מאמר שיטה

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

DOI:

10.3791/55036

⸱

24 במרץ 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 2Clement J. Zablocki Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Surgery, Division of Pediatric Surgery, Children's Research Institute, 4Department of Orthopedic Surgery, Medical College of Wisconsin, 5Deptarment of Anesthesiology, Clement J Zblocki Veteran Affairs Medical Center, 6Department of Medicine, Division of Cardiology, Medical College of Wisconsin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את הבידוד של מטריצה חוץ-תאית לבבית מעכברי ביקורת C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5. אנו מתארים גם את מחקרי הרחבת כלי הדם על כלי הדם המבודדים מ-C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגורם הרגולטורי של אינטרפרון 5 (IRF5) חיוני לתאים כדי לקבוע אם הם מגיבים בצורה פרו-דלקתית או אנטי דלקתית. היכולת של IRF5 להחליף תאים ממסלול אחד למשנהו אטרקטיבית ביותר כמטרה טיפולית. עיצבנו פפטיד פיתוי IRF5D עם תוכנת מידול מולקולרית לתכנון מולקולות ופפטידים קטנים.

IRF5D עיכב IRF5, הפחית שינויים במטריצה החוץ-תאית ושיפר את הרחבת כלי הדם האנדותל בעכבר בעל העור המתוח (Tsk/+). ה-Kd של IRF5D עבור IRF5 רקומביננטי הוא 3.72 ±-0.74 x 10-6 M כפי שנקבע על ידי ניסויי קשירה באמצעות ניסויי אינטרפרומטריה של שכבות ביולוגיות. התפשטות תאי אנדותל (EC) ואפופטוזיס לא השתנו באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של IRF5D (0 עד 100 מיקרוגרם/מ"ל, 24 שעות). עכברי Tsk/+ טופלו ב-IRF5D (1 מ"ג/ק"ג/יום תת עורית, 21 ד'). ביטויי IRF5 ו-ICAM פחתו לאחר טיפול IRF5D. תפקוד האנדותל השתפר כפי שהוערך על ידי הרחבת כלי הדם של עורקי הפנים מעכברי Tsk/+ שטופלו ב-IRF5D בהשוואה לעכברי Tsk/+ ללא טיפול ב-IRF5D. כגורם שעתוק, IRF5 עובר מהציטוזול לגרעין. טרנסלוקציה הוערכה על ידי אימונוהיסטוכימיה על מיוציטים לבביים שגודלו על מטריצות הלב החוץ-תאיות השונות. טיפול IRF5D בעכבר Tsk/+ הביא למספר מופחת של גרעינים חיוביים ל-IRF5 בהשוואה לבעלי חיים ללא טיפול IRF5D (50 מיקרוגרם/מ"ל, 24 שעות). ממצאים אלה מדגימים את התפקיד החשוב שממלא IRF5 בדלקת ופיברוזיס בעכברי Tsk/+.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויסות צמיחת תא ומות תא תגובה חיסונית היא מרכזית תפקידה של המשפחה גורם שעתוק של גורמי רגולטוריים אינטרפרון. IRF5 מודגשת כמו להיות חיוני לוויסות התגובה החיסונית בין סוג 1, תגובה לקידום דלקתי מסוג 2, תגובה חיסונית תיקון רקמות מיקוד. IRF5 הוא מפתח סרטן 1, ו אוטואימוניות 2, 3, 4, 5.

עכבר קפוצת העור (טפו / +) הוא מודל עבור סיסטיק רקמות סקלרודרמה עקב מוטציה שכפול בגן fibrillin-1. תוצאות מוטציה זו בתוך עור חזק ועליית רקמת חיבור. עכברים אלו לפתח דלקת שריר הלב, סיסטיק ולבסוף אי ספיקת לב 5, 6, 7,> 8, 9. סקלרודרמה היא מחלה פיברוטית אוטואימוניות ומשפיעה על כ 150,000 חולים בארצות הברית 6. סימני ההיכר של מחלה זו הם סיסטיק של האיברים הפנימיים כולל הלב 7, 8, 9, 10, 11.

טבעו של המחקר דרש את העיצוב של פפטיד מעכבות. גישת התוכנה נבחרה על גישה מסורתית באמצעות תצוגת הפאג. גישת התוכנה היא קל יותר ופחות זמן רב. מאגר RCSB משמש לזיהוי אתרי קישור מתאים 12. כדי לחקור את האינטראקציה של הפפטיד החדש תוכנן עם חלבון רקומביננטי להתמקד הפרמטרים הכבילה למעסיק, interferometry biolayer שנקרא טכניקה היה בשימוש. אינטרפרומטריה Biolayer הוא techniq מבוסס biosensorue הקובע זיקה מחייבת, עמותה וניתוק באמצעות biosensor ומדגם מחייב. Biosensor יכול להיות פלורסנטי, luminescently, radiometrically ו colorimetrically שכותרתו. המדידה מבוססת על תוספת מסה או דלדול דומת עמותה וניתוק 13, 14. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להבין את התפקיד של IRF5 בדלקת שריר הלב סיסטיק. המטרה היתה לקבל תובנות לגבי התפקיד של IRF5 בפיתוח סיסטיק רקמות סקלרודרמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם המלצות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. הפרוטוקול אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש (פרוטוקול: AUA # 1517). כל המחקר מעורב עכברים נערך בהתאם למדיניות PHS.

עיצוב 1. הפתיונות פפטיד

  1. מצא את מבנה 3D של IRF5 ולבסס את העיצוב על זה. עיצוב 17 mer, כינה IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), שבו aspartate (D) מוחלף סרין (S) לחקות זירחון ב IRF5 ב 421 - 438 (ELSWSADSIRLQISNPD). ניתוח של קבוצות sulfhydryl 3D והכרת המנגנון של IRF5 הפעלה, כלומר, זרחון סרין, הציע אסטרטגיה אחת למיקוד IRF5 הייתה לייצר פפטיד דמה. ראה איור 1. כדי לזהות את האזור הטוב ביותר במבנה 3D, להשתמש בתוכנת הדמיה מולקולרית לעיצוב molecul הקטןes ופפטידים 15.
    הערה: השלב הקריטי בתהליך זה הוא הזמינות של מבנה 3D של חלבון המטרה ואתרי המחייב האפשריים. מבנה 3D של IRF5 מייצג באופן מדויק כיצד dimerizes IRF5 לאחר זירחון. ההחלפה של אספרטט עבור סרין או תראונין במיקור חוץ. הפפטיד הוא מסונתז בנפרד שאינו קשור IRF5.
  2. לשכפל את תחום phospho פשוט על ידי החלפת D עבור ס בהתבסס על הרצף המקורי (ELSWSADSIRLQISNPD, לבצע IRF5S פפטיד חדש עם רצף החומצות האמיניות של Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D).

2. Interferometry Biolayer (BLI)

הערה: טיהור IRF5 רקומביננטי במיקור חוץ. 16

  1. התווית ביוטין IRF5 ב טוחנת יחס של 1: 1 של ביוטין ליגנד עם ריאגנט biotinylation המשלב מקשר בשרשרת ארוכה. ומקשר השרשרת הארוך יבטיח Liga פעיל יותר הומוגניתמשטח nd.
    1. הוסף 1 מ"ל של 2 מ"ג / מ"ל ​​IRF5 עד 13 μL של מגיב ביוטין 20 מ"מ או להגדיל את נפחי במידת הצורך. לדגור על קרח במשך 2 שעות. לאחר תיוג, השתמש טור ספין desalting להסיר את תערובת התגובה של חלבון הנקרא.
  2. דגירה ליגנד שכותרתו ביוטין עם biosensors במשך 15 דקות. הימנע על התיוג ולהתאים ביחס של 1: 1 הטוחן. לאחר תיוג, השתמש טור ספין desalting להסיר את תערובת התגובה של חלבון הנקרא.
  3. דגירה biosensors IRF5 שכותרתו ביוטין במשך 10 דקות בריכוזים שונים של הפפטיד דמה IRF5. שיעורי ההתאגדות דיסוציאציה נקבעו כמתואר 10, 17, 18.

מבחני 3. אפופטוזיס ושגשוגם

  1. Assay הפצת נשק באמצעות bioreduction של tetrazolium
    1. לנהל IRF5D מדולל PBS (1 מ"ג /ק"ג / ד, להזריק נפח 20 μL ב עכבר 20 גרם) תת עורי עם מחט 27-מד ידי טכניקה scruffing רגיל או על ידי PBS לבד כדי Tsk / + ו C57Bl / 6J במשך 21 ימים.
    2. להרדים את העכברים עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב.
    3. Lyse את ליבם עם חיץ חלבון תמוגה המכיל 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.5% NP-40, 250 מ"מ NaCl, 5 EDTA מ"מ, 50 מ"מ NaF 10 ולקבוע ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay 19.
    4. מעיל צלחות 96-היטב עם C57Bl / 6J מטריקס הלב מבודד כמתואר בסעיף 7. לדלל את PBS מושעה C57Bl / 6J מטריקס לב לריכוז של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולהוסיף 30 μL של הלב C57Bl / 6J היטב כל אחד. תן לו להתיישב לילה בשעה 37 ° C בחממה.
    5. תאי וריד תרבות טבור אנושיים באמצעות 500 מיליליטר של מ 'בסיס אנדותלedia עם תמצית מוח 0.4% שור, חומצה אסקורבית 0.1%, 0.1% הידרוקורטיזון, 0.1% גורם גדילה באפידרמיס אנושי, 2% בסרום שור עוברי 0.1% גנטמיצין / amphotericin B להתווסף אליו. התרבות התאים על 96 צלחות גם ב 5% CO 2 ו -95% באוויר חדר עם צפיפות של 25,000 תאים בכל טוב. לגרות עם ריכוז גדל והולך של IRF5D בין 0 - 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתוך התקשורת (כרכים היו בין 0 ל 50 μL / מ"ל).
    6. קבע את התפשטות התאים לאחר שלושה ימים להעריך הבדלים ספיגים על קורא microplate. התגובה הינה bioreduction של המתחם tetrazolium MTS. NADPH או NADH מופק על ידי אנזימי dehydrogenase בתאים פעילים מבחינה מטבולית.
    7. כמתחם tetrazolium MTS מאוחסן קפוא ב -20 ° C, להפשיר את המתחם לאט מעל כ 90 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה 20 μL לבאר כל צלחת 96 באר, ולהוסיף 100 μL של התקשורת בתרבות אליו. דגירה צלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 עד 4 שעות ב humidified, 5% CO 2 קאמרית.
    8. קרא ספיגת באורך גל של 490 ננומטר.
  2. Assay אפופטוזיס באמצעות פעילות caspase
    הערה: ניסוי ההגדרה זהה מעל 3.1.1 כדי 3.1.5.
    1. לגרות את התאים עם ריכוז גדל והולך של IRF5D בין 0 - 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתוך התקשורת.
    2. הוספת זיהוי ירוק למצע caspase 3/7 אל ECS ו דגירה אותו במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להעריך את הקרינה על הקורא microplate בד בבד עם גל קליטה / פליטה של ​​502/530 ננומטר. הפעל את הניסויים בשלושה עותקים.
      הערה: הסוכן פלואורסצנטי הירוק הוא פפטיד ארבע חומצות אמינו חייב לצבוע מחייב חומצות גרעין. מגיב זה הופך ניאון כאשר בקעו לאחר caspase 3 והפעלה 7. קרינה זו נמדדת. היתרון הוא הפחתת שלבים לשטוף.

הערכה 4. IRF5 והביטוי ICAM-1 Heart

  1. נהל IRF5D מדולל PBS (1 מ"ג / ק"ג / ד, להזריק נפח 20 μL ב עכבר 20 גרם) תת עורי עם מחט 27-מד ידי טכניקה scruffing רגיל או על ידי PBS לבד כדי Tsk / + ו C57Bl / 6J פעם ליום במשך 21 ימים.
  2. להרדים את העכברים עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב.
  3. Lyse את ליבם עם חיץ חלבון תמוגה המכיל 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.5% NP-40, 250 מ"מ NaCl, 5 EDTA מ"מ, 50 מ"מ NaF 10 ולקבוע ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay 19.
    1. בצע כתם מערבי על lysates של לבבות. לדלל את הדגימות עד 25 מיקרוגרם חלבון סך נפח של 40 μL עם חיץ מדגם Laemmli המכיל 5% mercaptoethanol. הפעל את הדגימות על 4 - ג'ל 15% TGX ב -50 mV למשך 5 דקות. גדל מתח ל -100 mV עבור h 1 עד בחזית לצבוע שנגמרה.
    2. מניחים את הג'ל במאגר 1x ההעברה (25 מ"מ טריס, 190 גליצין מ"מ, 20% מתנול, כדי להתאים את pH 8.3 במידת הצורך) דגירה במשך 10 - 15 דקות.
    3. הרכב את כריך ההעברה (ספוג, מסנן, ג'ל, קרום תאי, מסנן, ספוג). ודא שאין בועות לכודים בין. הכתם צריך להיות על הקתודה לבין הג'ל על האנודה. העבר של 1 ש 'בחדר קר ב 100 מילי-אמפר.
    4. למחרת, לשטוף את הכתם ואז לחסום כשהרקע 5% חלב יבש ללא שומן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את הכתם עם טריס שנאגר מלוחים המכילים 5% Tween שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    5. דגירת הלילה עם הנוגדנים הראשוניים באמצעות נוגדני polyclonal עיקריים IRF5 או ICAM-1. לדלל את הנוגדנים טריס שנאגרו מלוחים ב דילול 1: 1,000.
    6. לדלל את הנוגדנים משני טריס שנאגרו מלוחים הדגירה כתם עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר. עבור נוגדנים משני, חמור מצומדות peroxidase חזר שימוש אנטי העכבר איגG (1: 10,000) ו IgG נגד עז חזרה החמורה peroxidase (1: 10,000), בהתאמה.
    7. החל chemiluminescence אל הכתם לאחר רכיבי ערבוב על פי הפרוטוקול של יצרן דגירה במשך 3 דקות כדי luminesce הלהקות של עניין. לחשוף את הכתם סרט רנטגן. השתמש ImageJ למדידת צפיפות. לנרמל את ערכי צפיפות הלהקות המלאות 10.

הערכת 5. של מספרים סלולריים דלקתיים לאחר IRF5 עיכוב

  1. נהל IRF5D מדולל PBS (1 מ"ג / ק"ג / ד) תת עורי עם מחט 27-מד ידי טכניקה scruffing רגיל או על ידי PBS לבד כדי Tsk / + ו C57Bl / 6J במשך 21 ימים.
  2. להרדים את העכברים עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב. הצמד להקפיא ולאחסן את לבם ניכר עד ניתוח.
  3. הר הלבבות הקפואים על Tissמחזיקי ue הולם cryostat בשימוש. חותכים 10 מיקרומטר חלקים קפואים עבה על cryostat אימונוהיסטוכימיה.
  4. תקן את חלקים קפואים עם paraformaldehyde 1% בופר פוספט במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize את החלקים עם 0.5% Triton-X 100 ב PBS במשך 5 דקות.
    זהירות: Paraformaldehyde הוא קרצינוגן מוסדר וצריך לטפל בהם בזהירות.
  5. לדלל CD64 ארנבת אנטי, סמן מונוציטים / מקרופאג 1: 200 ב PBS. החל על סעיפים קבועים דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
  7. לדלל אנטי עכברוש NIMP, סמן נויטרופילים עיקרי 1: 200 ב PBS. החל על סעיפים קבועים דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. שטפו את השקופיות עבור 5 דקות שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.
  9. לדלל את נוגדנים משני ארנבת אנטי Alexa 488 מצומדות ואנטי-עכברוש אלקסה 488 מצומדות 1: 200 ב PBS.
  10. החל ארנבת אנטי Alexa 488 מצומדות ואנטי-עכברוש אלקסה 488 נוגדנים משני מצומדות בסעיפים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהתאם. היקף הנוגדן משתנה בהתאם לגודל של הסעיף. הסכום אמור לכסות את הסעיף בנדיבות. ברוב המקרים את עוצמת הקול הוא בין 100 ל -200 μL.
  11. השתמש 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ככתם גרעיני דילול 1: 1,000 ב PBS. הוסף 1 μL לתוך 1 מ"ל PBS ולהשתמש DAPI בשלב לשטוף האחרון. הוסף מדיה הרכבה מימית תלוש כיסוי והכניס אותו לשקופית.
  12. לנתח את הסעיפים שכותרתו fluorescently על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות מטרת שמן 40X. השתמש עירור אורכי גל 488 ופליטת אורכי גל של יותר מ 530 ננומטר עבור CD64 ו NIMP. DAPI התלהב עם 360 ננומטר הנפלט ב 460 ננומטר בכחול. להבדיל מונוציטים / מאקרופאגים נויטרופילים (n = 10 תמונות לכל נוגדן, בין 3 עכברים שונים בכל קבוצה) על ידי התיוג השונה שלהם ולספור אותם. לבטא מידע כמו מספר התאים נספרו.

תא 6. Vasodilation Dependent לאחר עיכוב IRF5

  1. להרדים C57Bl / 6J מלאה Tsk / + עכברים עם ובלי טיפול הפפטיד עם קטמין (80 - 100 מ"ג / ק"ג) / xylazine (10 - 12.5 מ"ג / ק"ג) תערובת. להזריק את התערובת קטמין / xylazine intraperitoneally. לרסן את העכבר באופן ידני.
    1. השתמש 25 מד או מחט קטנה. הכנס את המחט לתוך ברבע הימני התחתון של הבטן. למשוך את הבוכנה לפני הזריקה על מנת להבטיח כי המחט לא להיכנס כלי דם או המעי.
  2. לאחר לרמה של הרדמה מספיק הושג, לאבטח את העכבר במצב שכיבה, לנגב את הפרווה עם פד גזה ספוג אלכוהול, ושימוש זוג מספריים ופתח את חלל בית החזה ולהסיר את הלב.
    הערה: Exsanguination יהיה להרדים את העכבר ולעשות לנתיחה יותר על ידי להקלת הלחץ בכלי הדם ובכך לצמצם דימום בעת חיתוך כלי הדם.
    1. פתח את usin העורזוג מספרי ga, חותך מן לרוחב החזה אל עצם הלסת עם אכפתיות לתוצאה לא להפריע הרקמות הבסיסיות כלפי חלק הקדמי של הלסת.
    2. לנתח את עורק facialis ידי הסרת הרקמות הרכות סביב זה.
    3. זהירות: אל לפגוע בכלי השיט או משיכה על העורק facialis תוך שמירה על רקמות חשוף שטוף חיץ מגבים (2.0 מ"מ CaCl 2 · 2H 2 O, 0.02 mM EDTA, 5.0 גלוקוז מ"מ, 4.7 מ"מ KCl, 1.17 מ"מ MgSO 4 · 7H 2 O, 3.0 מגבים מ"מ, 145 מ"מ NaCl, 1.2 מ"מ לאא 2 PO 4 · H 2 O, 2.0 מ"מ פירובט) כדי למנוע התייבשות. בצע תחת מיקרוסקופ לנתח זום סטריאו המשקפת (הגדלה של 3.5x כדי 45X) ומקור אור סיבים אופטיים.
  3. לבודד את עורק facialis.
    1. אחוז הפרוקסימלי facialis אל הסתעפות ו דיסטלי הראשון שבו העורק יקוצץ. חותך את העורק מעורק ההורה, עורק התרדמה החיצוני. הסר את facialis arterieים מעכברים שליטים, טפו / + עכברים עם ובלי טיפול IRF5D.
    2. בעוד עדיין מחזיק את עורק המלקחיים, לחתוך את שני הסניפים מגיעים מחוץ facialis, המאפשר הכלי שירים בעדינות בעוד כל רקמה שמסביב נימול ניתן לזהות ניתק.
    3. המשיך בדרך זו עד ההסתעפות הוא הגיעה חותכי עורקים הבת לשחרר את הכלי. אין צורך לצבוט את הכלי לפני חיתוך בשל לחץ קל בכלי הדם מן הסרת הלב. מכניס את הכלי במאגר מגבים תוך עורק facialis האחר הוא גזור ומבודד.
    4. Cannulate הכלי על ידי קשירה אותם על טפטפות זכוכית בקוטר מסוף 125 - 175 מיקרומטר. טען מראש את טפטפות זכוכית ומאגרי חיץ עם חיץ מגבים.
      זהירות: מנע בועות אוויר מ טביעה טפטפות.
    5. לקשור את הכלי על טפטפות באמצעות תפרי עיניים.
  4. הר לתאי הכלי על micr triocular הפוךoscope עם קובץ מצורף מצלמת וידאו. הפעל את הווידאו באמצעות מערכת מדידת קליפר וידאו על מדידות מסך של הכלי. 20
    1. לחצים אותם תהליך בן שני שלבים. ראשית, עם המאגרים מלאי מגבים בגובה מעל הכלי השווה ללחץ 20 מ"מ כספי, באופן ידני לפתוח את שסתומי ברזלים בקווי המאגר לכלי השיט. בדוק את כלי סימנים של דולף סביב קשרים ובמורד אורך הספינה. שנית, להעלות את מאגרי עד 60 מ"מ כספית ו reinspect הספינה.
    2. לאחר בלחץ ב -60 מ"מ כספית, לאפשר כלי כדי לאזן במשך 30 דקות.
  5. על מנת להעריך התרחבות בתגובה אצטילכולין (10 -7 עד 10 -4 M), preconstrict הספינה כדי בקוטר 50 - 75% של הקוטר המרבי שלה באמצעות 1 - 3.0 x 10 -8 עד 10 -7 U46619 M. לאחר המאפשר הכלי לייצב במשך 6 דקות, להוסיף אצטילכולין לאמבטיה בצעדי משך 2 דקות כךריכוזים סופיים באמבטיה הם 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. מדוד את ההתרחבות בכל שלוש הקבוצות.

בידוד 7. של Cardiac תאי מטריקס

  1. להרדים C57Bl / 6J מלאה Tsk / + עכברים עם ובלי טיפול הפפטיד עם isoflurane (5%) ולבצע נקע בצוואר הרחם. ובלו הלבבות על ידי חיתוך לפתוח את החזה לאורך עצם החזה. הרם את הלב עם מלקחיים ולהסיר את הלב.
  2. מכניסים את הלב הסיר לתוך מבחנה ולהוסיף 15 סולפט dodecyl מ"ל היפרטוני 1% נתרן (SDS). להתסיס לבבות הפתרון 1% SDS במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר כדי לשבור את התאים על ידי הוספת בר ומערבבים לפתרון 1% SDS ומכניסים את הכוס על צלחת ומערבבים.
    זהירות: עליך להיות מודעת לכך מטריקס יתפורר אם נותר זמן רב מדי פתרון היפרטוני. לעומת זאת, אם את ליבם אינם נסער מספיק זמן בתמיסה היפרטוני, אז התאים לא כראוילפזר ויהיו פסול תא השאיר בכוס.
  3. לשטוף למשך 30 דקות ב 15 מ"ל 0.5% Triton X-100. לאחר מכן לשטוף במשך 15 דקות עם 15 מ"ל PBS. Decellularize כל לב בנפרד.
  4. הצמד להקפיא את תאי מטריקס בחנקן נוזלי powderize מטריקס הלב הקפוא עם במכתש ועלי מראש מקורר.
  5. לעשות השעיה של מטריקס מרסקים PBS המכיל אנטיביוטיקה 1%. ההיקף הוסיף ברוב המקרים הוא 300 μL. Sonicate ההשעיה עבור 30 - 60 s על קרח על ההגדרה הגבוהה.
    הערה: חשוב מאוד כי המדגם שומר קר. שימו לב כי ההשעיה היא צמיגה מאוד בשל תכולת חלבון גבוהה glycan.
  6. קביעת ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד.
    הערה: ודא שיש אנטי ביוטיים ואנטי פטרייתי ההשעיה. פניצילין / סטרפטומיצין הם נפוצים ביותר ומומלצים.

8. הערכת טרנסלוקציה הגרעיני על ידי Immunohistochemistר"י

  1. כדי מעיל מנות ומגלשות להשתמש לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​של תאי מטריקס הלב ב PBS. Pipet 500 μL של פתרון מטריקס הלב לתוך צלחת 100 מ"מ עבור ציפוי 150 μL של פתרון מטריקס הסופי לשקופית.
  2. לעכב IRF5 ידי הוספת IRF5D בריכוז 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​במשך 24 שעות להלשין myocytes לב בילוד בתרבות. השאירו לשלוט תרבויות myocyte מטופל.
  3. להעריך סחר IRF5 מן cytosol אל immunofluorescence באמצעות גרעין ולנתח ידי מיקרוסקופיה confocal. זהה את התיוג הירוק IRF5, לזהות את כתם DAPI כחול הגרעין
  4. החל את הנוגדן אנטי IRF5 העיקרי. הנוגדן העיקרי ששימש דילול 1: 200 ב PBS. דגירת השקופיות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ופעלתי עם שלושה שלבים לשטוף 5 דקות. הנוגדן המשני היה Alexa 488 שכותרתו עזה נגד עכבר נוגדן IgG.
  5. לדלל את הנוגדנים משני 1: 1,000 di lution ב PBS. דגירת הנוגדנים משני למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להשיג גרעיני כתם עם DAPI. לדלל DAPI 1: 1,000 ב PBS. שטפו את השקופיות סך של 3 פעמים במשך 5 דקות ולהוסיף DAPI לשלב לשטוף השלישי והאחרון.
  6. סחר לכיד באמצעות מיקרוסקופיה confocal ועוצמת קרינה מודדת את הגרעינים ואת cytosol כפי שתואר לעיל 10. זהה את התיוג הירוק IRF5, לזהות את כתם DAPI כחול הגרעין. התאים כי תערוכת גרעינים כחולים עם תיוג ירוק בם מכילים מופעל IRF5, אשר נסחר מן cytosol לגרעין. כאשר IRF5 אינו מופעל תיוג ירוק נמצא cytosol.
  7. לנתח את התאים שכותרתו fluorescently על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות מטרת שמן 40X. השתמש גל עירור של 488 באורכי גל nm ופליטה של ​​יותר מ 530 ננומטר עבור IRF5. השתמש גל עירור של 360 ננומטר ו אורך גל פליטה של ​​460 ננומטר עבור להדמיה של DAPI.

התחת = "jove_title"> 9. סטָטִיסטִיקָה

  1. בצע ניתוח שונה (ANOVA) עבור מדידות חוזרות בתוך ובין קבוצות. עקוב ANOVA עם שינוי של Bonferroni של סטודנטים מבחן t. לבטא מידע כטעות תקן של הממוצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות הראו באיור 1 להראות כיצד לעצב פפטיד. איור 1, השמאלית העליונה, מראה את האזור (בין 2 חצים צהובים, חומצות אמינו (אא) 425-436) ב IRF5 כי עובר פוספורילציה על ידי מספר קינאזות. איור 1, ימני עליון, המראה סגלגל צהוב שבו תחום פוספורילציה של IRF5 נקשר. מבנה dimeric של 3DSH היה לסובב להתבונן שסוע או עמק שמאלה של 2 Helix (aa303-312). זוהי הנקודה בה את תחום זנב phospho של IRF5 אמורה לאגד כאשר הוא יופעל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה היתה לעצב מעכב IRF5 מנת להבהיר את התפקיד של IRF5 על דלקת, פיברוזיס, ואת תפקוד כלי הדם בליבם של עכברים Tsk / +. הממצאים כי IRF5D לא לגרום התפשטות או אפופטוזיס. יתר על כן, דלקת צומצמה שיפור תפקוד כלי דם. נתונים אלה מראים כי IRF5 ממלא תפקיד מכניסטית חשוב בהתפתחות של דלקת ופיברוזיס בלב Tsk / + עכברים וכי יש לו את הפוטנציאל לשמש מטרה טיפולית.

הצעד הראשון היה לעצב מעכב. כאשר הפפטיד נועד, כמה נקודות צריכות להילקח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ה-NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) ו-HL-102836 (KAP) ו-Cimphoni Life Sciences (חלק ממשכורת DW). המחברים מודים למייגן סיטסמה על עריכת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  Triton X 100Sigma AldrichX100- 100 מ"ל
Alexa 488-labeled עזים נגד עכבר נוגדן IgG תרמו פישרA11001
מגיב ברדפורדתרמו פישר23200פירס 
חיישנים ביולוגייםForte-BioMR18-0009
CD64 (H-250)Santa Cruz Biotechnologiessc-15364
CellEvent Caspase-3/7 SubstrateThermo Fisher/Life TechnologiesC10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Kit ערכת בדיקהPromegaG3580Promega
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo FisherD-13061:1,000 דילול ב-PBS
חמור אנטי חולדה Alexa 488Thermo FisherA-212081:1,000 דילול ב-PBS
ECL בתוספתGE Healthcare/AmershamRPN2133לאחר הרבה ניסוי וטעייה חזרנו
לזה מיקרוסקופ Eclipse TE 200-U עם תוכנת סריקת לייזר EZ C1Nikon
goat anti rabbit Alexa 488Thermo FisherA-110081:1,000 דילול ב-PBS
HRP  נגד עזיםסנטה קרוז ביוטכנולוגיותsc-516086!:10,000 דילול ב-TBS
HRP חמור נגד עכברסנטה קרוז ביוטכנולוגיותsc-23151:10,000 דילול ב-TBS
נוגדן ICAM-1סנטה קרוז ביוטכנולוגיותsc-15111:200 דילול בנוגדני PBS
IRF5 (H56)סנטה קרוז Biotechnologiessc-98651
קורא צלחות מיקרו Elx800Biotek
NIMP סמן נויטרופיליםסנטה קרוז ביוטכנולוגיותsc-1338211:200 דילול ב-PBS
Octet REDForte עיצובפפטיד קשירת חלבון-חלבון
nbsp; תוכנת Medit SARCSB.org
סינתזת חלבון IRF5 רקומביננטיתTopGene Technologiesביטוי חלבון, שירות סינתזה
נתרן דודציל פוספטסיגמא אולדריץ'436143חומר ניקוי
קטמיןבית מרקחתלוח זמנים III חומר מבוקר, נדרש presciption 
XylazineMedVet
3.5X-45X מיקרוסקופ סטריאו זום חיתוך משולש עם נורות LED צוואר אווזAm Scopeמק"ט: SM-1TSX-L6W
עמודי התפלה ZebaThermofisher2161515
Endothelial Basal Media ערכת EBM BulletLonzaCC-3124מכילה תוספי גדילה
VIA-100K  Boeckeler Instruments
4 - 15% ג'ל TGXBio-Rad5671081
תוכנת MedSuMoMedit, Palaiseau, צרפת
Laemmli BufferBioRad
ביו& ערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bi, X., et al. Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis. Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).
  2. Dideberg, V., et al. An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases. Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).
  3. Graham, R. R., et al. A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus. Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).
  4. Krausgruber, T., et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).
  5. Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease. Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).
  6. Mayes, M. D., et al. Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis. Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).
  7. Dimitroulas, T., et al. Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease. Curr Pharm Des. , (2013).
  8. Botstein, G. R., LeRoy, E. C. Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches. Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).
  9. Oram, S., Stokes, W. The heart in scleroderma. Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).
  10. Xu, H., et al. 4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice. PLoS One. 7 (12), 52046(2012).
  11. Steen, V. The heart in systemic sclerosis. Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).
  12. Deshpande, N., et al. The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema. Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).
  13. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).
  14. Matthew, A. Current biosensor technologies in drug discovery. Drug Discovery. , 69(2006).
  15. Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. A review of MED-SuMo applications. Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).
  16. Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).
  17. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry. PloS one. 9 (9), 106882(2014).
  18. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  20. Bauer, P. M., et al. Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase. J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).
  21. Weihrauch, D., et al. An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice. PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).
  22. Hoogenboom, H. R., et al. Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).
  23. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  24. Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).
  25. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  26. Ou, J., et al. L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease. Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).
  27. Weihrauch, D., et al. Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).
  28. Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects. Mavragani, C. , 35(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IRF5ECM

מאמרים קשורים