מאמר שיטה

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ"א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

DOI:

10.3791/55008

⸱

11 בינואר 2017

 ,  , 
1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצלחנו לבסס שיטה לבידוד RNA מזרעי צמחים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים ופוליפנולים, שיש להם השפעות מעכבות על בידוד RNA בטוהר גבוה. השיטה שלנו מתאימה לניטור ביטוי גנים בעלי תעתיקים ברמה נמוכה בזרעים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרעי צמחים צוברים כמויות גדולות של עתודות אחסון המורכבות מחומר אורגני מתכלה. בני אדם מסתמכים על עתודות אחסון זרעים למזון וכחומרים תעשייתיים. פרופילי ביטוי גנים הם כלים רבי עוצמה לחקירת ויסות מטבולי בתאי צמחים. לכן, נדרשים פרופילי ביטוי גנים מפורטים ומדויקים במהלך התפתחות הזרעים לגידול יבולים. רכישת RNA מטוהר מאוד חיונית לייצור פרופילים אלה. יש צורך בשיטות יעילות כדי לבודד RNA מטוהר מאוד מזרעים. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד RNA מזרעים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים ופוליפנולים, שיש להם השפעות מעכבות על בידוד RNA בטוהר גבוה. השיטה שלנו מאפשרת לקבל RNA מטוהר מאוד מזרעים ללא שימוש בפנול, כלורופורם או תהליכים נוספים לטיהור RNA. שיטה זו ישימה על זרעי ארבידופסיס, לפתית ופולי סויה. השיטה שלנו תהיה שימושית לניטור דפוסי הביטוי של תעתיקים ברמה נמוכה בזרעים מתפתחים ובוגרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמחים מייצרים זרעים, אשר להצמיח את הדור הבא. זרעים לצבור כמויות גדולות של עתודות אחסון, כגון שמנים, פחמימות וחלבונים, לצמיחה שלאחר נביטה. בני אדם לנצל עתודות אחסון זרע כמקורות להאכיל במזון מן החי, ובכך זרעי צמחים הם אחד הספקים העיקריים של חומר אורגני אכיל ברחבי העולם. הגדלת תשואות זרע היא אתגר חשוב במדע צמח.

מאז עתודות אחסון הזרע הם מקורות בעלי ערך מסחרי של מזון וחומרים תעשייתיים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס רגולציה של חילוף החומרים של עתודות אלו נחקרו בהרחבה 1-6. להאיר עוד מנגנונים אלו יהיו שימושיים להגדלת תשואות זרע בגידולים. זרעים להתפתח השחלות צמח לאחר הפריה, והם בשלים דרך סדרה של שלבי התפתחות 1,6,7. בהמשך להבנת התפתחות הזרע הבסיסי המולקולרי מנגנון מחייב מפורט, פרופילי ביטוי גנים מדויקים מתוך סדרה של פיתוח זרעים להיות מיוצר. עם זאת, כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, פחמימות, ופוליפנולים זרעי צמחים להקשות לבודד RNA נקיים במיוחד, אשר מונע פרופיל מדויק של ביטוי גנים.

הנה, אנחנו מציגים שיטה יעילה בידוד RNA מן הבוטנים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, ופוליפנולים. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו להכין RNA הנקי במיוחד. RNA כזה יהיה שימושי עבור ניטור שינויים תעתיק בגנים מפתח שליטה על ויסות חילוף החומרים של עתודות אחסון זרע בפיתוח גרעיני שמן בוגרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הפקת RNA הכולל זרעי צמחים

  1. הכן סטים חיץ, עמודות ספין, 1.5 ו -2.0 צינורות פוליפרופילן מ"ל, ו -1.5 nuclease ללא צינורות פוליפרופילן מ"ל.
  2. הוסף 1% (w / v) polyvinylpyrrolidone כיתת ביולוגיה מולקולרית (להלן המכונה PVP) לתא חיץ תמוגה להפקת RNA ו מערבולת במרץ. דגירה במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס לחלוטין. לאחר 20 דקות הדגירה, לערבב בעדינות למאגר על ידי סיבוב הצינור במהופך כדי למנוע היווצרות של בועות. אחסן בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) לפני השימוש.
  3. פירות קציר מצמחים ארבידופסיס thaliana ומכניסים 1.5 צינורות פוליפרופילן מ"ל על הקרח. פירות מקום על צלחות אלומיניום שמרו על 4 מעלות צלזיוס ולבודד זרעים מפירות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
    1. מניח את הזרעים המבודדים (כ -200 זרעים) לתוך 1.5 צינורות פוליפרופילן מיליליטר שאוחסנו במעמד אלומיניום על קרח ומייד ומקום צינורות n הנוזלitrogen.
  4. הסר את הצינורות מן החנקן הנוזלי ולהחזירם מתלים אלומיניום על קרח. הוספת 100 μL של למאגר המכיל 1% PVP ו צנטריפוגות דקות 1 XG ב 1000 ב 4 ° C..
  5. Homogenize מדגם עם עלי נירוסטה באמצעות מטחנת מנוע עבור 60 s, תוך שמירה על הצינור מתל אלומיניום על קרח.
  6. להוסיף 550 μL של למאגר המכיל 1% PVP, מערבב את החיץ בעדינות על ידי סיבוב הצינור במהופך, דגירה במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
  7. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 8000 XG ב 25 ° C, והעברת 550 μL של supernatant לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חדש.
  8. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 XG ב 25 ° C, והעברת 450 μL של supernatant לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חדש.
  9. השתמש supernatant ככל lysate התא להפקת RNA. מכאן והלאה, בצע את ההליך מתואר להוראות היצרן בערכה הזמינה המסחרי.
  10. elute אתRNA באמצעות היקף מינימלי של חיץ elution כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק של RNA לניטור דפוסי הביטוי של תמלילי ברמה נמוכה. אחסן את RNA במקפיא עמוק עד בשימוש.

2. אימות של RNA איכות

  1. ההפשרה RNA הכולל, ומערבבים על ידי הקשה עדינה, ובמקום הצינור במעמד אלומיניום על הקרח.
  2. למדוד את ריכוז RNA, יחס A260 / A280, ויחס A260 / A230 באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume.
  3. לדלל את RNA המוחלט במי RNase ללא לריכוז סופי של 70 ng / μL.

3. שעתוק לאחור של RNA סה"כ מזרעים

  1. הפשרת סטי רנ"א חיץ המוחלט מן הערכה המסחרית. שמור על אנזימים מתוך הערכה על הקרח לאחר הקשה עדינה. הכן צינורות פוליפרופילן מ"ל 0.2 nuclease חינם.
  2. הוסף 5 μL של רנ"א הכל, 1 μL של אוליגו פריימר dT (50 מיקרומטר), ו -1 מיקרומטר של Random 6-mer (50 מיקרומטר) ל -0.2 פוליפרופילן מ"לצינור Lene על הקרח.
  3. דגירה במשך 15 דקות ב 37 ºC ומניחים על קרח.
  4. מכאן והלאה, בצע את ההליך המתואר להוראות היצרן בערכה שעתוק-PCR הפוך.
  5. מניחים את מוצרי שעתוק לאחור על הקרח לפני השימוש.

4. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת

  1. Construct פלסמידים מחסה רצפי גני היעד באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
  2. התאם את ריכוזי 100-500,000 עותקים / μL עבור תבניות DNA עבור עקומות סטנדרטיות.
  3. לדלל את פתרונות cDNA (1: 100) עם מים מזוקקים.
  4. הוסף 2 μL של פתרונות cDNA מדולל פלסמידים עבור עקומות סטנדרטיות מיקס מאסטר מתוך הערכה PCR כמותי בזמן אמת.
  5. הגדרת PCR בזמן אמת באמצעות התנאים אופניים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ולאחר מכן 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 35 שניות.
  6. לנתח את מספרי העותק פי דבריו של האישההוראות של ufacturer עבור מערכת ה- PCR בזמן אמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו ראשונים חקרנו את הריכוז האופטימלי של PVP באמצעות זרעים ארבידופסיס בוגרים. RNA סה"כ היה מבודד מכ -1,000 זרעים לפי הפרוטוקול שתואר לעיל באמצעות חיץ תא תמוגה המכיל 0%, 0.25%, 0.5%, 1.0% או 2.0% PVP. לאחר המגון צנטריפוגה, supernatant נאסף תוך הימנעות שכבת שמן ופסולת זרע (איור 1 א).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופילי ביטוי גנים לתרום להבנתנו פיזיולוגית צמח; ולכן, שיטות בידוד הספציפי RNA פותחו עבור כל דגימת מצב 9-12. חקרנו את התהליכים עוכבו במהלך בידוד RNA מזרעים ומצא כי RNA מחייב ממברנות סיליקה היה עכבות קשות. כמויות גדולות של שמן, חלבונים, ופוליפנולים לעכב בידוד RNA. שינינו את תהליך החילוץ RNA להסיר תרכובות אלה עם פתרון תמוגה לפני תהליך של RNA מחייב ממברנות סיליקה. מהשינויים המהותיים הכלולים תוספת של 1% PVP (שלב 1.2) ואת אוסף של supernatant מפתרון תמוגה centrifuged (שלבים 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לצוות של מתקן Genomics פונקציונלית מתקן Spectrography ו bioimaging, אמצעי מחקר Core NIBB, מתקן מחקר הצמח דגם, מרכז Bioresource NIBB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
polyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP5288-100G
הומוגנייזר S-303כאחד1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificNDL-US-CAN
PrimeScript RT Reagent Kit (מושלם בזמן אמת)TAKARARR037A
או SYBR ערכת qPCR מהירהKapa biosystemsKK4601

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNAPVPRNART PCRArabidopsis

מאמרים קשורים