הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

12 בדצמבר 2016

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

במאמר זה

סיכום

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

תקציר

באמצעות שיטה זו, ברציפות cryosections נאספים כדי לאפשר הן יישומים במיקרוסקופ לצורך היסטולוגיה רקמה והעשרה של רנ"א עבור ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי השלד יחיד העכבר. בדרך כלל, אתה עשוי להתקשות להשיג הומוגניזציה נאותה דגימות שריר שלד קטנות בגלל כרכי חיץ עשויים להיות נמוכים מדי עבור יישומי שחיקה יעילים, עדיין ללא הפרעה מכאנית מספיק, ארכיטקטורת הרקמה הצפופה של חדירה לתחום שריר של ריאגנטים חיץ, גורמת בסופו של דבר תשואת RNA נמוכה. על ידי ביצוע הפרוטוקול שדווח כאן, 30 מיקרומטר חלקים נאספים ונקווים המאפשרים cryosectioning ויצירת הומוגניות מחט לאחר מכנית לשבש את השריר, הגדלת שטח הפנים החשוף לחדירת חיץ. המגבלות העיקריות של הטכניקה הן כי זה דורש cryostat, וזה יחסית תפוקה נמוכה. עם זאת, RNA באיכות גבוהה ניתן להשיג דגימות קטנות של מטר ויקווהcryosections uscle, מה שהופך שיטה זו נגישה עבור שרירי שלד ורקמות אחרות רבים ושונים. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת ניתוחים מתאימים (למשל, histopathology רקמות ביטוי גנים) מאזורים סמוכים של שרירי שלד יחידים כך שמדידות ניתן להשוות באופן ישיר בין יישומים כדי לצמצם את אי הוודאות ניסיונית להפחית ניסויים בבעלי חיים בשכפול הדנ"א צורך למקור רקמה קטנה עבור יישומים מרובים.

מבוא

מטרת טכניקה זו היא להפוך ניתוחים ניסיוניים מרובים על ידי שיטות שונות, כגון ביטוי היסטולוגיה גן, נגישות מכל רקמה ממקור שרירי שלד אחת קטנה. יישומים מיקרוסקופים הם הרגישים ביותר כדי לטעום דרכי שימור, אשר חייב להיות מבוקר בקפידה כדי להגביל את ההיווצרות של חפצי גביש הקרח במהלך cryopreservation. לפיכך, פיתוח שיטה מבוסס על קדמי tibialis (ת"א) שריר קפוא מכוסה חלקית עם ההטבעה שרפה באמבט חנקן מקורר נוזל -140 ° C 2-methylbutane כחומר המקור הוא מיקרוסקופיה immunofluorescence ביטוי גני המנתח.

הצורך להשתמש באותו מקור חומר עבור גישות טכניות מגוונות חשוב במיוחד עבור ניסויים מבוססי זריקה תוך שרירית שבו השרירים ימין ועל שמאל מייצגים תנאים שונים, אחד ניסוי ובקרה אחד. לדוגמה, במחקרים התחדשות שריר, mu אחדscle מוזרק עם רעלן לגרום נזק לרקמות נרחבת תוך השריר הנגדי משמש כביקורת הרכב מוזרק 1. בדומה לכך, מחקרי ריפוי גנטי להפרעות שריר בדרך כלל מתחילים עם אימות של וקטור הריפוי הגנטי על ידי זריקה תוך שרירית להיות לעומת וקטור ריק, וקטור קשור או שליטה ברכב בצד הנגדי 2. לכן, אין זה אפשרי למקור כל שריר ת"א ליישום אחר.

אסטרטגיות נפוצות להתמודד עם בעיה זו הן: i) להשתמש קבוצת שרירים שונה עבור כל יישום, ii) להשתמש עכברים נוספים, או iii) כדי לחתוך חתיכה של השריר עבור כל יישום. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין קבוצות השרירות להקשות להשוות נתונים מיישומים נפרדים, וחיות נוספות להגדיל הוצאה והם גרועים מוצדקים אם קיימות חלופות אחרות. חלוקת השרירים לאחר דיסקציה למקור יישומים שונים היא i האפשרות הטוב ביותרבמקרים רבים n. עם זאת, את החלקים שרירים הם בדרך כלל קטנים מדי לשימוש אִבּוּק תחת חנקן נוזלי או טכניקות שחיקה מכנית עבור המגון 2-5. כמו שריר היא רקמה מבנית מאוד עמוסה חלבוני מטריקס התכווצות תאיים, המגון מכאני לקוי מוביל בתשואה נמוכה של DNA, RNA או חלבון שלאחר מכן. השיטה המפורטת כאן מאפשרת כמויות קטנות של רקמת שריר מקור אחד לשימוש ביישומים מרובים, וההכללה של טחינה דקה cryosectioning ומחט משפר המגון מכנה תשואת RNA טובה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנהלים כל חיה אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים מוסדיים גאורגיה ועדת שימוש תחת A2013 פרוטוקול חיה שימוש 07-016 (בידל).

1. Cryopreservation של שרירי שלד מבולבלים

  1. הכנה
    1. חותכים הפקק לריבועים קטנים (כ 1 ס"מ x 1 ס"מ) עם סכין גילוח, לכתוב על הפקק בטוש טיפ נאה כי הוא עמיד בפני 2-methylbutane לזהות את מקור העכבר שריר, ולעשות חתך רדוד מאוד (כ 1 מ"מ) על פני המשטח העליון. הכנס coverslip פלסטיק לתוך החתך להשתמש בשביל האוריינטציה הרקמה. חזור על פעולה עד פקק מוכן לכל רקמה להיות cryopreserved.
    2. השג חנקן נוזלי, 2-methylbutane, שרף הטבעה, מדחום טמפרטורה נמוכה, פקקים, כלי לנתיחה, ועכבר מחקר.
      זהירות: חנקן נוזלי הוא גז דחוס שעלולה להתפוצץ אם מחומם. לובש חלוק לבן, כפפות בטמפרטורה נמוכה, וגינת פן בעת ​​טיפול נוזלי nitrogen; במגע עם עור או עיניים עלולות לגרום לכוויות או כוויות קור. 2-Methylbutane היא בריאות, דליק, רעיל מפגע סביבתי. ללבוש ציוד מגן אישי (חלוקים מעבדה, כפפות, משקפי מגן), לפתוח את מכל המניות במנדף, להעביר את הסכום הקטן הדרושים הקפאה (בדרך כלל בין 200 ל- 400 מיליליטר) למכל נפרד שניתן סגור היטב, ולהימנע משאיפה .
    3. להרדים עכברים עם שיטה שאושרה של המתת חסד בהרדמה. בקצרה, הכנס את העכבר לתוך תא משאיפת עם isoflurane 2.5% חמצן מתוך מאדה isoflurane, להמתין עד 20 שניות לאחר העכבר מפסיק לזוז כדי לבדוק רפלקס הדוושה. כשהרפלקס הדוושה הוא שלילי, להרדים את עכבר המחקר שנערך על ידי נקע בצוואר רחם 6.
      הערה: שיטות המתת חסד טעונה אישור ועדת האתיקה של המוסד הרפואי.
    4. סר עור שמעל hindlimb דיסטלי וחתך את הגידים הקדמיים דיסטלי בדיוק מעל הקרסול עם disse בסדר נקודותמספרי ction. אחוז גידים דיסטלי עם מלקחיים בסדר משוך בעדינות מעלה ולעבר הברך תוך צמצום fascia לרוחב כדי לשחרר את השרירים. משוך את השריר החוצה בניצב מהברך ולעשות חתך סופי שיחתוך את שריר ת"א 7.
      הערה: שריר ת"א משמש כאן כדוגמא, אבל כל שרירי שלד עכבר או הלב יכולים להיות תחליף ת"א בפרוטוקול זה אם מתאים אל מטרות הניסוי של המשתמש. המגבלה היחידה היא כי רקמות חייבות להיות קטנות מספיק כדי להשיג cryopreservation המהירה לכל עומקו; גודל רקמות המרבי של ס"מ 1 ס"מ x 1 מומלץ.
    5. חזור על הפעולה ברגל הנגדית, לנתח את כל רקמות אחרות שתיגבינה. בצע דיסקציה מהר ככל האפשר להגביל שפלת רקמות לפני cryopreservation.
    6. אוריינט כל שריר סעיפים רוחביים על הפקק מראש שכותרתו שלה. סטנד השריר בניצב הפקק עם גיד דיסטלי נגיעת הפקק העליון של שלוחת השרירוכלה משם, ונתמך coverslip.
    7. Cryopreserve בכל הרקמות לניתוח היסטולוגית בהקדם האפשרי לאחר דיסקציה, רצוי תוך 5 דקות אבל בהחלט לא יותר מ -15 דקות זמן שחלף מאז euthanization של חית המקור.
  2. cryopreservation
    1. בגין קירור באמבטיה cryopreservation חמש דקות לפני סוף הניתוח. יוצקים 2-methylbutane לתוך כוס מתכת פתוחה עד לעומק של כ 3 סנטימטר. יוצקי חנקן נוזלי לתוך מכל מבודד עד לעומק של 2 עד 4 סנטימטר. הגדר את המבחנה של 2-methylbutane לתוך החנקן הנוזלי; החנקן יתחיל לרתוח. הימנע מתיז חנקן לתוך כוס 2-methylbutane.
      זהירות: כן מקפיא אמבטיה במנדף או במקום מאוורר היטב.
    2. הכנס במד חום בטמפרטורה נמוכה לתוך-methylbutane 2 לניטור טמפרטורות ומערבבים לעתים קרובות עם מזלג כדי להבטיח קירור אפילו. ממשיכים לערבב ומצננים עד 2-ליthylbutane מגיע -140 ° C, הוספת חנקן נוזלי חדש לאמבטיה החיצונית לפי הצורך.
      הערה: מעלות צלזיוס -140 היא הטמפרטורה האופטימלית כדי למזער חפצי גביש קרח בשריר מפוספס; רקמות אחרות עשויות cryopreserve מיטב בטמפרטורות שונות (למשל, מוח, -90 ° C).
    3. החל שרף הטבעה רק 35 נמוך - 50% של השריר איפה זה פוגש את הפקק מיד ושחרר את הפקק לתוך 2-methylbutane ב -140 מעלות צלזיוס. במהירות לחזור עד 8 רקמות לכל אצווה הקפאה. מערבבים במשך 30 שניות, על תחתית של כוס על מנת להבטיח כי הרקמות לא להקפיא לתוך 2-methylbutane לחיזוק.
    4. בעזרת מזלג, מחוררת כף או מלקחיים גדולים למשוך לכל פקק רקמה מן-methylbutane 2. להסיר במהירות את coverslip, להספיג את 2-methylbutane עודף לתוך כוס, ואחר כך להפיל את הפקק רקמות לאמבטיה חנקן החיצוני. חזור לכל פקקים שנותרו בכוס.
    5. דגימות העברה בחנקן נוזלי או על קרח יבש-80 ° C במקפיא לאחסון.
    6. אם כל רקמות להישאר cryopreservation, חזור על שלבי 1.2.3 עד 1.2.4. מוסיף 2-methylbutane נוסף הכוס או חנקן נוזלי לאמבטיה החיצונית לפי צורך מחדש מגניבה -140 מעלות צלזיוס. השלך 2-methylbutane בשימוש כפסולת מסוכנת.

2. איסוף cryosections עבור יישומים היסטולוגיה ו- RNA

  1. הכנה.
    1. טרום לשקול צינור autoclaved DNase / RNase ללא על איזון אנליטית. לאחר מכן, להעביר אותו לתוך תא cryostat כדי precool. חזור על הפעולה עד צינורות מוכנים עבור כל הדגימות cryosection ונקווה שייגבו.
    2. עבור חתך שרירי שלד, לאשר כי טמפרטורת cryostat הקאמרית היא -21 ל -22 מעלות צלזיוס על ידי תרמוסטט הפנימי שלה. להעביר כל מכולות עם רקמות להיחתך ההחדרה ולאפשר מיכל (ים) כדי לאזן את טמפרטורת cryostat במשך 15 דקות לפחות לפני הפתיחה.
    3. הכנס להב cryostat הפנויה חדש. לחילופין, להסיר את הלהב הקיים, לרסס עם פתרון טיהור RNase, לשטוף עם DDH 2 O, והכנס לתוך cryostat להתקרר. תרסיס רקמות נקייה עם 70% אתנול ובזהירות לנגב את פלטפורמת clamping להב ולהב.
      1. תרסיס רקמות נקייה עם פתרון טיהור RNase ולנגב מברשות cryostat. תרסיס רקמה עם DDH 2 O, לנגב את המברשות שוב ולהגדיר אותם בתא cryostat על משטח נקי.
        זהירות: להב cryostat צריך להיות מכוסה על ידי שומר הסכין כאשר אינו בשימוש. כמו כן, פתרון טיהור RNase רעיל יקפא לי לגבש המשקע בתא cryostat הקר. לכן, לטפל בזהירות ולהימנע השימוש בו בתא cryostat.
    4. בתוך חדר cryostat, מקום טיפה בגודל מטבע (כ 300 μl) של הטבעה שרפו על צ'אק דגימה חמים, להגדיר פקק רקמות על גבי השרף, לחץ כלפי מטה, ולאחר מכן להגדיר את צ'אק ב freezing רכבת או על אלמנט הקפאה מהר אם הוא זמין.
    5. לאחר מתמצק שרף ההטבעה (הלבנה), להוסיף שרף הטבעה נוסף על גבי הפקק, סביב% 35 התחתונים של הרקמות ולחץ על חולץ החום לתוך שרף ההטבעה להקפאה מהירה לייצב את הרקמה טובה יותר. המתן 5 דקות לפני חתך לאפשר שרף להתקשות לחלוטין.
    6. ודא מהדק הדגימה נמצא בעמדה שלה חזרה בו ביותר, הרחוקה ביותר מן הלהב. הכנס את צ'אק דגימת רקמות לתוך מהדק הדגימה.
  2. הכנת cryosection.
    1. שחרר את בעל הספק הלהב, לקבוע את זווית האישור של הלהב 10 ° (או בזווית מתאימה המוביל הלהב בשימוש), מחדש להדק. שחרר את הבלם ולהפוך את ההגה ביד להנמיך את השריר לכיוון הלהב. לאמוד את המרחק הקרוב ביותר בין רקמות הלהב, ולאחר מכן להעביר את הרקמות מן הלהב להעסיק את בלם הגה ביד.
    2. שחרר את leve כוונון גובהr ולעבור מוביל הלהב קדימה או אחורה, בהתאמה, אם בסופו של הרקמה הוא יותר כ -2 מ"מ מן הלהב או אם להב מכת הרקמה. הדק ולהפחית את הרקמה שוב לבדוק מרחק בין הלהב. חזור על התאמות עד שהלהב 1 עד 2 מ"מ מהקצה של הרקמה על ידי הערכה חזותית.
    3. מנמיך את הרקמה כלפי הלהב ולהעריך זווית רקמת סעיפים רוחביים. נעל את ההגה ביד ולשחרר את ידית דגימה המהדקת. דחוף את מהדק הדגימה שמאלה או ימינה עד הכיוון האופקי של הרקמה הוא בניצב להב.
    4. דחוף את הדגימה מהדקת למעלה או למטה כדי לשנות את הכיוון "y" כך בסעיפי רקמות יהיו בניצב לציר הארוך של השריר. הדק את ידית מהדק הדגימה.
    5. השתמש כמובן ולהאכיל קדימה בסדר לקדם את הדגימה עד זה פשוט נוגע להב. אם מחפש קטעים מתוך עומק רקמה מסוים, לאפס את הסכום בעוביי סעיף לאפס (העליון של הרקמות).
    6. הגדר את cryostat אל בפונקציה Trim עם עובי סעיף 30 מיקרומטר. חותכים וזורקים סעיפים עד העומק שנבחר מראש לאיסוף רקמות הוא הגיע (למשל, 400 מיקרומטר מלמעלה).
  3. אסוף cryosections להפקת RNA.
    1. פתח את הצינור עבור חלקי איסוף ולמקם אותו ליד ספק הלהב. השתמשו במברשת מראש מקורר, נקי להרים כל קטע כפי שהוא נחתך מהלהב ולהעביר את cryosection לתוך הצינור. חזור על פעולה עד בסעיפים ונקוו שוקלים 30 מ"ג או עומק הרקמות הרצוי הוא הגיע.
      הערה: עבור קדמי tibialis עכבר בוגר, גביית עומק רקמות של כ 400 עד 4,000 מיקרומטר בדרך כלל מניבת 25 - 40 מ"ג. בעזרת מלקחיים מתכת להעביר חלקים אל צינור איסוף אינו מומלץ כמו בסעיפים נוטים מקל גוש על משטח מתכת.
    2. אם הטבעת שרף המקיפה את השריר cryosection, לנעול את בלם היד ולהשתמש בסכין גילוח כדילגלח חתיכות קטנות של שרף עד שיש שכבה דקה רק סביב החלק העליון של השריר. תמיד לחתוך שרף עם הלהב בזווית אל השריר.
      הערה: שכבה דקה של הטבעת שרף לא מקשה על הכנת RNA במורד הזרם באופן משמעותי. אם שרף הטבעה עבה קיים, להשתמש במברשות כדי להקניט אותו הרחק שרירים לפני הזזת cryosection לתוך צינור איסוף.
    3. לחלופין, קטעי ברכה על מוביל הלהב והעברה בתפזורת צינור האיסוף.
      הערה: עם זאת, שיטה זו נוטה להיות איטי, וחתכים סיכויים טובים יותר מקל גוש ביחד, אשר יכול להפחית את היעילות של הומוגניזציה מחט צעדים מאוחר יותר.
    4. במקום צינור cryosection ונקווה במהירות לתוך משקל צינור איזון שיא אנליטי. מיד להחזיר את הצינור לתא cryostat קר כדי לשמור על טמפרטורת סעיף ליד -20 ° C. חשב את המשקל של חלקים נקווה.
      הערה: אם בידוד RNA יתרחש על מודעהifferent יום, לאחסן הצינור cryosection ונקווה ב -80 ° C עד השימוש.
  4. אסוף cryosections עבור היסטולוגיה.
    1. לחץ על לחצן עובי סעיף חיצים חתך ושימוש בסדר לקבוע את עובי סעיף cryostat ל -7 מיקרומטר (או עובי סעיף מתאים אחר, בדרך כלל בין 6 ל -10 מיקרומטר).
      הערה: מדלל סעיפים (6 עד 10 מיקרומטר) אמורים לשמש ליישומים היסטולוגית כדי להבטיח כי ריאגנטים מכתימים יכול לחדור לעומק של קטע הרקמה. ניתן לקחת חלקים דקים מכל עומק במהלך cryosectioning, אבל חלקים עמוקים עדיפים בגלל הטבעת שרף, אשר מגדיל עם עומק רקמות, אינו פוגעת מכתים היסטולוגית.
    2. חותכים וזורקים 4 עד 7 סעיפים להשיג משטח רקמה עקבית, אפילו. רשום לעצמך את עומק הרקמה.
    3. חותכים מקטע לכוון אותו על פני השטח של המוביל להב. תרים את הקטע על ידי במהירות ובעדינות לגעת שקופיות מיקרוסקופ (בטמפרטורת חדר) חמותאל החלק שמדבר על מוביל הלהב. החזר את השקופית לטמפרטורת החדר. המשך עד מספר השקופיות רצויות מתקבל. רשום לעצמך את עומק הרקמות הסופי.
      הערה: גביית חלק שני (כפול) לכל רקמות מומלצת.
    4. עם חתך שלם, להעסיק את בלם הגה ביד, להחזיר את הדגימה לעמדה-רוב האחורית, והסר את צ'אק הרקמות. השתמש אלמנט החום cryostat כדי להמיס את שרף הטבעה מחזיק את הפקק רקמות על צ'אק הדגימה. סר פקק רקמות, לייבש עם רקמה, ולחזור אחסון.
    5. חזור משלב 2.1.2 עבור כל רקמה נותרת. אפשר שקופיות להתייבש במשך 20 דקות לאחר הרקמה האחרונה הוא רכובה. לאחר מכן, השתמש שקופיות עבור היסטולוגית או מכתים immunofluorescent או להקפיא ב -80 ° C בתיבת שקופיות עד הצורך.

בידוד RNA 3. מן משולב cryosections

  1. מיצוי RNA
    1. צינור העברה (ים) של cryosections ונקווה לקרח. מיד להוסיףמגיב מיצוי RNA אורגני לפי יחס של כ מגיב 1 מ"ל לכל משקל 50 מ"ג cryosection, בדרך כלל 600 μl לכל צינור.
      זהירות: ריאגנטים בידוד RNA הם רעילים, מאכל, ומרגיז. בצע את ההוראות של היצרן עבור טיפול בטוח.
    2. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 18 מד, לצייר למעלה נוזל מיצוי RNA ולשטוף את הקירות של הצינור עד שכל הרקמה מושעה בתמיסה. נסו לצמצם בועות אוויר במהלך המגון מחט.
    3. השתמש קצה המחט לכתוש ולפזר כל cryosections וחתיכות בכבדות דבקות צינור בקיר. Triturate כדי homogenize ידי העברת המדגם מעלה ומטה דרך המחט עבור חמש משיכות, ולאחר מכן להחזיר את המדגם לקרח. חזור על שני השלבים שלוש עד חמש פעמים, או כמספר הפעמים יש צורך לשבש את כל גושים ולהעביר המדגם בקלות דרך המחט.
    4. הסר את המחט 18 מד ולהחליף אותו עם מחט 22 מד. בזהירות triturate המדגם עבור חמש משיכות, ולאחר מכן להחזיר את המדגם לקרח. חזור על טחינה דקה שלוש עד ארבע פעמים כדי להשיג homogenate רקמות מפוזר מאוד דק.
      הערה: אם חלקיקי רקמות להתחיל לחסום את המחט בעת עריכת המדגם, לגרש את כל המדגם מן המזרק לחזור מחט 18 מד עבור המגון נוסף. צעד טחינה דק נוסף עם מחט מד 25 או 26 ניתן להוסיף להשיג תשואה מקסימלית. עם זאת, את המחט עלולה להיסתם כך קיים סיכון של שפיכת מדגם.
    5. הזז את המדגם מקרח לטמפרטורת החדר. דגירה במשך 5 דקות כדי לשבש קומפלקסים מולקולריים.
    6. במנדף קטר, להוסיף 0.1 מ"ל של 1-bromo-3-chloropentane (BCP) לכל 1 מ"ל של ריאגנט בידוד RNA בשימוש (שלב 3.1.1), בדרך כלל 60 μl לכל צינור. לנער את הצינור במרץ ביד במשך 15 שניות (לא מערבולת). דגירה מדגם בטמפרטורת החדר למשך 2 עד 3 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגות במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו -4 מעלות צלזיוס.
      זְהִירוּת: BCP דליק ורעיל. טפל במנדף וללבוש כפפות, חלוק מעבדה, ואת משקפי מגן.
    7. בזהירות לאסוף את השלב מהימי העליון (צבע) RNA המכיל ולהעביר אותו צינור נקי. הוסף נפח שווה של 70% אתנול (במי DEPC) ו מערבולת לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך עד 10 דקות.
      הערה: שלבי ביניים הבינוניים שלבי פנול BCP נמוכים יכולים להיות מעובד על דנ"א וחלבון גנומית, בהתאמה, על פי הוראות היצרן או שנאספו במכל פסולת מסוכנת פנול BCP לסילוק מתאים.
  2. טיהור RNA.
    1. בצע את ההוראות של היצרן עבור מדגם מחייב, כביסה elution בשינויים קלים 8. לדוגמה:
    2. הוסף aliquot של DNase / RNase ללא מים לתוך אמבט 37 ° C או החממה טרום חם צעד 3.2.4.
    3. מוסיפים את מדגם RNA מן 3.1.8 לעיל כדי טור טיהור צנטריפוגה מדגם במשך 15 שניותב XG 12,000 בטמפרטורת החדר. יוצקים את הזרימה דרך חזרה באותה עמודה מחדש צנטריפוגות. חזור פעם אחת נוספת על מנת למקסם RNA מחייב, ולאחר מכן למחוק את הזרימה הסופית עד וכולל.
    4. בצע שלבים לשטוף פי הוראות היצרן 8. החל 700 μl של חיץ לשטוף (לא אתנול) לעמודה, ספין למשך 15 שניות ב XG 12,000, וזורקים את הזרימה דרך.
    5. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף (עם אתנול) לעמודה, ספין למשך 15 שניות ב XG 12,000, וזורקים את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו פעם אחת.
    6. ספין בעמודה הריקה דקות 1 ב XG 12,000 לייבש את הממברנה.
    7. מעבירים את הטור ספין על RNase- נקי, צינור ללא DNase. הוסף 40 μl של מים מחומם מראש DNase / RNase ללא (מ 3.2.1) למרכז הממברנה העמודה. בטמפרטורת החדר, דגירה במשך 2 דקות ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 12,000 x ז.
      הערה: נפח elution 40 μl הוא כ 1.3 μl לכל מ"ג המקורירקמה 30 מ"ג של cryosections נקווה. כוון את עוצמת הקול elution בהתאם משקולות רקמות התחלה שונות, אך לא להפחית להלן 32 μl. Elution שני, באמצעות כ 0.7 μl לכל מ"ג של רקמה מקורית, ניתן להוסיף כדי להגדיל את תשואת RNA מוחלטת.
    8. לנתח את הרנ"א (elution טור) לצורך ריכוז טוהר על ידי ספקטרופוטומטר, אלקטרופורזה, ו / או bioanalyzer. אחסן את RNA ב -80 ° C עד הצורך עבור יישומים במורד הזרם, כגון שעתוק לאחור עבור PCR 4 כמותית.
      הערה: טיפול DNase מומלץ לפני השימוש RNA ביישומים במורד הזרם. טיפול זה יכול להתבצע על כמה עמודות טיהור RNA לפני השלב לשטוף, בנקודה הספציפית הזו לאחר elution הטור, או על aliquot של RNA כצעד ראשון בכל יישום במורד הזרם. רנ"א צריך להיות יציב במשך כמה שנים.

4. ניתוח היסטולוגית ידי Immunofluorescent Staininגרם של cryosections שרירים

  1. פרוטוקול immunofluorescence פשוט.
    1. השתמש בעט הידרופובי להקיף את קבוצת סעיפים על כל שקופית. בעדינות טיפת PBS לאזור בעיגול (כ 80 μl עבור שטח פנים קטן עד 500 μl עבור שטח פנים גדול), נזהרת שלא לגעת רקמות. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אם אתה משתמש שקופיות קפוא, להסיר שקופיות -80 ° C במקפיא דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות כדי להפשיר ויבש, ולאחר מכן להמשיך כנ"ל. לפחות שתי שקופיות נדרשות: שקופית ניסיוני אחד להיות וטופחה נוגדנים ראשוניים ומשניים; והחלק שליטה אחד שעבורו נוגדן ראשוני מוחרג, השליטה "משנית בלבד".
    2. עצת השקופית לשפוך את PBS. להוסיף חמור בדם 5% ב PBS (פתרון חסימה) לאזור הקיף; להיות זהיר על מנת להבטיח כי לא לייבש חלקי השריר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (או עד כמה שעות בתא לחות).
    3. כן פתרון נוגדן ראשוני לנתח התחדשות שריר. מערבבי פתרון לחסימה, עם נוגדן eMHC (01:40) ו נוגדן ColVI (1: 1,000). הכן כ 150 μl, 300 μl או 500 μl לארגונים קטנים, בינוניים, או באזורים שקופיות גדולות, בהתאמה. וורטקס למשך 5 שניות, ואז צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 15,000 XG כדי גלול כל משקע.
    4. עבור מגלשות ניסיון, להטות את השקופית לשפוך את חסימת פתרון ולאחר מכן להוסיף פתרון נוגדן ראשוני מ 4.1.3. עבור שקופית השליטה המשנית, להטות את השקופית לשפוך את חסימת פתרון ולאחר מכן להוסיף פתרון חסימה טרי (לא נוגדן). דגירת שקופיות בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: כאשר pipetting פתרונות נוגדנים על גבי שקופיות, תמיד למשוך נוזל מהחלק העליון של צינור פתרון נוגדן הראשוני, לא לשבש כל משקע בתחתית של התחתית.
    5. טיפ מחליק לשפוך את הפתרון. הוסף PBS dropwise לאזור בעיגול של כל שקופית לשטוף, טיפ לשפוךהנחה, ולאחר מכן להוסיף עוד PBS ו דגירה במשך 3 עד 5 דקות. חזור עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
      שים לב: בפעם לשטוף היא גמישה למדי וניתן התארכה עד 20 דקות אם תרצה בכך. באופן כללי, מספר שינויי פתרון חשוב יותר מאשר בפעם.
    6. כן פתרון נוגדנים משני עבור כל השקופיות (כוללים שקופיות שליטה המשניות) באמצעות דילול 1: 500 של נוגדנים משני מצמידי fluorophore אדומים וירוקים לזהות IgG1 עכבר (eMHC) ו IgG ארנב (ColVI) ו -1: 10,000 דילול של גרעין DAPI כֶּתֶם.
      1. לדוגמה, לערבב 1 μl של DAPI עם 9 μl של DDH 2 O לבצע דילול 1:10 של DAPI. לאחר מכן, במשך 500 נפח סופי μl, להוסיף 1.0 אנטי עכבר μl IgG1-אדום + 1.0 מיקרוליטר נגד ארנב IgG-ירוק + 0.5 μl של 1:10 DAPI כדי 447.5 μl של פתרון לחסימת. וורטקס לערבב צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 15,000 XG כדי גלול כל משקע.
        הערה: באופן אידיאלי, כל הנוגדנים משני צריכות להיות מאותו המין המארח.
    7. עצה השקופיות לשפוך את לשטוף PBS האחרון. הוסף פתרון נוגדנים משני כדי לכסות את כל הרקמות. מכסים את השקופיות כדי להגן עליהם מפני האור דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      הערה: כל הנוגדנים משני צריכים להיות מאומתים יש תגובתיות צולבת מינימאלית עם מינים אחרים בניסויי תיוג כפולים.
    8. שטפו את השקופיות כמתואר 4.1.5. לאחר לשטוף האחרון, להטות את השקופית לשפוך את PBS ולהגדיר את השקופית על רקמה. הוסף 3 עד 4 טיפות של תקשורת הרכבה מימית לאורך צד אחד.
    9. הגדר את קצה coverslip זכוכית רק אל הקצה החיצוני של תקשורת ההרכבה. בעזרת מלקחיים, מנמיכים את coverslip באיטיות לכיוון רקמות, ולאחר מכן, שחרר את coverslip לטפוח בעדינות אותו למקומו. לבסוף, לחץ בעדינות בכל פינה של coverslip כדי לייצב אותו.
    10. הגנו על שקופיות אור ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
      הערה: עבור אחסון לטווח ארוך, למרוח שכבה דקה של לק בשולי הcoverslip דואר כדי לעזור למנוע את השקופית מפני התייבשות.
  2. הערכה היסטולוגית.
    1. תמונה שקופיות באמצעות epifluorescent או confocal עם מסננים מתאימים לזהות eMHC (אדום); ColVI (ירוק); וגרעינים מוכתמים DAPI (כחול), בדרך כלל באמצעות 20X 1,5 אובייקטיבי.
    2. ודא את אות הניאון מ מגלשות ניסיוני שונה משקופית שליטה המשנית להפגין את הספציפיות של זיהוי eMHC ו ColVI 4.
      הערה: סיבי התחדשות חיוביים eMHC צריכים להיות גלויים מכ 2 עד 7 ימים לאחר פציעת שרירי variably בעכברים עם ניוון שרירים. קולגן VI שוהה תאים מטריקס סביב סיבי שריר, כלי דם ומערכת עצבים ובסופו של חבילות רקמת חיבור הגדולות של peri- ו epimysium. DAPI גרעיני כתם שימושי כדי לזהות סיבי שריר עם גרעינים מרכזיים לעומת גרעינים היקפיים המציין התחדשות סיבים, ואת הנוכחות של infiltrating תאים. סיבי נימקים או פצועים עלולים להכתים חלש עם הנוגדנים משני העכבר IgG בשל זיהוי של IgG אנדוגני חודרת הסיבים דרך ממברנות שרירים פגומות.
    3. כדי לכמת התחדשות, לצלם מיקרוסקופ חופפים עם כל מסנן פלורסנט פני התמונה כולה. מזג את eMHC, תמונות ColVI ו DAPI עבור כל מיקום ולאחר מכן יישר את התמונות לשחזר מפה של הקטע השלם 1,5.
    4. באמצעות תוכנת ניתוח, לספור את המספר סיבי חיובי eMHC ואת המספר סיבי הכוללים לחשב ההתחדשות אחרונה (100 * (# eMHC + סיבים / סיבים הכוללים #)). כמו כן, לספור את המספר סיבי גרעיני מרכזי מתוך הסיבים הכוללים למדוד התחדשות פני תקופה ארוכה יותר (100 * (# CN + סיבים / סיבים הכוללים #)) 1,5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

RNA השרירים cryosection הוא באיכות גבוהה ומספק תשואה מספיק עבור מרבית היישומים

ניתוח של שש עשר הכנות RNA שרירי שלד מוצג בלוח 1 באמצעות 19.4 כדי 41 מ"ג קדמי tibialis נקווה (ת"א) שריר מ 8 עכברים שליטים. עזוב שניהם (L) וימין (R) שרירי ת"א נערכו ניסויי התחדשות עם שרירים שנאספו 3 ימים לאחר זריקה תוך שרירית אורך של 25 μl של ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם שיטה זו, לשמור הטבעת השרף המוגבל לנמוך השליש או המחצית של השריר במהלך cryopreservation רקמות בגלל שרף עודף יאט את האוסף של cryosections ונקווה ועלול להגדיל הטבעת זיהום שרף בידוד RNA. כמו כן, תשומת לב קפדנית במהלך המגון מחט חשוב למקסם את התשואה ולהקטין את ההסתברות של סתימת המחט. הפרוטוקול ניתן לשנות באמצעות מזרק Luer-Lok כדי להגן מפני אובדן מדגם אם המחט נחסמה ודורשת בלחץ גבוה כדי לסלק את המחסום. צעד המגון מחט נוסף עם מחט מד 25 או 26 ניתן גם להוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברת מצהירה שאין לה אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מדיסון גרנט, סטיבן פולץ, היילי זסטרה וג'ונה לואן סיפקו סיוע טכני. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר AR065077. התוכן הוא באחריות המחבר בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פקקVWR מדעי23420-708חותכים לריבועים קטנים עם להב חד.
כיסוי פלסטיקפישר סיינטיפיק12-547משמש לכיוון השריר במהלך ההקפאה.
מדחום בטמפרטורה נמוכהVWR Scientific89370-158
2-methylbutaneSigmaM32631-4Lזהירות: כימיקל מסוכן. אחסן בארון דליק.
הטמעת שרף: "cryomatrix"Thermo Fisher Scientific6769006ניתן להחליף שרפי הטמעה אחרים ב-cryomatrix.
CryostatThermo Fisher Scientificmicrom HM550 עם מנשא להב חד פעמיכל קריוסטט עובד צריך להספיק לפרוטוקול.
להב קריוסטט חד פעמיThermo Fisher Scientific3052835השתמש בלהב או בסכין מתאימים לשימוש בקריוסטט.
פתרון טיהור RNAse: "RNase Zap"Thermo Fisher ScientificAM9780
איזון אנליטימטלר טולדוXS64
מברשת צבעDaler Rowney214900920 השתמש לטיפול בהקפאות. ניתן למצוא בחנויות עם ציוד אמנות פשוט.
סכין גילוחVWR Scientific55411-050
שקופית מיקרוסקופVWR מגיב מיצוי אורגני 48311600
RNA: TRIzolThermo Fisher Scientific15596026זהירות: TRIzol הוא כימיקל מסוכן. הערה: רק ריאגנטים מיצוי אורגניים מומלצים למיצוי RNA משרירי השלד.
מחט 18 מדVWR מדעיBD305185
22 מחט מדVWR מדעיBD305155
26 מחטמד VWR מדעיBD305115אופציונלי. יכול לשמש לסבב שלישי של טריטורציה של דגימה בפרוטוקול מיצוי RNA.
מזרק 1 מ"לVWR ScientificBD309659לדגימות בעלות ערך גבוה מאוד, מומלץ להשתמש במזרק Luer-Lok (למשל , VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)SigmaB9673
עבור 70% אתנול במי DEPC: אלכוהול 200 הוכחהDecon Laboratories, Inc.+M18027161Mלערבב 35 מ"ל 200 אלכוהול + 15 מ"ל מים DEPC.
ל-70% אתנול במי DEPC: מים שטופלו ב-DEPCThermo Fisher ScientificAM9922מערבבים 35 מ"ל 200 אלכוהול הוכחה + 15 מ"ל מים DEPC.
ערכת טיהור RNA: PureLink RNA minikitThermo Fisher Scientific12183018Aשלבים אחרונים של הכנת RNA.
מים ללא DNase/Rnase ניתן להשתמש גם במים שטופלו ב- Gibco10977
ספקטרופוטומטר: Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222טפל ב-RNA מטוהר כדי להסיר כל זיהום DNA לפני יישומי הזרם.
עט הידרופוביThermo Fisher Scientific8899
Gibco14190של Dulbeccoלפרוטוקול אימונופלואורסצנטי.
סרום חמוריםJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121לחות מלאי סרום חמורים רגיל בהתאם להוראות היצרן, ולאחר מכן יש לדלל מינון ל-5% לאימונופלואורסצנטי.  ניתן להשתמש גם בסרום עיזים רגיל.
נוגדן eMHCאוניברסיטת איווה מחקרים התפתחותיים בנק היברידומהF1.652
נוגדן קולגן VIפיצג'רלד תעשיות#70R-CR009x
חמור נגד ארנב AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
עז נגד עכבר IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD1306
מדיית הרכבה מימית: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMהשתמש רק באמצעי הרכבה המיועדים ליישומי פלורסנט בעלי תכונות נגד דהייה.
כיסוי זכוכיתVWR Scientific16004-314השתמש להרכבת שקופיות בקצה הפרוטוקל האימונופלואורסצנטי
תוכנת ניתוח תמונה: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express, או מוצרים מתקדמים יותרFreeware ImageJ אמור לעבוד גם עבור ספירה ידנית. תוכנה מתקדמת יותר עם יכולת פילוח עשויה לאפשר אוטומציה חלקית של התהליך; e., ImageProPremier.
מיזוג ומיפוי תמונות של מקטעים: PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659 הופסק. אפשרויות אחרות לקרדיוטוקסין הן EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; או Ge Script # RP17303; אך אלה לא אושרו.
ערכת שעתוק הפוך: Superscript III מערכת סינתזה של גדיל ראשוןThermo Fisher Scientific18080051ניתן להשתמש בכל ריאגנטים מאומתים ואיכותיים לשעתוק הפוך.
PCR סטנדרטי: מערכת פולימראז GoTaq FlexiPromegaM8298ניתן להשתמש בכל מערכת Taq פולימראז מאומתת ואיכותית. אם יש להשתמש בריצוף DNA עבור כל יישום במורד הזרם של ה-PCR, יש להשתמש במקום זאת במערכת PCR בנאמנות גבוהה.
SYBR ירוקתרמו פישר סיינטיפיקS7585לשימוש ב-qPCR כאשר לא משתמשים בתערובת מאסטר ייעודית של qPCR. השתמש עם SuperROX (עבור מכשירי Applied Biosystems) ופולימראז GoTaq Flexi ומאגרים.
ROX: SuperROX, 15 מ"מBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX יציב יותר בתגובת ה-PCR, ולכן הוא מועדף לשימוש כצבע ייחוס פסיבי qPCR על פני ROX (קרבוקסי-X-רודמין). עבור qPCR עם מכשירי Applied Biosystems
PCR בזמן אמתApplied Biosystems7900HT
DEPC.PBS PBS

מקורות

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20(2016).
  6. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
  7. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  8. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211(2010).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).
  10. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  11. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  12. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  13. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).
  14. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  15. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  16. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  17. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  18. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNATibialis Anterior
Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.