול זה.
  2. לייבל שתי אוכלוסיות תאים עם מנוגדים צבעי ניאון כפי שתואר לעיל בסעיף (2) של פרוטוקול זה.
  3. להזריק 5 - 10 nl של 2 x 10 ^ 7 תאים / מ"ל ​​לתוך שק החלמון. שמור קבוע נפח ההזרקה להזריק מספרי תאים זהים (100 - 200 תאים סרטניים) מכל אוכלוסיית תאים
    הערה: אפשר להשתמש עוברי דג זברה שקופים חסרי כלי דם ניאון עבור assay זה. כניסה פסיבית של חלקיקים לתוך כלי הדם יכולה להיות נשלטה על ידי הזרקת חרוזי ניאון (<10 מיקרומטר) או, לשנותבאופן מקורי, קו תא שאינו intravsate.
  4. לשחזר את העוברים מוזרקים כפי שתואר לעיל בסעיף (3) של פרוטוקול זה ולאחר מכן להקרין זריקות מוצלחות.
    1. השתמש סטריאוסקופ למסך ולהעביר עוברים קיימא כי הוזרקו בהצלחה מנה חדשה.
      הערה: כל העוברי צריך מסה בגודל עקבי של תאים נמצאים בחלמון. עובר מבוטלים אם גודל המסה שונה או אם תאים כל ממוקמים מחוץ החלמון.
    2. מעבירים את העוברים קיימא מנה חדשה אם התאים הסרטניים נראים בבירור את שק החלמון.
  5. דגירת צלחת ב 33 מעלות צלזיוס עד מוכן ניקוד, בדרך כלל 24 - 48 שעות.
    הערה: טמפרטורה זו נקבעת כפשרה בין 37 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור תאים סרטניים, ו -28.5 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האידיאלית עבור דג זברה.
  6. להבקיע intravasation, פעל בהתאם להנחיות בסעיף (4) של פרוטוקול זה, אבל במקום לספור את מספר גתאי ancer כי פלשו בהצלחה לתוך כלי הדם של אזור הזנב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן בדקנו את יכולת פולשני כלי הדם של שורות תאי סרטן השד נפוצים מודל עובר דג זברה (איור 1). קריטריונים מחמירים הועסקו extravasation הניקוד עבור שורות תאים שונים אלה, שבו אירועים חיוביים נספרו רק אם התאים הסרטניים לא extravasated בבירור, וזאת נעשה בעיקר כדי להגביל את כל-תוצאות חיוביות שגויות שיכול לנבוע הבקיע פסולת הסלולר.

הניתוח שלנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקה זו מנצלת את מודל דג הזברה ביעילות על מנת לבחון את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים (ראה איור 1). כאן אנו להחיל את הטכניקה בפני פנל של שורות תאי סרטן השד על מנת לספק בסיס שעליו חוקרים אחרים אז יכולים לבנות מחקרים משלהם (ראה טבלה 1; איורים 2 - 3). התצפית כי מד"א- MB-231 תאים פלשו בקלות לאזור הזנב של עוברי דג זברה תגרום אידיאלי שורות תאים לבדיקת סוכנים שעשויים לעכב פלישת כלי דם. יחסית פחות שורות תאים פולשניים, כמו HCC...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

אנו מודים לפיטר ג'ונסון מליבת המיקרוסקופיה של אוניברסיטת ג'ורג'טאון על הסיוע בהדמיית עוברי דג הזברה. המשאב המשותף למיקרוסקופיה והדמיה והמשאב המשותף של דג הזברה נתמכים חלקית על ידי מענק NIH/NCI P30-CA051008. עבודה זו נתמכה גם על ידי NIH/NCI CA71508 (AW) ו-CA177466 (AW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300-054
100 מ"מ כליםקורנינג משולב3160-100
5 3/4 אינץ' צנרת פסטור חד פעמית, בורוסיליקט זכוכיתפישר מותג13-678-20B
60 מ"מקורנינג כלים משולב3160-60
אגרוז,פישרBP165-25
Agarose, Bioline בדרגה מולקולריתBIO-41026
זכוכית נימית, סטנדרטית, 1.2 מ"מ x 0.68 מ"מ, 4 אינץ'A-M Systems, Inc627000
David Kopf 700C חולץ פיפטות אנכיHofstra Group3600
DMEMLife Technologies11995-065
צנצנת אחסון אלקטרודות, 1.0 מ"מWorld Precision Instruments, IncE210
אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (טריקאין, MS-222)FlukaA5040
מברשת ריסיםטד פלה, Inc113
סרום בקר עוברי, אומגה מדעית מומתת בחוםFB-12
פישרברנד העברת פיפטותThermoFisher Scientific13-711-7M
טיפיםלטעינת ג'לפישר ברנד02-707-181
כלי זכוכית תחתונים (12.0 מ"מ)ThermoFisher Scientific150680
שקופית שקע זכוכיתVWR470005-634
מלח אוקיינוס מיידי, מלח יםPentairIS50
נורות גומי לטקס, 2 מ"ל, מארז של 72הית'רו סיינטיפיקHS20622B
SP8 מיקרוסקופ קונפוקליLeica
מיקרומניפולטורNarishige
Eclipse E600Nikon
PBSLife Technologies10010-023
פניצילין-G אשלגןפישר ביוטקBP914-100
צלחות פטרי, 100 מ"מ x 15 מ"ממותג פישר 
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 בינוני Life Technologies11875-093
סטרפטומיצין סולפטפישר ביוטקBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
VybrantDiO ThermoFisher ScientificV22886
דג זברה המשותפים של דג הזברה של ג'ורג'טאון
נשמרו ב-DMEM + 10% FBS, עם ציפייה לתאי BT-474 ו-HCC18-6, שהוחזקו ב-RPMI + 10% FBS.
נמס נמוך FB0875713קווי תא המשאבים

מקורות

  1. Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
  2. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  3. Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
  4. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  5. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
  6. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  8. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
  11. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260(2012).
  13. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
  14. Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
  15. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  16. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677(2014).
  17. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
  18. Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
  19. Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
  20. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
  21. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
  22. Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
  23. Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
  24. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
  25. Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
  26. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
  27. Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
  28. Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  29. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  30. Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
  31. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  32. Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים