מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

Summary

המטריצה החוץ-תאית ממלאת תפקיד מרכזי בהגדרת המיקרו-סביבה של התאים ובוויסות התנהגות התא והפנוטיפ. אנו מתארים שיטה מהירה לבידוד מטריצה חוץ-תאית שמקורה בתאים, שניתן להתאים לקני מידה שונים למחקרים מיקרוסקופיים, ביוכימיים, פרוטאומיים או פונקציונליים.

Abstract

המטריצה החוץ-תאית (ECM) מוכרת כסביבה מגוונת, דינמית ומורכבת המעורבת בתהליכים תאיים-פיזיולוגיים ופתולוגיים מרובים. עם זאת, הבידוד של ECM, מרקמות או מתרבית תאים, מסובך על ידי האופי הבלתי מסיס והצולב של ה-ECM המורכב ועל ידי הזיהום הפוטנציאלי של תמציות ECM עם פני התא וחלבונים תוך-תאיים. כאן, אנו מתארים שיטה לשימוש עם תאים מתורבתים שהיא מהירה ומסירה תאים באופן אמין כדי לבודד ECM שמקורו בתאים לניסויים במורד הזרם.

באמצעות שימוש בשיטה זו, ניתן לדמיין את ה-ECM המבודד ומרכיביו על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית באתרה. ניתן לעקוב אחר הדינמיקה של חלבוני ECM ספציפיים על ידי מעקב אחר שקיעה של חלבון מתויג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הן לפני ואחרי הסרת התאים. לחלופין, ניתן לחלץ את ה-ECM המבודד לניתוח ביוכימי, כגון אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) ואימונובלוטינג. בקנה מידה גדול יותר, ניתן לבצע ניתוח פרוטאומיקה מלא של ה-ECM המבודד על ידי ספקטרומטריית מסה. על ידי ביצוע בידוד ECM בתנאים סטריליים, ניתן להשיג שכבות ECM סטריליות למחקרים פונקציונליים או פנוטיפיים עם כל תא מעניין. ניתן ליישם את השיטה על כל סוג תא דבק, היא קלה יחסית לביצוע, וניתן לקשר אותה לרפרטואר רחב של עיצובים ניסיוניים.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, תאי מטריקס (ECM) הפך מוכר בסביבה מגוונת, דינאמית, ומורכב כי הוא מעורב מספר תהליכים בתא-פיזיולוגיים ופתולוגיים. ברמת הרקמה, ECM משפיעה תא איתות, תנועתיות, בידול, אנגיוגנזה, גזע ביולוגיה של תא, tumorigenesis, סיסטיק, וכו ^'1,2. המחקר של ארגון ECM ותהליכים תלויי ECM ולכן יש השלכות רחבות על ביולוגיה של התא ופיזיולוגיה רקמות. כדי להגיע להסכם בנות מכניסטית של רכב ECM, ארגון תכונות פעילות, שיטות הבידוד המדויק של ECM נדרשות. בעוד זיהוי המוקדם של חלבוני ECM לסמוך עליו בידוד מרקמות ^3, הכנת ECM מ תאים בתרבית עכשיו הפכה נפוצה יותר.

הבידוד והניתוח של ECM תאים שמקורם הוא מסובך משתי סיבות עיקריות. ראשית, הנוכחות של תאים ואתחלבונים תאיים ir בשפע יכולים לעשות את זה קשה לבודד את ECM כמבנה תאי בדיד. ואכן, כמה חלבונים ECM יש תפקידים בתוך התא כמו גם ב ECM ^4; ולכן, ההסרה היעילה של חלבונים תאיים מ ECM תאים שמקורם היא חיונית אם המחקר של חלבונים בתוך ECM הוא לא להתבלבל עם התפקידים שלהם בתוך התא. שנית, ECM תאים שמקורם מורכב חלבונים גדולים, oligomeric רבים, אשר לעתים קוולנטית צולב על הרכבת ECM ולכן הם מסיסי דטרגנטים סטנדרטיים. מאפיינים אלה יכולים לסבך חילוץ ואת הניתוח הנוסף של ECM. כדי לטפל בבעיות אלה, שיטה נדרשת המאפשרת הפרדה היעילה של חלבוני ECM מ מרכיבים תאיים.

מספר שיטות תוארו בספרות עבור הבידוד של ECM מתרבה או תא או תמציות רקמה. רבי השיטות אלה מכוונים החילוץ של יחסי ציבור ECM בשפעotein, קולגן, מרקמות וכוללים את השימוש במלחים נייטרלי ^3, בתנאים חומציים ^5,6, או פפסין ^7. בידוד של ECM הכולל מתמציות רקמות כרוך לעתים קרובות decellularization של הרקמה לפני הבידוד של ECM. לדוגמא, שיטת חילוץ רציפה תואר המבודדת ECM מרקמות לב אנושיות ^8. ראשית, חלבונים ECM-המרופט חולצו עם 0.5 M NaCl לפני סולפט dodecyl נתרן (SDS) שימש כדי להסיר את התאים. לבסוף, חלבוני ECM שנותרו חולצו באמצעות 4 M guanidine ^8. ECM ניתן solubilized גם מדגים decellularized באמצעות 8 אוריאה ז ^9. טכניקות אחרות להשתמש בחומרי ניקוי, כגון חומצת deoxycholic ^10, כדי לחלץ שני תאי ECM לפני פרידת חלבוני ECM מסיסים מן lysate התא המסיס על ידי צנטריפוגה.

השיטה לבידוד וניתוח של ECM תאים שמקורם שתוארו בדו"ח זה מספק reproשיטת ducible להסרת חומר התא, משאיר ECM תאים שמקורם כי ניתן לנתח על ידי ב immunofluorescence באתרו או חילוץ לאנליזה ביוכימית נוספת. שיטה זו ניתן להתאים לכל סוג תא חסיד וניתן לשנותם לפייסבוק נהלים במורד זרם, כגון immunoblotting או ספקטרומטריית מסה, או לניצול של ECM המבודד במחקרים פונקציונליים. השיטה יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal של תאים חיים לעקוב בתצהיר ECM של חלבון מתויג עניין בזמן אמת. זו מושגת באמצעות שימוש צלחת gridded, תחתית זכוכית. בסך הכל, הגישה מספקת בידוד מדויק של ECM תא הנגזרות וגם ההיקף לזהות ולנטר בתצהיר ודינמיקה של חלבוני ECM פרט.

Protocol

הסרת 1. של תאים עם אמוניום הידרוקסיד פתרון

1. כן תאים חסידים על ידי ציפוי על הצפיפות המתאימה.
   הערה: התאים יכולים להיות כל סוג תא חסיד שמייצר ECM מספיק לניתוח. כאן, אנו מתארים את השימוש של COS-7 תאים, קו דמוי תא פיברובלסטים כליה של קופים ירוקים אפריקאיים המכיל SV-40 רצפי DNA הנגיפי; RCS, קו תא כונדרוסרקומה חולדה; או פיברובלסטים עורי אדם נורמלי (HDF) זנים מן העורלה לנוער. HDF משמש מפסוק 1 למעבר 8 בלבד.
   1. פלייט התאים על coverslips עבור ההדמיה של תאי חיים ו ECM, ללימודי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של ECM הקבוע, או עבור הכנת ECM תאים שמקורם עבור מבחנים תפקודיים בקנה מידה קטנה. פלייט התאים על צלחות תרבית תאים לניתוח SDS-PAGE, immunoblot, או מחקרים פרוטאומיקה.
      הערה: תנאי תרבית תאים (מספר התאים לצלחת ובינוניים תרבות) תהיה תלויה בסוג התא. מספר התאים לצלחת יצטרךתוקם באופן אמפירי עבור זן קו או תא תא מסוים.
   2. אפשר זמן מתאים התאים להפקיד ECM, בדרך כלל> 16 שעות. הערה: פרק הזמן יהיה תלוי בסוג התא יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי. אם ניצוח ביטוי אקטופי, לאפשר זמן מתאים עבור הביטוי של החלבון טרנספקציה של ריבית להפקדה של ECM.
2. במאמר קולט אדים, הכן 20 מ"מ אמוניום הידרוקסיד בתוך כלי מתאים על ידי דילול פתרון המניות 1/14 עם דה מיונן H ₂ O.
   1. הסרת התאים מן החממה בעדינות להסיר בינוני התרבות. להוסיף בופר פוספט (PBS) ללא Ca ^{2 +} / Mg ²⁺ ידי שפיכת בעדינות כנגד קירות של המנה. רוק המנה פעם ולהסיר את הנוזל עם טפטפת העברת פלסטיק. חזור פעמיים נוספות.
3. במאמר קולט אדים, להטות כל מנה ולהסיר את PBS משלב 1.2 עם טפטפת העברת פלסטיק. הוסף 3מ"ל של אמוניום הידרוקסיד לכל צלחת 100 מ"מ ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. במהלך תקופת הדגירה של 5 דקות, בעדינות להתסיס את התבשיל מידי דקות כדי להבטיח את תמוגה של כל התאים. שלבי 1.4-1.7 גם יבוצעו ב קולט אדים.
   הערה: ריאגנטים להסרת תאים חלופיים כוללים 2 M או 8 M אוריאה, אשר מודגרת עם תאים במשך 10 דקות.
4. להוסיף כמויות עצומות של H דה מיונן ₂ O על כל מנה, לפחות 20 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ, עם נדנדה. השלך את אמוניום הידרוקסיד-solubilized חומר המורכב אמוניום הידרוקסיד, תאים lysed, ודה-מיונן H ₂ O-ידי שאיפה עם טפטפת ההעברה. עבר פתרון פסולת זו לתוך מכל להעברת פסולת נוזלית.
5. שטפו את שכבת ECM מסיס H שופע דה מיונן ₂ O ארבע פעמים נוספות על מנת להבטיח הסרה מלאה של כל החומר הידרוקסיד-solubilized אמוניום.
6. לצורך בחינה של ECM על ידי immunofluorescence, לתקן את ECM על ידי הוספת 2%paraformaldehyde (PFA; 3 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   זהירות: PFA מאוד מסוכנים במקרה של מגע עם העור או העיניים חשיפת יתר חמורה יכולה לייצר נזק ריאתי, חנק, חוסר הכרה, או מוות. זה צריך להיות מטופל רק קולט חולץ, וציוד מגן אישי צריך להיות משוחק.
7. לשטוף כל מדגם קבוע פעמים עם PBS, כמו בשלב 1.2, ולהיפטר פתרון PFA לתוך מיכל פסולת נוזלי מתאים. במידת הצורך, לאחסן דגימות ECM PBS ב 4 ° C לפני והכנתם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. הפקדת מעקב של חלבון ECM ידי Confocal מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיים

1. ספירת התאים תחת hemocytometer. עבור תאים COS-7, צלחת 250,000 תאים על צלחת תרבית תאים 60 מ"מ עבור transfection.
   הערה: עבור הדמיה תא חי, התאים חייב להיות transfected עם וקטור המקודד את החלבון ECM של עניין, התמזגו בתוך מסגרת עם לזרוח גנטית בקידודתג NT. זאת על מנת לאפשר זיהוי של חלבון ECM של הריבית במהלך דימות תאים חיים.
2. לאחר זמן מתאים ביטוי חלבון (למשל, 16 שעות) להסיר את התאים מצלחת עם פתרון טריפסין-EDTA, לספור אותם hemocytometer, ואת הצלחת ~ 150,000 תאים על גבי gridded 35 מ"מ, צלחת תחתית זכוכית הדמיה. לאפשר 2 h עבור התאים לצרף ולהתחיל בתצהיר ECM (פרק הזמן יהיה תלוי בסוג התא יש לקבוע באופן אמפירי).
   הערה: השתמשו במדיית תא שאינו מכיל פנול אדום, כמו זה יכול לתת גוון אדום עלול לפגוע באיכות התמונה.
3. בתקופה 2 ח 'לעיל, להקים מיקרוסקופ confocal עם 37 מעלות צלזיוס בתא האינקובטור אספקה ₂ CO. אפשר הטמפרטורה בתא ו בצלחת לייצב ל -37 מעלות צלזיוס לפני הדמיה; זה יכול להימשך עד 1 שעה.
4. דגירת התאים מצופים על צלחת 35 המ"מ gridded עם סמן תא פלורסנט למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאיםפעמיים במדיום תרבות אדום ללא פנול לפני הדמיה.
   הערה: בסמן פלורסנטי ציטופלסמית יכול לשמש כדי לחזות כרכי תא, או סמן מאגד-קרום יכול לשמש כדי לחזות קצות תא.
5. באמצעות מטרת 20X ו לעומת שלב על מיקרוסקופ confocal, לזהות ריבוע רשת מתאים המכיל מספר (> 3) של חסיד, תאים בריאים. אשר את הביטוי של חלבון המטרה של בחירה בתאים בתוך ריבוע הרשת שנבחר באמצעות מטרות 63X או 100X ואת אורכי הגל המתאימים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. גדר קרינה ואת השלב בניגוד הזמן לשגות הדמיה באמצעות תוכנת Z- מחסנית. הגדר את המחסנית "בגין" להיות רק מתחת לשכבת ECM ואת המחסנית "סיום" כדי להיות בדיוק מעל גוף התא. הגדרת גודל z-צעד ל -0.3 מיקרומטר ואת נפח z כדי בין 5 ל -10 מיקרומטר עומק בסך הכל, תלוי בסוג התא. זה ייתן בין 15-30 z-סעיפים לכל נקודת זמן.
7. Capturקרינת דואר (עבור חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), עירור = 555 ננומטר ופליטה = 584 ננומטר) ותמונות שלב בניגוד מעת לעת על פני פרק זמן מוגדר. לדוגמה, להשתמש בתוכנת זמן לשגות כדי להגדיר את מרווח הזמן ב -2 דקות, ואת משך הזמן עד 2 שעות. בחר את כפתור "התחל" כדי להתחיל ללכוד תמונות של z-סעיף על פני תקופת זמן מוגדרת.
8. בסוף תקופת הזמן, להסיר את התאים מן המנה, כמתואר בשלבי 1.1-1.5, כדי לאשר את הלוקליזציה של חלבון fluorescently- המתויג של עניין ECM.
9. השתמש הדמיה שלב בניגוד לבין מטרת 20X להעביר את כיכר הרשת הרלוונטית.
10. Switch to המטרה 63X ולזהות את שכבת ECM תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שקלו את התמונה לתמונה מראש החילוץ

3. הכנת סטרילי של ECM נגזר-Cell עבור מבחני תא פונקציונליים

1. לגדול אוכלוסייה אחת של תאים (להלן: "היצרן מטריקס" תאים) על coverslips ו popu אחראוכלוסייה (התאים "הבדיקה") בתרבות תקן בצלחת תרבית תאים 100 מ"מ עבור h 24 לפחות.
   הערה: אלה יכולים להיות כל שני סוגי תאים שונים חסידים, ואת מערך הניסוי יכול לכלול transfection של אחד או שתי אוכלוסיות תאים לבטא חלבון ECM fluorescently-tagged.
2. במנדף זרימה למינרית, כפי שמוצג על תרבית תאים, להכין פתרונות סטרילי של PBS ללא Ca ^{2 +} / Mg ^2+, אמוניום הידרוקסיד 20 מ"מ (ראה שלב 1.3), ודה-מיונן H ₂ O על ידי העברת כל דרך 0.2 סטרילי מסנן מיקרומטר לתוך מיכל סטרילי מתאים.
3. שמירת טכניקה סטרילית, לשטוף בעדינות את התאים "מפיק מטריקס" על coverslips שלוש פעמים עם PBS סטרילי (ראה שלב 1.2).
4. הסר את PBS על ידי שאיפה עם פיפטה סטרילית ועושה אותו במיכל פסולת נוזלית מתאים. הוסף 20 אמוניום הידרוקסיד סטרילי מ"מ (3 מ"ל / 100 מ"מ צלחת) דגירה אותם במשך 5 דקות עם נדנדה במרווחים.
5. להוסיף כמויות עצומותשל סטרילי דה מיונן H ₂ O כדי בצלחת "המפיק מטריקס", לפחות 20 מ"ל לכל 100 מ"מ צלחת, עם נדנדה, ויוצקים משם lysate התא לתוך מיכל פסולת מתאים.
6. חזור על שלב 3.5 ארבע פעמים נוספות על מנת להבטיח הסרה מלאה של החומר הידרוקסיד-solubilized אמוניום.
   הערה: ECM שהופקד על ידי התאים "מפיק מטריקס" על coverslips ולאחר מכן מספקת ECM סטרילי עבור מבחנים פונקציונליים עם כל תאי מבחן של עניין.
7. דגירה התאים מבחן מצלחת תא המניה עם 1.5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לכל צלחת 100 מ"מ (0.05% w / טריפסין נ ו 0.02% w / v EDTA תמיסת מלח מאוזן של האנק) עד שהתאים מבחן מנותקים מצלחת . הוסף בינוני תא, צנטריפוגות תאי המבחן ב 400 XG במשך 5 דקות, ולהסיר את נוזל supernatant.
8. Resuspend התאים מבחן מדיום חדש, סטרילי ולספור אותם hemocytometer. פלייט מספר מתאים של תאי בדיקה אלה על ECM סטרילי, מבודד על coverslips. תרבות אותם המדיום הסלולרי המתאים במשך 2-3 שעות, או לתקופת הזמן הנדרשת עבור תכנון הניסוי.
9. כדי לבחון את הארגון של שלד התא אקטין, לתקן את התאים מבחן 2% PFA ו להכתים אותם עם isothiocyanate והעמסת (FITC) -phalloidin (עירור = 490 ננומטר ופליטה = 525 ננומטר) כדי לחזות F- אקטין ועם 4 ', 6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI; עירור = 358 ננומטר ופליטה = 461 ננומטר) כדי להמחיש את הגרעינים ^11.
   הערה: השווה את המורפולוגיה וארגון יקטין בתאי הבדיקה מצופים על ECM Heterologous תאים שמקורם בתאי מבחן מצופים על ECM שלהם.

בידוד 4. של ECM עבור SDS-PAGE, ניתוח immunoblot, או פרוטאומיקה

1. לגדל תאים חסידים של ריבית על מנות תרבית תאי 100 מ"מימ (5 עד 10 מנות עבור חקר חלבונים או 1-2 מנות עבור immunoblotting) עבור 24-96 שעות, בהתאם לסוג התא, כדי לאפשר הפרשה בתצהיר של ECM.
2. הסרת התאים כמו described בצעדים 1.1-1.5.
3. הטה כל צלחת בזווית לנקז שיורית H ₂ O לתחתית של המנה, ובזהירות להסיר כל H ₂ O הנותרים עם pipet P200 עד שההצלחה יבשה לחלוטין.
4. במקביל, חיץ מדגם SDS-PAGE חום המכיל 100 מ"מ dithiothreitol (DTT) עד 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמצעות גוש חום, ולאחר מכן להוסיף אותו לצלחת. 200 μL של חיץ מדגם לכל צלחת 100 מ"מ מתאים דגימות להיבדק על ידי immunoblot.
   1. כדי לנתח ECM על ידי ספקטרומטריית מסה, להשיג מדגם מרוכז יותר על ידי איסוף חיץ מדגם SDS-PAGE מצלחת (כמתואר בשלבים 4.5 ו -4.6, להלן), מחדש מחממת אותו עד 95 מעלות צלזיוס, ושימוש באותו aliquot פני 2-3 צלחות נוספות.
5. השתמש מגרד תא לגרד את ECM ביסודיות את המנה, להבטיח כי בכל התחומים של המנה שהועתקו.
6. עם מגרד תא, לאסוף המדגם לצד אחד של המנה ולהסיר אותו עם 200קצה פיפטה μL לתוך צינור.
7. להעביר כל תמצית חיץ מדגם SDS-PAGE שיורית מהקצה מגרד תא לתוך הצינור כדי למזער את איבוד החומר ECM. עבור מדגם מרוכז, מחדש לחמם את aliquot חיץ מדגם זהה SDS-PAGE עד 95 ° C מחדש להשתמש בו על פני 2-3 צלחות נוספות.
8. פתור את החלבונים ECM על ידי SDS-PAGE ^12, באף אחת 7% או 4-7% ג'ל polyacrylamide שיפוע.
   הערה: זה נוח להשתמש סמנים חלבוניים מראש מוכתם.
9. כדי להגדיל את הרזולוציה של חלבוני ECM גבוה מולקולרי משקל, להאריך את זמן ריצת ג'ל כזה כי סמן המשקל מולקולרי 37 kDa פועל קרוב לתחתית הג'ל וסמני משקל מולקולריים <37 kDa יש להפעיל את הג'ל.
10. לניתוח proteomic של חלבוני ECM, להכתים את הג'ל עם כתם חלבון ללכוד תמונה. חותכים רצועות של עניין מן הג'ל, לעכל אותם עם טריפסין, ולנתח אותם על ידי לייזר desorption בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) ספקטרומטריית -mass ^13.
11. לחלופין, עבור ניתוח מעמיק יותר של תמצית ECM ו- לנתח את המדגם, פורסים את השביל ג'ל למקטעים, לעכל אותם עם טריפסין, ולבצע ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS) ^14.
12. לחלופין, עבור immunoblotting ^15, להעביר חלבונים מן ג'ל SDS-PAGE על פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום ב 15 V דקות לפחות 1 h 10 (חצי יבש) שיטה כדי להבטיח את העברת חלבונים ECM גבוהה מולקולרית משקל . דמיינו את החלבון הכולל הועבר הממברנה עם כתם Ponceau S.
13. בעקבות צעד 4.11, להשתמש נוגדנים להקים הנוכחות ו / או לעשות ניתוח וכמותיות של חלבוני ECM פרט ^15.
    1. חסום את הממברנה עם 2% (w / v) חלב ב TBS-Tween 20 (חיץ חסימה) לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מדולל נוגדנים ספציפיים חלבונים ECM בחסימת חיץ דגירה עם קרום עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (נוגדן לבלףronectin בדילול 1/600 ו נוגדנים thrombospondin-1 בדילול 1/150; טבלה 1 משלים).
    2. בחן את איכות בידוד ECM ידי מחדש חיטוט אותו הכתם עם נוגדני חלבונים תאיים בשפע, כגון תקטין או טובולין (אנטי יקטין בדילול 1 / 10,000 ואנטי-טובולין בדילול 1 / 5,000).

Results

הפרוטוקול המתואר בצעדים 1.1-1.5 מעשים כדי להסיר תאים ולהשאיר מאחור את ECM תאים שמקורם. הפרוטוקול בוצע על COS-7 תאים שגודלו עבור 96 שעות על coverslips זכוכית, ואת ECM תאים שמקורם נותח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טיפול אמוניום הידרוקסיד הסיר את התאים ביעילות, כפי שנקבע על ידי האובדן של גרעין התא ואת cytoskeleton יקטין, על פי DAPI מכתים phalloidin, בהתאמה (איור 1). הפקת תאים עם 2 M אוריאה לא הייתה יעילה כמו אמוניום הידרוקסיד; עקבות של מכתים DAPI ו phalloidin אותרו לאחר הטיפול. הייתה 8 אוריאה ז השפעה דומה אמוניום הידרוקסיד (איור 1). לאחר מכן, ECM תאים שמקורם היה דמיין לפני ואחרי טיפול אמוניום הידרוקסיד (שלבי 2.1-2.11). COS-7 תאים היו transfected עם חלבון פלואורסצנטי אדום monomeric (mRFP) -tagged thrombospondin-1 trimer C- מסוף, (mRFPovTSP1C) ¹1 גדל על צלחת 35 מ"מ עם בסיס זכוכית gridded.

שעות שלאחר ציפוי, ריבוע רשת מתאים שהכילו מספר תאים בריאים להביע mRFPovTSP1C הייתה דמיינו תחת מיקרוסקופ confocal. תמונה בעלת ניגודיות שלב הפניה צולמה של אזור זה, ולאחר מכן הדמיה זמן לשגות הקרינה בוצעה כל 1 דקות עבור 2 שעות (איור 2 א). תאים הוסרו ולאחר מכן באמצעות אמוניום הידרוקסיד, ואותו ריבוע רשת על הצלחת הועבר תחת בניגוד שלב ולאחר מכן מחדש ונותח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התאים כבר לא היו נוכחים בכיכר הרשת, אבל mRFPovTSP1C נשאר בתוך ECM, זוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו (איור 2 א) מאפיין puncta. כל mRFPovTSP1C שהופקד ECM לפני הסרת תאים זוהה על ידי השוואת טרום קרינת דפוס ופוסט הסרת תאים. ניאון puncta מזוהה בשתי התמונות (figuמחדש 2A, למשל מחודד) הם מוסקים להיות מזוהים עם ECM.

טיפול אמוניום הידרוקסיד ששימש אז לבודד ECM הילידים מ תאים בתרבית, חסיד. פיברובלסטים עורי אדם (HDF) גדלו על coverslips זכוכית למשך 96 שעות. תאים הוסרו באמצעות אמוניום הידרוקסיד, ואת ECM היה נחקר עם נוגדן שאני אנטי-קולגן, אשר הפגינו מכתים סיבי מאפיין meshwork דפוס ¹⁶ (תרשים 2B). דפוסי פיברונקטין נבדקו סביב קבוע, תאי כונדרוסרקומה עכברוש הלא permeabilized (RCS) ובתוך ECM לאחר הסרת תאי RCS (איור 2 ג). בידוד אמוניום הידרוקסיד של ECM גם בוצע בתנאים סטריליים כך "מבחן" תאים יכולים להיות מחדש מצופים על ECM עבור פנוטיפי או מחקרים תפקודיים. לדוגמה, "מבחן" COS-7 תאים היו מצופה עבור 2 שעות על ECM סטרילי המיוצר על ידי תאי RCS, ו- Tתרנגולת הם תוקנו, permeabilized, ונותחו עבור הארגון F- אקטין ידי מכתים FITC-phalloidin, בהשוואה COS-7 תאים מייצרי ECM שלהם (צעדים 3.1-3.9) (איור 3).

ב בקנה מידה גדול יותר, ננקטה שיטה זו לבודד ECM עבור הליכים ביוכימיים. לדוגמה, תאים RCS גדלו על תרבות מנות תא שני 100 מ"מ במשך 7 ימים, ואת הנהלים בצעדים 4.1-4.7 היו במעקב. חלבוני ECM התא נגזר נאספו על ידי גירוד אותם במאגר מדגם SDS-PAGE חם הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג'ל polyacrylamide 7% מתחת הפחתת תנאים. הג'ל היה מוכתם עבור חלבון, ואת ארבע הלהקות העיקריות בכל בודדו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה (איור 4 א). מספר חלבונים ECM, לרבות פיברונקטין, thrombospondin 1 (TSP1), thrombospondin חלבון מטריקס oligomeric 5 / סחוס (TSP5 / COMP), ו matrilin-1 זוהו (איור 4 ב).

לחלופין, הכנות בקנה מידה קטנה יותר של ECM יכולות להיות מוערכות על ידי immunoblots. לדוגמה, ECM תאים שמקורם מתאי COS-7 ectopically להביע mRFPovTSP1C הופרד על ידי SDS-PAGE, הועבר קרום PVDF, ומישש עבור RFP עם נוגדן אנטי RFP (איור 4C). טכניקה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים בין בתצהיר trimer יליד TSP1 (mRFPovTSP1C) וכן Engineered pentamer האזור TSP1 C- מסוף (mRFP-TSP-5-1C) ¹⁷ (איור 4C). כדי לחקור את ECM אנדוגני של HDF, הנוכחות של חלבונים ספציפיים lysate תא או ECM המבודד נבדקת על ידי immunoblotting. את פיברונקטין חלבוני ECM מאפיין thrombospondin-1 אותרו ECM, ואילו החלבונים התאיים בשפע α-טובולין ו β-יקטין נעדר ECM המבודד (האיור 4D).

EP-together.within-page = "1">
איור 1: השוואה בין שיטות של הסרת Cell. COS-7 התאים גדלו בצפיפות גבוהה למשך 96 שעות על coverslips, קבוע ב 2% PFA, ו permeabilized ב 0.5% טריטון X100, או טופלו כמצוין להסרת תאים. Coverslips אז הוכתמו FITC-phalloidin לדמיין F- אקטין ו DAPI לדמיין גרעינים. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה הוא שונה מן הפרסום מקורי ב- Journal of Science תא ^11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: זיהוי של חלבוני ECM ב ECM המבודד. (א) שלב ניגודיות הקרינה תמונות שלCOS-7 תאים המבטאים mRFPovTSP1C גדל על צלחת 35 מ"מ עם בסיס gridded, עם רצפת זכוכית עבור 2 שעות. תמונות מוצגות לפני ואחרי הסרת התאים על ידי אמוניום הידרוקסיד. הקצה של המכתב לרשת מותווה בתמונות שלב בניגוד עם קו מקווקו. חיצים לבנים מצביעים על דוגמאות של puncta ניאון שהיו קיימים לפני ואחרי הסרת תאים. (ב) איתור של קולגן אני ב ECM HDF ידי immunofluorescence העקיף. HDF גדלו במשך 96 שעות והוציאו עם אמוניום הידרוקסיד, ואת ECM הוכתם עבור I. קולגן סיבי האנושי ECM הוכתם גם עם נוגדנים משני FITC- מצומדות נגד ארנב לבד. (C) לוקליזציה של פיברונקטין סביב תאי RCS או בתוך ECM RCS המבודד, כפי שזוהה על ידי immunofluorescence העקיף. תאי RCS גדלו במשך 48 שעות, קבועים ב 2% PFA, ומוכתם עבור פיברונקטין ועם DAPI. במנות במקבילות, תאים הוסרו עם אמוניום הידרוקסיד 20 מ"מ ואת ECM הוכתם עבור fibronectin ועם DAPI. תאים הוכתמו גם עם נוגדנים FITC- מצומדות אנטי עכבר IgG לבד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: שימוש סטרילי ECM ללימודים פונקציונליים. RCS "המפיק מטריקס" התאים גדלו במשך 48 שעות על coverslips זכוכית והתייחסו מכן עם 20 מ"מ אמוניום הידרוקסיד בתנאים סטריליים כדי להסיר את התאים. COS-7 "מבחן" התאים היו מצופה על coverslips עם או בלי ECM RCS מבודד עבור 2 שעות, קבוע ב 2% PFA, permeabilized ב 0.5% טריטון X100, ומוכתמים FITC-phalloidin לדמיין F- אקטין ו DAPI לדמיין גרעינים . COS-7 תאים צופה על RCS ECM להפיץ באופן נרחב יותר ויצר חבילות microfilament גדולות (למשל מחודד) ו רוף הקצהles. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: זיהוי של חלבונים מן ECM מבודד על ידי SDS-PAGE, ספקטרומטריית מסה, או Immunoblotting. (א) תאי RCS גדלו במשך 7 ימים והוציאו עם אמוניום הידרוקסיד 20 מ"מ; הערך ECM היה מגורד למעלה למאגר מדגם SDS-PAGE חם המכיל 100 מ"מ DTT. הכנת ECM הופרדה על ידי SDS-PAGE על ג'ל polyacrylamide 7% מתחת הפחתת תנאים. ארבע להקות משמעותיות (חיצים 1-4) זוהו על ידי מכתים חלבון. (ב) חלבונים מלהקות ECM RCS 1-4 זוהו על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI. (C) COS-7 תאים המבטאים גם mRFPovTSP1C (trimer) או mRFP-TSP-5-1C (pentamer) היו בתרבית למשך 48h והוציאו עם 20 אמוניום הידרוקסיד מ"מ, ואת היה ECM מבודד למאגר מדגם SDS-PAGE חם המכיל 100 מ"מ DTT. הכנת ECM הופרדה על ידי SDS-PAGE על ג'ל polyacrylamide 7% בתנאי צמצום, הועברו קרום PVDF, ומששה עם נוגדן אנטי RFP. לוח זה שונה מן פרסום מקורי ב ביוסיינס דוחה ^17. (ד) HDF גדלו במשך 96 שעות ולאחר מכן טופלו או עם 2% חומצה deoxycholic PBS (lysate התא) או עם אמוניום הידרוקסיד 20 מ"מ כדי להסיר תאים. ה ECM היה משוך למאגר מדגם SDS-PAGE חם. שני שברים הופרדו על ידי SDS-PAGE על ג'ל polyacrylamide 10% בתנאים צמצום, הועבר קרום PVDF, ומישש עם נוגדנים, כפי שצוין. בכל פנל, העמדות של סמני משקל מולקולריים מצוינות kDa. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של fi זהאיור.

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

יש השיטה כמה שלבים קריטיים שיש אחריו על מנת להבטיח את הבידוד המוצלח וניתוח של ECM. לדוגמא, אמוניום הידרוקסיד משמש כדי להסיר את התאים לבודדים ECM לניתוח. למרות אמוניום הידרוקסיד יציב בתמיסות מימיות בחושך ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר, בקבוקי חייב להיות בחוזקה מחדש חתום בין כל שימוש. בגלל הגז עשוי להתאדות מהפתרון, ובכך להקטין את הריכוז, אנו ממליצים בחום החל בקבוק חדש כל 6-8 שבועות. בנוסף, הפתרון עובד צריך להיעשות טרי עבור כל ניסוי. כמו כן הוא חיוני כי התאים יוסרו לחלוטין עם שטיפות שופעות במי דה מיונן. אם צעדים אלה לא מבוצעים כראוי, חומר הסלולר עשוי להיותר על הצלחת ולזהם ניתוחים במורד זרם. אם התאים כבר גדל במשך 10 ימים או יותר, שטיפות מים נוספים ייתכן שיהיה צורך. חשוב nOTE ששכב ECM המבודד היא בדרך כלל רזה מאוד בהשוואה לתאים ^11, כך טיפול נחוץ בעת זיהוי ECM במהלך הדמיה. לקבלת מיצוי יעיל של ECM המבודד למאגר מדגם SDS-PAGE, זה הכרחי כי חיץ המדגם מכיל סוכן צמצום. למען הסר היעיל ביותר של ECM, חיץ מדגם רותחים-חם יש להשתמש. בניסויים בהם דגימות ECM תיפתר על ידי אלקטרופורזה SDS-PAGE מכתים חלבון או פרוטאומיקה, היא קריטית כדי להשיג מדגם מרוכז על ידי גירוד כמה צלחות בשווי של ECM לאותו aliquot של חיץ מדגם.

שינויים ופתרון בעיות

ייצור הפרשת חלבוני ECM יכולים להשתנות באופן משמעותי בין סוגי תאים, כך תקופות זמן הפרשה בתצהיר של ECM צריכות להיקבע דה נובו עבור כל סוג תא. כמו כן, חשוב להיות מודע לכך רכב ECM ישתנה באופן משמעותי ביחס to תא צפיפות וזמן בתרבות ^18. גורם זה יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון ניסויים. אין ספק כי הבחירה של סוג תא עבור שיטה זו היא חשובה, במיוחד כאשר שואבי ECM לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה, אשר עשוי לדרוש כמות משמעותית של חלבון ECM הכולל.

מגבלות של הטכניקה

תאי מפרישי רמות נמוכות מאוד של חלבוני ECM יהיו מאתגרים יותר לשימוש בשיטה זו. תאים שאינם חסידים, תרביות תאי 3D, או מבחני פלישת תא אינם מתאימים כיום לבידוד ECM לפי שיטה זו. השיטה המתאימה ביותר לשימוש עם תקן "2-ממדי" בתרביות תאים. בגלל חילוץ אמוניום הידרוקסיד מסיר את התאים לחלוטין, ECM הקשורים הצדדים העליונים של תאים מופרשים, אבל הלא צולבים, חלבוני ECM יוסרו גם והותירו על צלחת שכבה דקה של ECM התאסף מלמטה מסביב לבסיסים של התאים ^11,17 . זה מורכב לכמת כמה ECM הוא שוחרר על ידי מיצוי אמוניום הידרוקסיד, כי החומר שוחרר גם כולל חלבוני ECM כי הם תאי גם לפני הפרשה או לאחר ספיגה מתא השטח.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות

היכולת לבצע מגוון רחב של ניסויים עם ECM המבודד חשובה בהקשר של ביולוגיה של תא ופיזיולוגית רקמות, והוא גם בעל השלכות על תחומי התחדשות רקמות והנדסת רקמות. יש שיטת יתרונות על פני ג'ל נוצר collagens המטוהר או חלבוני ECM מטוהרים אחרים שתאים להרכיב מבני ECM מורכבים בגודל מולדתם, עם מנגנוני cross-linking יליד עם חלבוני ECM פרט נוכח היחסים מתאימים לסוג התא מוצא. לדוגמה, במחקר proteomic של RCS ECM הפגינו matrilins שופע COMP / TSP5, כצפויECM סחוסי ^19,20 (איור 4). באופן כללי, הניתוח של ECM תא נגזרות נפגע מטבעה כמו רשת ענפה, רב-חלבון שגורמת crosslinking קוולנטיים ו insolubility של חלבוני ECM רבים, וגם על ידי האפשרות של זיהום ECM מחלץ עם חלבונים תאיים. הליך רב שלבים שנועד לבודד את החלק היחסי ECM מרקמות לניתוח proteomic ניב 8% של חלבוני ECM במערכה הכוללת של חלבונים מזוהים ^21. עם זאת, פפטידים מחלבוני ECM היו 73% של פפטידים הכוללים מזוהים. שיטה זו לבידוד וניתוח של ECM תאים שמקורם במהירות ובאמינות מסיר חומר הסלולר תוך שמירת חלבוני ECM. שיטה זו יכולה לשמש עבור מגוון של סוגי תאים ויישומים במורד ומקל על הניתוח של ביולוגית ECM ואינטראקציות תא ECM תרבית תאים. הפרוטוקולים שלנו בפירוט כיצד ניתן ליישם השיטה בקני מידה שונה כדי לטפל במגוון רחב של expשאלות erimental בכל הנוגע לארגון ECM, דינמיקה, או רכב, ואת להשפעות התפקודיות של ECM מבודד על תאים.

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו

במבט לעתיד, השיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם תרביות תאי 3D; זה ירחיב רלוונטי פיסיולוגי אינו רב. יש decellularized יליד רקמות פוטנציאל גדול כמו פיגום להתחדשות של רקמות אובדן או נזק ו כחלופה ההשתלה, כגון אי ספיקת לב לאחר ^22. יש לו את הפוטנציאל להתגבר על הבעיות של זמינות תורם immunorejection. יישומים עתידיים של השיטה המתוארת בדוח זה יכול לחקור את השימוש שלה עם תרביות תאים 3D או decellularization רקמות, אשר נוסף יגדיל את היקף גישה זו.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
נוגדן ל-COL1A1	Novus	NB600-408	ארנב פוליקלונלי. מגיב עם קולגנים פיברילריים אחרים כמו גם קולגן I. IF: 1/200
נוגדן לפיברונקטין	סיגמא	F3648	רב-שבטי ארנב. WB: 1/600 למשך 1.5 שעות. IF: 1/200
נוגדן לפקקת 1	ThermoFisher	MA5-13398	שיבוט חד שבטי של עכבר A6.1. WB: 1/150 למשך 1.5 שעות
נוגדן ל-RFP	Abcam	ab62341	ארנב פוליקלונלי. WB: 1/2,000 למשך שעתיים
נוגדן ל β-actin	Sigma	A1978	שיבוט חד שבטי של עכבר AC-15. WB: 1/10,000 למשך 1.5 שעות
נוגדן ל α-tubulin	Sigma	T9026	שיבוט חד שבטי של עכבר DM1A. WB: 1/5,000 למשך 1.5 שעות
גשש סלולרי ירוק	ThermoFisher	C2925	סמן תאים פלואורסצנטיים. לשימוש ב-1 ובמיקרו; M למשך 30 דקות
פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)-Phalloidin	Sigma	P-5282	מלאי = 50 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. 1/50 למשך 45 דקות
עיזים מצומדות FITC נגד עכבר IgG	Sigma	F8771	IF: 1/50 למשך שעה
אחת כבשים מצומדות FITC נגד ארנב IgG	SIgma	F7512	IF: 1/50 למשך שעה
חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומד עז נגד עכבר IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50,000 למשך שעה
אחת HRP מצומד עז נגד ארנב IgG	LI-COR	926-80011	WB: 1/100,000 למשך שעה
אחת מדיום הרכבה Vectorshield עם DAPI	Vector	H-1200	חנות ב-4 מעלות; C בחושך
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	חם לפני השימוש
מדיום גידול פיברובלסטים	PromoCell	C-23010	חם לפני השימוש, תוסף תזונה עם 50 ומיקרו; גרם/מ"ל חומצה אסקורבית
פנול ללא אדום DMEM	ThermoFisher	21063-029	חם לפני השימוש
תמיסת טריפסין-EDTA	סיגמא	T3924	חם לפני השימוש
צלחת מרושתת עם תחתית זכוכית	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, תמיסה של 28-30%	סיגמא	221228	לדלל ל-20 מ"מ במים נטולי יונים. לאחר הפתיחה יש לאחסן בחושך, סגור היטב.
פרפורמלדהיד, תמיסה של 16%	אלפא Aesar	43368	מדולל ל-2% (v/v)
בחומצה דאוקסיקולית	PBS Sigma	D2510	השתמש בריכוז סופי של 2% (v/v) Triton
X-100	Sigma	T8787	מדלל ל-0.5% (v/v) ריאגנט
סופי GelCode מגיב כתמים כחול ThermoFisher		24590	כתם חלבון לג'לים SDS-PAGE
תקני חלבון דיוק פלוס Biorad		161-0374	תקני חלבון לג'ל SDS-PAGE
Trans-Blot SD תא העברה חצי יבש	Biorad	1703940	העברה יעילה של חלבונים במשקל מולקולרי גבוה
קרום העברת PVDF	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	כתם חלבון הפיך לקרום PVDF
מצע כימילומינסנציה משופר (ECL) WesternSure	LI-COR	926-80200
סרט כימילומינסנציה בעל ביצועים גבוהים	GE Healthcare	28906837
יחידת סינון סטרילית, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 AOBS סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופ	Leica		תא סביבתי דרוש לבקרת טמפרטורה ו-CO2 (שירותי הדמיית חיים)<