מאמר שיטה

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

DOI:

10.3791/55030

⸱

10 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California Berkeley, 2California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), University of California Berkeley

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול להנדסת שלב העטרה של ננו-צינורות פחמן פלואורסצנטיים קרובים לאינפרא אדום (SWNTs) באמצעות פולימרים אמפיפיליים ו-DNA לפיתוח חיישנים למטרות מולקולריות ללא אלמנטים ידועים לזיהוי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-צינורות פחמן חד-דופן מוליכים למחצה (SWNTs) הם סוג של ננו-חומר פעיל אופטית שזוהר באינפרא אדום הקרוב, במקביל לחלון האופטי שבו הדגימות הביולוגיות שקופות ביותר. כאן, אנו מתארים טכניקות לספיגת פולימרים אמפיפיליים וחומצות פולינוקליות על פני השטח של SWNTs כדי להנדס את שלבי העטרה שלהם וליצור חיישנים מולקולריים חדשים עבור מולקולות וחלבונים קטנים. חיישני SWNT פונקציונליים אלה הם גם תואמים ביולוגית וגם יציבים. פולימרים נספגים על פני הננו-צינוריות על ידי סוניקציה ישירה של SWNTs ופולימר או על ידי השעיית SWNTs באמצעות חומר פעילי שטח ואחריו דיאליזה עם פולימר. פליטת הקרינה, היציבות והתגובה של חיישנים אלה לאנליטים ממוקדים מאושרים באמצעות ספיגה וספקטרוסקופיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום. יתר על כן, אנו מדגימים קיבוע פני השטח של החיישנים על גבי שקופיות זכוכית כדי לאפשר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת לאפיין ספיחת פולימרים וקינטיקה של קשירת אנליטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צינורות פחמן חד-דופנות (SWNTs) הם אטומיים שכבות דקיקות של אטומי פחמן התגלגל לתוך גליל מוארך ודק כי תערוכת מאפיינים אלקטרוניים ייחודיים אופטיים. 1 נכסים כאלה כוללים-פער להקה בהפקת אדום קרובה (ניר) פליטת קרינה באמצעות רקומבינציה אקסיטון כי הוא רגיש מאוד לסביבה המקומית שלה. פליטת הניר של SWNTs נופלת בתוך חלון האינפרה האדום הקרוב שבו העומק החדיר אור הוא מקסימלית עבור רקמה ביולוגית. 2,3 בנוסף, SWNTs להפגין כמה תכונות ייחודיות בניגוד טיפוסיים fluorophores אורגני: התערוכה SWNT משמרת סטוקס גדול, לא photobleach, ואינם למצמץ. 4 לאחרונה, ניצול המאפיינים הללו הוביל לפיתוח של מגוון של חיישני מולקולאריות חדשים עם יישומים לביולוגיה. 5,6 שלא עברו שינוי, לעומת זאת, SWNTs אינם מסיסים במים, וקבלת השעיות של SWNTs הפרט יכול להיות אתגר. 7,8 Bundling וצבירה של SWNTs בתמיסה יכולים לערפל קרינת להקת הפער שלהם, 2 טיווחו אותם מתאימים ליישומי חישה.

פיזור צינוריות פחמן בודדים בתמיסה מימית דורש שינוי פני השטח שלהם כדי למנוע צבירת הידרופוביות מונחה. 9 בעוד שינוי קוולנטי יכול לדקלם SWNTs מסיס במים, 10 וכן להקנות כימית מחייב ספציפית, אתרי פגם בסריג SWNT להפחית או לשכך פליטת הקרינה שלהם. במקום זאת, functionalization SWNT ניתן להשיג באמצעות פעילי שטח, שומנים, פולימרים וחומרים DNA 9,11 - 13 כי לספוג אל פני השטח ננו-צינורית דרך אינטראקציות לערום הידרופובי pi-pi. סביבת הכימי וכתוצאה מכך שמסביב SWNTs משטח פונקציונלי המכונית שלב עטרתה. הפרעות לשלב קורונה יכולה להיות השפעה גדולה על אקסיטונים נסיעה על פני השטח ננו-צינורות, גרימת מודולציות כדי SWNT פלואורידescence פליטה. זוהי מערכת יחסים רגישות זו בין שלב קורונה קרינת SWNT כי ניתן לנצל כדי לפתח חיישנים מולקולריים חדשים על ידי שילוב שיטות מחייבות ספציפיות על שטח פנים הגדול של SWNT. הפרעות לשלב קורונה SWNT על מחייב אנליטי יכול להוביל לשינויים בסביבה דיאלקטרי המקומי, לחייב העברה, או להציג פגמים נקודתיים, כל מה שיכול לווסת את פליטת הקרינה של SWNTs לשמש מנגנון התמרה האות. גישת 14 זה משמשת בפיתוח חיישני ניאון רומן לצורך זיהוי של מעמדות שונות רבות של מולקולות DNA כולל, 15,16 גלוקוז 17 ומולקולות קטנות כגון ATP, 18 מיני חמצן תגובתי 19 ותחמוצת חנקן. עם זאת 20,21, הגישות אלה מוגבלים כי הם מסתמכים על קיומו של אפנות מחייבות ידועים אנליטי היעד.

לאחרונה, אפליקציית כללית יותרמקק לעיצוב חיישנים פלורסנט פותח באמצעות SWNTs פונקציונליות שאינם קוולנטית עם heteropolymers amphiphilic, פוספוליפידים, וחומצות polynucleic. מולקולות אלה לספוג על משטחי ננו-צינורות פחמן לייצר השעיות מאוד יציבות של SWNTs פרט 22 - 25 עם שלבי קורונה ייחודיים שיכול לאגד חלבונים במיוחד 26,27 או מולקולות קטנות כולל הנוירוטרנסמיטר דופאמין. 28 - 30 הנדסה בשלב קורונה לפזר SWNTs ו analytes היעד להיקשר באופן ספציפי נקראת הכרה מולקולרית שלב קורונה כמו (CoPhMoRe). 28 גדליו הקטנים, הרעילות נמוכה, יציבות גבוהה קרינת ניר unbleaching של חיישני CoPhMoRe SWNT להפוך אותם למועמדים מצוינים עבור חישת in vivo עבור מדידות זמן נפתר מורחבות. העבודה 6 אחרונה הראתה בקשותיהם ברקמות צמח עבור זיהוי אופטי של מיני חנקן וחמצן תגובתי. 31יישום מרגש במיוחד עבור חיישני CoPhMoRe SWNT הוא הפוטנציאל לגילוי ללא מדבקה של נוירוטרנסמיטורים כמו דופאמין in vivo, שבו טכניקות אחרות, כגון חישה אלקטרוכימי או אימונוהיסטוכימיה, סובלות ממחסור של רזולוציה מרחבית, רזולוציה טמפורלית, וספציפי.

תכנון גילוי חיישני CoPhMoRe SWNT עד כה מרוסן על ידי גיוון הגודל והכימי של הספרייה, פיזור הגבלת הסבירות למציאת חיישן עבור מטרה מסוימת. נכון להיום, חוקר רק שרט את פני השטח של מצומדות זמינה, שיתוף בלוק, ביולוגית ופולימרי biomimetic שיכול לשמש תפקודי dispersants הפעיל עבור חיישני SWNT. כאן, אנו מציגים שיטות שונות עבור שני לפיזור SWNTs ואפיון הקרינה שלהם לסינון תפוקה גבוהה לניתוח חיישן SWNT יחיד. באופן ספציפי, אנו מתארים את הליך SWNTs ציפוי עם oligom חומצה polynucleicERS באמצעות sonication ישיר וכן כיצד functionalize SWNT עם פולימרים amphiphilic באמצעות חילופי פעילי שטח על ידי דיאליזה. אנו משתמשים (GT) 15 -DNA ופוליאתילן גליקול פונקציונליות עם isothiocyanate rhodamine (RITC-PEG-RITC) כדוגמאות. אנו מדגימים את השימוש (GT) 15 -DNA SWNTs כחיישן CoPhMoRe לצורך זיהוי של דופמין. לבסוף, אנו המתאר נהלים לביצוע מדידות חיישן מולקולה בודדת, אשר ניתן להשתמש בהם לאפיון או חישה מולקולה בודדת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהירות: יש להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (SDS) לפני השימוש. ייתכן שיהיה ננו מפגעים נוספים לעומת עמיתו חומר בתפזורת שלהם. השתמש בכל נוהלי בטיחות המתאים לרבות בקרות הנדסה (במנדף, מארז רעש) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, משקפי מגן, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים).

1. הכנת מאגר, חומרים פעילי שטח, ו תמיסות פולימר

  1. הכנת 100 פתרון mM NaCl
    1. ממיסים 584 מ"ג NaCl ב 80 מ"ל של מים ללא יונים. מוסיפים מים ללא יונים להביא הנפח הכולל עד 100 מ"ל.
  2. הכנת סולפט dodecyl נתרן 3% (SDS) פתרון
    1. ממיסים 3 גרם של SDS ב 80 מ"ל של מים ללא יונים. מוסיפים מים ללא יונים להביא הנפח הכולל עד 100 מ"ל.
  3. הכנת cholate נתרן 2% (SC) פתרון
    1. ממיסים 2 גרם של טפשium cholate מימה ב 80 מ"ל של מים ללא יונים. מוסיפים מים ללא יונים להביא הנפח הכולל עד 100 מ"ל.
  4. הכנת מאגר הדמיה (1x טריס: 20 מ"מ טריס, 100 מ"מ NaCl)
    1. ממיסים 22.23 גרם של טריס בסיס 58.44 גרם של NaCl ב 500 מ"ל של מים ללא יונים באמצעות בר ומערבבים מגנטי צלחת.
    2. בזהירות להוסיף מרוכז HCl עד pH של 8.1 הוא הגיע.
    3. מוסיפים מים ללא יונים להגיע נפח סופי של 1 ל
  5. סינתזה של פולימרים RITC-PEG-RITC
    1. ממיסים פוליאתילן גליקול difunctionalized אמין (PEG) (5 kDa או 20 kDa, 0.1 mol / L) isothiocyanate rhodamine (RITC, 0.2 mol / L) ב 1 מ"ל של 1: תערובת 1 של dichloromethane ו dimethylformamide (DMF).
    2. להוסיף 0.2 mol / L של N, N -diisopropylethylamine (DIEA).
    3. אחרי 3 שעות, המשקע עם 10x נפח של אתר diethyl ואחריו סינון ואקום.
    4. Redissolve ב DMF וחזור follo ממטרים האתרד על ידי סינון ואקום.
      הערה: מולקולות שונות isothiocyanate אחרים (למשל, isothiocyanate והעמסה, FITC) יכולה להיות מחוברת PEG או פולימרים שונים אמינים אחרים בשיטה דומה.
  6. הכנת PEGylated-דנ"א (PEG-DNA)
    1. מערבבים 100 μL של טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine פתרון (TCEP) (0.5 מ ', pH 7.0) עם 44.9 μL של-שונה 5'-תיאול DNA (1 מ"ג / 10 μL ב 0.1 M NaCl) ולהוסיף 4.855 מ"ל מים ללא יונים.
    2. מערבבים במשך 1 שעה.
    3. ממיסים 500 מ"ג של maleimide גליקול methoxypolyethylene ב 5 מ"ל של בופר פוספט.
    4. שלב פתרונות דנ"א PEG (10 בסך הכל מ"ל) ומערבבים במשך 24 שעות.

2. הכנת יחיד Walled פחמן Nanotube (SWNTs) מתלים

  1. Wash של SWNTs להסיר זרז וזיהומים.
    1. להוסיף 200-300 מ"ג של SWNTs רחוץ לתוך conta צינור צנטריפוגות פלסטיקining 45 מ"ל של מים ללא יונים.
    2. וורטקס הפתרון למשך 2 דקות ו sonicate באמצעות sonicator אמבטיה במשך 5 דקות. הערת sonicator שהגדרות להשתנות ממכשיר למכשיר, כדי לבדוק כי הצפיפות האופטית של עליות פתרון SWNT (כלומר, הופכת שחורה) על מנת להבטיח כי SWNTs שמתבצע התפזר.
    3. צנטריפוגה הפתרון במשך 20 דקות ב 16,100 XG וזורקים supernatant.
    4. להוסיף כ 45 מיליליטר של מים ללא יונים טריים.
    5. חזור על שלבים 2.1.2-2.1.4 עד 8 פעמים.
    6. סר מים רבים ככל האפשר נזהר שלא להפריע SWNTs pelleted ולאפשר גלולת SWNT לייבוש באוויר.
  2. השעיות של חומצות גרעין של SWNTs
    1. ממיסים חומצות גרעין (NA) ב 0.1 M NaCl לריכוז של 100 מ"ג / מ"ל.
    2. הסר את החשמל הסטטי מרית הפנויה, צינורות microcentrifuge ומלאי SWNT באמצעות אקדח אנטי סטטי. במנדף קטר, להוסיף 20 μL של פתרון NA כדי 980 μL של 0.1 M NaCl ואחריו תוספת של 1 מ"ג SWNTs.
    3. שימוש ultrasonicator עם קצה בקוטר 3 מ"מ, sonicate הפתרון במשך 10 דקות ב משרעת 40% באמבט קרח.
    4. צנטריפוגה פתרון ה- DNA SWNT פעמיים במשך 90 דקות ב 16,100 x ז. אם אתה משתמש-DNA PEG, לטהר את עודף ו- DNA unreacted ופג באמצעות ספין מסנן 100 kDa. הוסף מספיק PBS למלא את הספין-מסנן ספין על 9,300 XG עבור 1.5 דקות, חזור על שלב זה לשטוף 3 פעמים.
    5. לאסוף ולשמור את supernatant, נזהר לא להפריע גלולה המכילה חבילות CNT אגרגטים. וזורק את הכדור בהתאם לנהלים פסולת מסוכנים מוסדיים מתאימים עבור ננו.
    6. מדוד את ספיגת פתרון ב 632 ננומטר באמצעות UV / Vis ספקטרופוטומטר כדי לקבוע ריכוז משוער של SWNTs מושעה באמצעות ε = 0.036 L / ס"מ · מ"ג בהתאם לחוק של למברט-בירה הגורם דילול המתאים.
  3. השעיות פולימר amphiphilicשל SWNTs
    1. הסר את החשמל הסטטי מרית הפנויה, צינורות צנטריפוגות מיקרו, ומלאי SWNT. במנדף קטר, להוסיף 5 SWNTs מ"ג עד 5 מ"ל של תמיסת 2% SC (לחילופין, פתרון SDS יכול לשמש).
    2. שימוש ultrasonicator עם קצה בקוטר 6 מ"מ, sonicate הפתרון עבור 1 שעות ב משרעת 40% באמבט קרח.
    3. צנטריפוגה מדגם ב 150,000 XG למשך 4 שעות באמצעות ultracentrifuge ובזהירות לאסוף supernatant.
    4. ממיסים 1% WT של פולימר amphiphilic (למשל, RITC-PEG-RITC) בתמיסה SC-SWNT.
    5. Dialyze פתרון הפולימר-SC-SWNT באמצעות קרום דיאליזה 3.5 kDa נגד 1 ליטר של מים ללא יונים או חיץ במשך 5 ימים. שנה את המים או חיץ לאחר השעה 2 שעה 4. קרום דיאליזה גדול יותר יכול לשמש, כל עוד היא מאפשרת הסרה הפעילה השטח של בחירה, אבל שמירה של שני SWNT ופולימר amphiphilic.
    6. מדוד את ספיגת פתרון ב 632 ננומטר באמצעות UV / Vis ספקטרופוטומטר כדי לקבועריכוז משוער של SWNTs מושעה באמצעות ε = 0.036 L / סנטימטר * מ"ג בהתאם לחוק של למברט-בירת גורם הדילול המתאים.

3. הכנת חיישני SWNT ללא יכולת לזוז Surface

  1. הכנת BSA ביוטין ופתרונות המניות NeutrAvidin
    1. ממיסים 10 מ"ג lyophilized BSA ביוטין ב 1 מים ללא יונים מ"ל לעשות פתרון המניה 10 מ"ג / מ"ל ​​ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. ממיסים 10 מ"ג חלבון NeutrAvidin (NAV, deglycosylated חלבון avidin) ב 2 מ"ל של מים ללא יונים לעשות פתרון המניה 5 מ"ג / מ"ל. aliquots חנות ב -20 ° C. aliquots מופשר יכול להישמר במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס.
  2. כן שקופיות מיקרוסקופ מצופה BSA-ביוטין
    1. נקה המיקרוסקופ שקופית זכוכית לכסות 0.17 מ"מ (או מקום שראוי, לשם המטרה מיקרוסקופ) עם מים ללא יונים, ואחריו מתנול, אצטון שטיפה סופית של מים ללא יונים.
    2. הוספת 100 μL של פתרון מניות BSA-ביוטין 900 μL של 1x טריס חיץ לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל.
    3. זרימה 50 μL של פתרון BSA ביוטין לתוך התעלה על ידי pipetting הפתרון לתוך בקצה אחד הפתילה משם פתרון בקצה השני באמצעות רקמות. דגירה במשך 5 דקות ואחריו 3-5 גלי עם 50 μL של 0.1 M NaCl.
    4. לדלל 40 μL של 5 מ"ג / מ"ל ​​המניות NAV ב 960 μL 1x טריס חיץ לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל.
    5. זרימה 50 μL של פתרון NAV לתוך התעלה על ידי pipetting הפתרון לתוך בקצה אחד הפתילה משם פתרון בקצה השני באמצעות רקמות. דגירה של 2-5 דקותואחריו 3-5 גלי עם 50 μL של 0.1 M NaCl.
    6. לדלל פתרונות המניות של SWNTs המרחפים חיץ הדמיה לריכוז של 1-10 מ"ג / L וזרימה 50 μL של פתרון לתוך הערוץ דגירה של 5 דקות.
    7. לשטוף בעדינות משם SWNTs עודף באמצעות 50 μL של חיץ הדמיה.
  3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ silanized APTES
    הערה: APTES silanized שקופיות לאפשר דרך לשתק SWNTs עטוף DNA מטען שלילי על פני השטח של מצע זכוכית.
    1. כן פתרון 10% (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) באתנול.
    2. באמצעות ערוצים המורכבים באמצעות הפעולות המתוארות ב 3.2.2, לזרום 100 μL של 1x טריס חיץ.
    3. לשטוף את הערוץ עם פתרון APTES דגירה במשך 5 דקות. לשטוף עם חיץ 1x טריס.
    4. לדלל פתרונות המניות של DNA-SWNTs המרחפים חיץ הדמיה לריכוז של זרימת 1-10 מ"ג / ארץ 50 μL של פתרון לתוך הערוץ incubאכלו במשך 5 דקות.
    5. לשטוף בעדינות משם SWNTs עודף באמצעות 50 μL של חיץ הדמיה.

ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי 4. המיקרוסקופי של חיישני SWNT

  1. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניר
    1. בצע הדמיה של SWNTs השטח משותק באמצעות עירור ליזר מיקרוסקופ הפוכה לבושה עם מערך חיישן InGaAs הדמיה.
    2. כוונו את קרן הלייזר כדי להיכנס לנמל תאורה האחורי של מיקרוסקופ הפוכה שימוש במראות על mounts קינמטיקה מתכווננת וצמד של אירוסים שלאחר רכוב מוגדר גובה הנמל. ודא הקורה הוא רמה וישר ידי מאשר שהוא עובר דרך שני האירוסים כאשר הניח בין מראות עוקבות ולפני שהוא נכנס לנמל התאורה. במידת הצורך, להתאים את גובה הקורה באמצעות הרכבה פריסקופ. הסר את כל מסנני חום קצרי עוקפים ביציאת התאורה כי הייתה להחליש את הקורה.
    3. הכנס קוביית מסנן המתאמה מיקרוסקופעל מנת לשקף את אור העירור לתוך המטרה לאסוף אור הפליטה. זה בדרך כלל מורכב מסנן dichroic ארוך לעבור עם הפסקה מעל גל העירור, (למשל, 750 LP) ו מסנן מסירה ארוכת פליטה (למשל, 850 LP) כדי לצמצם עוד יותר אור העירור מפוזר מלהכות את החיישן. בנוסף, מסנן פליטה יכול להיבחר להיות סלקטיבית לפליטת SWNTs של כירליות בפרט.
    4. בצע התאמות בסדר יישור הקורה על ידי החדרת קוביית יישור מתאימה החלפה האובייקטיבית עם שני לקזז, דיסקים חלביים המכילים 1 וחורי-סיכה מ"מ. יישר את קרן למרכז הן דיסקים יישור תחתון ועליון.
    5. צרף מערך חיישן 2D InGaAs לנמל הדמיה בצד של המיקרוסקופ באמצעות מתאם מתאים ועדשה 0.5x במידת הצורך כדי להתאים את גודל החיישן.
    6. באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 100X (1.4 NA), להחיל שמן טבילה ללא קרינה ומקום immobiמדגם SWNT lized לבמה מיקרוסקופ.
    7. הרם את המטרה עד המגעים השמנים בתחתית הזכוכית המכסה (# 1.5, 170 עובי מיקרומטר). לבצע התאמות הצווארון האובייקטיבי במידת צורך תנאי הדמיה, למשל, טמפרטורה, עובי זכוכית, וכו '
    8. לאט לאט להעלות את המטרה עם מקור העירור על ולנטר את אות הקרינה של מצלמת InGaAs. עוצמת קרינה צריכה להגדיל בהדרגה כמו במישור מוקד גישות פני השטח ואת החיישנים המשותקים נכנסים להתמקד.
  2. ספקטרוסקופיה הקרינה ניר
    ניתן לבצע ספקטרוסקופיה קרינה באמצעות אותה ההגדרה מיקרוסקופ אבל על ידי הפניית האור שנאסף מחוץ לגוף המיקרוסקופ לתוך ספקטרומטר גלאי מערך ליניארי InGaAs: הערה.
    1. באמצעות mounts ומראה קינמטיקה ודורגה ניר, לכוון את נתיב האור לעבר חתך הכניסה של ספקטרומטר. פוקוס לאורך בהיר עד פויNT על הכניסה ושיסף באמצעות עדשה תוך התמקדות (למשל, Plano-קמור, f = 150 מ"מ). יישור מטרה זו מושגת על ידי הפחתת כוח לייזר כדי <1 mW והחלפת המטרה מיקרוסקופ עם מראה 1 "ושימוש קובייה מסנן 50/50 קרן מחריש. האור עירור ואז יעזבו את הגוף מיקרוסקופ דרך נמל היציאה יכול לשמש כדי להתאים את מראות עדשה למקד את הקרן על חריץ הכניסה.
    2. לאחר החלפת המטרה מיקרוסקופ ולסנן מסירה ארוכה, מניחים צלחת היטב לבמה ולהקליט את הספקטרום של מדגם פוקוס באמצעות ספקטרומטר מערך InGaAs.
  3. מדידת התגובה ההפיכה של (GT) 15 DNA-SWNTs דופאמין
    1. חיישן ההר מצופה ערוצים לבמת מיקרוסקופ ולהביא אל מוקד באמצעות מטרת שמן 100X ומצלמת InGaAs. הוסף 50 μL של 100 מיקרומטר פתרון הדופמין בופר פוספט (PBS) לערוץ הזרימה ולהקליטהשינוי בעוצמת הקרינה.
    2. יש לשטוף היטב את פתרון דופמין באמצעות בופר פוספט ולבחון את שינוי הקרינה של חיישני SWNT הפרט.
  4. ובכן-צלחת הקרנה לתגובה אנליטי של חיישני SWNTs
    הערה: הקרנת analytes השונה יכולה להתבצע באמצעות צלחת גם שקופה נשלטה באמצעות במה ממונעת. צלחת גם אידיאלית שקופה גלוי IR ויש לו צדדי שחור כדי למזער crosstalk בין הבארות.
    1. כרכי פיפטה שווים של חיישן SWNT המושעה (למשל, 5 מ"ג / L ריכוז) לתוך כל טוב, מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של האחידים היטב, בדרך כלל> 100 μL עבור צלחת 96-היטב> 30 μL עבור צלחת 384 גם .
    2. Analytes פיפטה (למשל, 2 μL, 100 נפחים סופיים מיקרומטר) מן הקרנת ספרייה לתוך הצלחות גם. הכן כל אנליטי בשלושה עותקים לתת דין וחשבון על פוטנציאל גם ל-גם וריאציה, fluctuatיונים של עוצמת עירור או טמפרטורה.
    3. הרם את המטרה (למשל, 20X achroplan, 0.45 NA) תוך מעקב אחר פליטת ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מערך InGaAs. מיקום אופטימלי של המטרה יהיה לשים את מישור המוקד בערך באמצע של נפח הדגימה בבאר, שאמור להתאים לכל היותר בעוצמת נמדדת.
    4. עבור כל טוב מדגם, להקליט חשיפה של 1-10 לאסוף קשת.
    5. השווה את ספקטרום הפליטה עבור כל טוב על פקד המכיל רק SWNTs ללא אנליטי נוסף לכמת את תגובת הקרינה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWNTs הושעו בתמיסה מימית באמצעות שני פעילי שטח ופולימרים amphiphilic ידי sonication ישיר על ידי חילופי דיאליזה. איור 1 מציג SWNTs, גדל בשיטת זירזה קרבוניל ברזל (HiPco), מושעה באמצעות SC, RITC-PEF20-RITC, ו (GT) 15 -DNA. צפיפות אופטית של SWNTs עם SDS (או פולימר) מגדיל באופן דרמטי לאחר sonication וירידות עם הסרת אגרגטים מזהמים באמצעות טיהור על ידי צנטריפוגה (איור 1). מדידות של ספיגה ב 632 ננומטר לכמת את הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWNTs מושעים בקלות בתמיסה מימית באמצעות sonication ישירה עם SDS או ssDNA, כפי שצוין על ידי גידול צפיפות אופטית שמספקת פיזור colloidal של היברידית SWNT-פולימר שהתקבל. SDS ו ssDNA מפזר ו solubilizes צרורות של SWNTs ידי adsorbing על גבי משטח SWNT באמצעות אינטראקציות הידרופוביות או pi-pi. בנוסף, פולימרים אחרים, כגון DNA גנומי, פולימרים amphiphilic, מצומדות פולימרים וליפידים, ניתן adsorbed על פני השטח של SWNTs ידי דיאליזה דגימות מושעה באמצעות SC או SDS. פולימרים הידרופיליות, כגון PEG, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרס הקריירה של קרן בורוז וולקאם בממשק המדעי (CASI), מענק של קרן סימונס ומענק חוקר צעיר של הקרן לחקר המוח וההתנהגות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS271-1
נתרן דודציל סולפטסיגמא אולדריץ'L6026
נתרן כולאט הידרטסיגמא אולדריץ'C6445
טריס בסיס (בסיס טריזמה)סיגמא אולדריץ'93362
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיקA144-212
אמין-PEG-אמין,NH<תת>2-PEG-NH2Nanocs IncPG2-AM-5k
רודמין B איזותיוציאנטסיגמא אולדריץ'283924
פלואורסצאין איזותיוציאנטסיגמא אולדריץ'F7250
דיכלורומתאןסיגמא אולדריץ'676853
דימתילפורממידסיגמא אולדריץ'D4551
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806
אתר דיאתילסיגמא אולדריץ'673811
Tris(2-carboxyethyl)פוספין הידרוכלורידSigma AldrichC4706 
DNA שעבר שינוי 5'-תיול טכנולוגיות DNA
מתוקסיפוליאתילן גליקול מלימידסיגמא אולדריץ'63187
מסנני ספין 100 kDaMillipore
HiPCO ננו-צינורות פחמן חד דופן מטוהריםאינטגריסHiPco SuperPurified
פוספט חוצץמלח סיגמא אולדריץ'P5493
אקדח אנטי סטטיMiltyMilty Zerostat 3
צנטריפוגהEppendorf5415 D
אולטרה סוניקטורקול פארמרCV18
קלטות דיאליזהThermo scientificSlide-A-Lyzer G2 87722
BSA-biotinThermo scientific29130
חלבון NeutravidinThermo scientific31000
(3-אמינופרופיל)טריאתוקסילאן (APTES)סיגמא אולדריץ'440140
מיקרוסקופ הפוךZeissAxio Observer.Z1
מראות קינמטיותפריסקופ ThorLabsKM200-E03
ThorLabsRS99
שמן טבילהZeissImmersol 518f
100X אובייקטיביZeissPlan-apochromat 100X שמן, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000
20X אובייקטיביZeissN-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 
כיסוי זכוכיתHealthrow ScientificHS159879H
דופמין הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'H8502 
מצלמת מערך אינפרא אדום דו-ממדיתפרינסטון אינסטרומנטסNIRvana
מערך חיישני אינפרא אדום 1Dפרינסטון אינסטרומנטסPyLoN IR
ספקטרוגרף nIRפרינסטון אינסטרומנטסSCT-320
עדשת פלנו-קמורהThorLabsLA1384
לוחות באר (תחתית זכוכית)קורנינג4580
משולבות במיוחד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
  2. O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
  3. Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
  4. Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
  5. Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
  6. Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
  7. Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
  8. Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
  9. Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
  10. Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
  11. Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
  12. Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
  13. Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
  14. Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
  15. Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
  16. Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
  17. Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
  18. Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
  19. Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
  20. Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
  21. Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
  22. Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
  23. Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
  24. Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
  25. Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
  26. Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241(2016).
  27. Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
  28. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
  29. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
  30. Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
  31. Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
  32. Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
  33. Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
  34. Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים