הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55060

⸱

23 באפריל 2017

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

תקציר

כיום ישן עניין רב ביצירת מערכי הורה איי חלבון דבק בים של משטח פסיבציה ללימודי תא ביולוגיים. בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי תאי חיים מגיבים, לא רק לאופי ביוכימיים של המולקולות שהוצגו בפניהם, אלא גם דרך מולקולות אלה מוצגות. יצירת מיקרו-דפוסי חלבון ולכן עכשיו תקן במעבדות הביולוגיה רבים; דפוסים-ננו הם גם יותר נגישים. עם זאת, בהקשר של אינטראקציות תא-תא, יש צורך הדפוס לא רק חלבונים אלא גם bilayers שומנים. דפוסים proteo-lipidic כפול כזה עד כה לא היה נגיש. אנו מציעים טכניקה קלילה ליצור נקודות ה- Nano חלבון נתמכות על זכוכית ולהציע שיטה לבצע מילוי חוזר של החלל הבין-הנקודה עם bilayer שומנים נתמך (SLB). מ-הלבנת תמונה של נותב ניאון שומנים כלולים SLB, אנו מדגימים כי bilayer מציג ניכר-PLנזילות Ane. Functionalizing נקודות החלבון עם קבוצות פלורסנט מאפשרת לנו לדמות אותם וכדי להראות שהם מסודרים סריג משושה רגיל. גודל הנקודה הטיפוסי הוא כ 800 ננומטר לבין המרווח הפגין כאן הוא 2 מיקרון. מצעים אלו צפויים לשמש פלטפורמות שימושיות כמו הידבקות תא, גירה ולימודים-חישת mechano.

מבוא

הידבקות התא מתבצעת באמצעות מולקולות הדבקה תא מתמחה (מצלמות), חלבונים המצויים על גבי קרום התא המסוגלים מחייב עמיתו שלהם על מטריצה ​​חוץ-תאית או על תא אחר. על תאים דבקים, המולקולות הדבקות ביותר כולל integrin ו cadherin בכל המקום, נמצאות בצורת אשכולות 1. האינטראקציה של לימפוציטים מסוג T (תאי T) עם תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים) מספקת המחשה בולטת עוד יותר לחשיבות של אשכולות קולטן נוצרו על הממשק בין שני התאים - לעתים קרובות נקרא סינפסה אימונולוגית. לאחר יצירת הקשר הראשוני עם קולטנים בתא APC, T (TCRs) על פני השטח של האשכולות בקנה מידת T תא טופס מיקרון המשמשים איתות פלטפורמות 2, 3, 4, והם בסופו של דבר מרוכז כדי ליצור אשכול מולקולרי מרכזי גדול (cSMAC )נַעֲרָה = "Xref"> 5, 6, 7. לאחרונה, ניתן היה לראות כי בצד APC, הליגנדים של TCR גם מקובצים 8.

בהקשר של אינטראקצית T תא-APC, פריסת מערכות היברידיות, שבו APC היא חיקתה ידי משטח מלאכותי פונקציונלי עם חלבונים רלוונטיים, יש מאוד קדם את ההבנה שלנו של הממשק הסינפטי 2, 3, 4, 5, 6, 7 . בהקשר זה, היא רלוונטית מאוד לעצב משטחים כוזבים APC כי ללכוד אחד או יותר בהיבטים של תא המטרה. לדוגמה, אם הליגנדים הם מורכבים על bilayers השומנים נתמך, הם יכולים לפזר את המטוס של bilayer, לחקות את המצב על פני השטח APC ובאותו זמן לאפשר היווצרות של6 cSMAC, 7. בדומה לכך, באשכולות על APC כבר חיקו ידי יצירת אי של הליגנדים בים של פולימרים 9, 10, 11, 12, 13, 14. עם זאת, יש שתי תכונות אלה עד כה לא שולבו.

כאן אנו מתארים שיטה חדשנית ליצירת נקודות ה- Nano של אנטי CD3 (נוגדן שפוגע במתחם TCR) מוקף bilayer השומנים עם שומנים לשדר. את bilayer מופקד באמצעות לנגמיואיר-Blodgett / לנגמיואיר-שייפר טכניקה 7, 15, 16 ו אם רוצים, אפשר פונקציונליות עם חלבון מסוים - למשל, ליגנד של integrin תא T (שנקרא ICAM1). בנוסף, cou נקודות חלבון אנטי CD3ld להיות מוחלף באחר נוגדן או CAM. בעוד בחרנו את החלבונים לשימוש עתידי כפלטפורמה למחקרים דבקים של תאי T, את האסטרטגיה המפורטת כאן ניתן להתאים לכל חלבון ואפילו DNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ניקוי זכוכית כיסוי-מגלשות צ'יימברס תצפית

  1. מסדר את כיסוי שקופיות זכוכית על מגש רב-שקופית עשוי חומר אינרטי כמו polytetrafluoroethylene (PTFE).
  2. לטבול את המגש עם מגלשות ובית נבחרי התצפית בתמיסה פעילה שטח (כל מוצר מומלץ לניקוי cuvettes קוורץ מתאים).
  3. שימוש באמבטיה קולית, אולטרה-sonicate בפתרון הפעיל השטח עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
  4. לשטוף 5 פעמים עם מים ultrapure (18.2 MΩ.cm, 0.059 מיקרו-שניות / ס"מ).
  5. אולטרה-sonicate בתמיסה פעילה שטח עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
  6. יש לשטוף 10 פעמים עם מי ultrapure.
  7. חזור על שלבי 1.5 ו 1.6 פעמים.
  8. חנות במים בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס) במשך עד שבוע.

2. ייצור של נקודות ה- Nano חלבון

  1. בתצהיר של חרוזים
    1. Deposit ההשעיה של חרוזים סיליקה (נ / v 2%, 70 μL) טיפה אחר טיפה על כיסוי-שקופית (24 x 24 מ"מ, עובי 170 מיקרומטר) שנערך נטייה של 15 מעלות.
    2. תנו ההשעיה להפיץ כ 1 דקות תוך הפיכת הזכוכית ידי 90 ° כל 15 s.
    3. לאפשר לנוזלים להתאדות בתנאי סביבה.
    4. חנות בכוס נקייה או קאמרית PTFE בכל תנאי הסביבה של עד 2 ימים.
  2. בתצהיר של אלומיניום
    1. מניח את השקופיות (מוכן בסעיף 2.1) בתוך תדר רדיו וציוד מקרטע (RF) magnetron 8, על שולחן מסתובב במרחק של כ 105 מ"מ מתוך אלומיניום (99%): סיליקון (1%) יעד.
    2. משאבה למטה בתא בתצהיר 2.6 x 10 -4 Pa באמצעות משאבה טורבו-מולקולרית. שלב זה חשוב להסרת זיהומי גזים אפשריים.
    3. הצג אווירת ארגון טהורה (5N, 99.999%) עם שטף של 10 SCCM בלחץ של 0.8 Pa (6.6 mTorr).
      הערה: שטף הארגון הנכנס נשלט על ידי בקר זרימה המונית ולחץ התהליך מנוטר באמצעות מד לחץ. תזרים גז הארגון הוא רציף נשלט על ידי איזון בין הכניסה שסתומי פתיחת לשקע.
    4. הפעילו את הגנרטור כוח RF.
      הערה: הנה, מגוון טיפוסי של 400-600 וואט חשמל בתדר רדיו ב 13.56 תדירות MHz שימש. מחולל RF משמש עם רשת התאמת במצב צימוד פלזמה קיבולי. הכוח בא לידי ביטוי מנוטר ממוזער באמצעות הסתגלות הרשת.
    5. אחרי הפלזמה הוא התייצב, גמגום עבור 2 דקות שמירה על התריס הסגור כדי להסיר זיהומים אפשריים מפני השטח של היעד.
    6. פתח את התריס ולאפשר המקרטעת להימשך 60 דקות להפקיד אלומיניום בשקופית הזכוכית בעובי של 200 ננומטר.
    7. חותך את זרימת הארגון, לסגור את שסתום השער לבודד את משאבת turbomolecular מהאולם בתצהיר לפרוק את החדר עם n הנקיitrogen להשיג את הלחץ בחדר. שחזר את השקופיות מצופה אלומיניום. אחסן עד חודש בקופסא זכוכית או PTFE נקיה הרמטית בתנאי סביבה.
  3. שיקוע של organosilane
    1. לטבול את השקופית מצופה אלומיניום מוכן בשלב 2.2.6 במים ultrapure בטמפרטורת החדר-sonicate אולטרה עבור 30 s באמבטיה קולי (50 W, 50/60 הרץ, בין 20 לבין 30 מעלות צלזיוס).
    2. 0.5 הפיקדון מ"ל של (3-aminopropyl) -triethoxysilane (APTES) בתחתית ייבוש.
      זהירות: APTES הוא organosilane, אשר מתאדה בקלות והוא רעיל. APTES יש לטפל רק תחת זרם-ברדס ועם כפפות.
    3. שים את שקופיות הזכוכית (שהוכנו 2.3.1) על רשת קרמיקת מקום בתוך הייבוש.
    4. חבור את ייבוש משאבת קרום ולרוץ לעבר כוח מרבי עבור 30 דקות כדי ליצור ואקום נמוך.
    5. סגור את השסתום של הייבוש לכבות את המשאבה.
    6. מחמם את הייבושכ 50 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
    7. פתח את הייבוש ולאסוף את השקופיות.
    8. העברה נוספת ייבוש נקי לאחסון של עד 48 שעות בטמפרטורת החדר (20 עד 30 מעלות צלזיוס).
  4. בתצהיר של שכבת החלבון הראשונה - אלבומין בסרום שור שכותרתו עם ביוטין (BSA ביוטין)
    1. מניח באחד השקפים המוכנים בסעיף 2.3 על תמיכת PTFE.
    2. פיקדון 1 מ"ל של 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA ביוטין המומסים בופר פוספט (PBS). השאירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 עד 30 מעלות צלזיוס).
    3. יש לשטוף 10 פעמים עם PBS. חנות המדגם עד 24 שעות ב 4 ° C הרחק ממקור אור.
  5. הסרת מסכת אלומיניום
    1. דגירה השקופיות בתמיסה של NaOH ב PBS (שהוכן על ידי dropwise תוספת של 1 M NaOH לכ 100 מ"ל PBS להשיג pH≈12) במשך הלילה בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
      זְהִירוּת. NaOH הוא מאכל, יש לטפל באמצעות כפפות.
    2. לִשְׁטוֹף10 פעמים במים ultrapure.

3. הפקדת bilayer השומנים נתמכים (SLB)

  1. ניקוי השוקת לנגמיואיר
    1. הסר את המים המתחמים PTFE של השוקת לנגמיואיר באמצעות משאבה.
    2. נקי במגבת המתכלים שאינם ארוגים נטולת מוך ספוגה בכלורופורם.
      זְהִירוּת. כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל באזור מאוורר היטב, עם מסכה (או תחת זרם-ברדס) ועם כפפות מתאימות.
    3. 4 פעמים נקיות עם מים פושרים ultrapure (40 עד 50 מעלות צלזיוס).
    4. 6 פעמים נקיות לפחות עם מי ultrapure קרים.
  2. בתצהיר של שכבת השומנים הראשונה
    1. מניחים מגשים PTFE במארז PTFE של שוקת לנגמיואיר ואז למלא אותו עם מים ultrapure.
    2. השתמש בתוכנת השליטה במנגנון לנגמיואיר להגדיר את הלחץ נמדד 0 MN / m.
    3. בעזרת כוס gastight / מתכת מזרק להפקיד 30 μL של פתרון השומנים 1 מ"ג / מ"ל ​​(1, 2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) כלורופורם) על פני המים. כלורופורם מתאדה ואת מולקולות השומנים ספונטניות יוצרות בשכבה.
    4. השתמש בתוכנה המלאה לדחוס בשכבת השומנים על ידי סגירת מחסום PTFE עד הלחץ הרצוי (27 MN / m עבור dOPC) הוא הגיע.
    5. השתמש בתוכנה המלאה לטבול את שקופית הזכוכית מוכנה בסעיף 2.5.2 לתוך מתחם PTFE באמצעות מהדק ממונע.
    6. החזק את השקופית, בתוך מלחציים, בניצב ממשק מים-אוויר. השתמש בתוכנה המלאה להעלות את זה לאט (15 מ"מ / דקה) דרך הממשק, תוך שמירה על לחץ קבוע על 27 MN / m.
    7. מקום בסביבה יבשה לשימוש מיידי או לאחסון של עד 24 שעות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
  3. בתצהיר של שכבת השומנים השנייה
    1. לשמור על לחץ משטח בשוקת לנגמיואיר על הערך הרצוי של 27 MN / m. דחיסה באמצעותתוכנת שליטה על המנגנון לנגמיואיר ו / או להוסיף כמות קטנה של שומנים בדם כדי להשיג את הלחץ הרצוי.
    2. מניח את שקופיות זכוכית נושאת בשכבת השומנים, הכינה בסעיף 3.2.6, אופקי על פני המים. ודא כי כל שקופית צפה מעל מגש PTFE.
    3. דחוף את מגלשות הכוס, שקופית אחת בכל פעם, לתוך מגש PTFE המקביל שלה באמצעות פינצטה PTFE או מתכת כזה שהם שקועים בתוך המים. הימנע הטיית השקופיות תוך דחיפה.
    4. להשתמש בפינצטה PTFE או המתכת להעביר את מגשים PTFE המכיל את השקופיות לתוך crystallizer מלא מי ultrapure מוודאים כי המגלשות אינן חשופות לאוויר.
    5. להשתמש בפינצטה PTFE או מתכת להעביר, תוך כדי עבודה מתחת למים, שקופית זכוכית מצופה bilayer לתוך תא התצפית.
      הערה: תא התצפית ממוקם מתחת למים בתוך crystallizer. תא התצפית מחוייט מורכב מטבעת PTFE עם אטם גומיתרמילי פלדה ד, אשר ניתן להרכיב מתחת למים כדי להפוך תא מים חזק אשר עשוי המשטח התחתון משקופית זכוכית מצופה בעבר עם bilayer השומנים.
    6. סגרו את תא בעודה ממשיכה לעבוד תחת המים ולהבטיח כי כ 1 מ"ל של מים לכוד בתוך החדר.
    7. קח את התא התאסף מחוץ למים. ודא שזה מים חזקים ודליפה בחינם.
    8. החלף את 1 מ"ל של ההווה מים ultrapure בתא תצפית עם PBS ידי הוספה והסרה 500 μL של פעמים 10 PBS. ודא כי החדר הוא לא נטול נוזלי.
  4. צעד חסימת SLB
    1. הציגו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אלבומין בסרום שור (BSA) בחדר תצפית המכיל את השקופית מוכן בסעיף 3.3.6 דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
    2. יש לשטוף את bilayer ידי הסרת והוספת 500 μL של פעמים 10 PBS. את bilayer יכול להישמר 24 שעות ב 4 ° C.

4. Functionalization עם הליגנדים

  1. להוסיף פלורסנט או לא פלורסנט neutravidin (NAV, גרסה deglycosylated של avidin אינה טעונה ב- pH 7) בשעה 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתוך תא המכיל את השקופית מוכן בסעיף 3.4.2 עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות C).
  2. יש לשטוף באמצעות הוספה והסרה 500 μL של פעמים 10 PBS.
  3. להוסיף biotinylated אנטי CD3 ב 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתא המכיל את השקופית מוכן בסעיף 3.4.2. עבור functionalization הכפול של SLB והנקודות, להוסיף FC-ICAM1 התג שלו ב 5 מיקרוגרם / מיליליטר (כאן, את bilayer עשוי dOPC + 1% של חומצת nitrilotriacetic (נ.ת.ע) ליפידים). השאירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
  4. יש לשטוף באמצעות הוספה והסרה 500 μL של PBS 10 פעמים
  5. החלף את PBS עם המדיום הסלולרי (PBS + 0.1% BSA) על ידי הוספה והסרה 500 μL של המדיום הסלולרי 10 פעמים.
  6. השאירו 200 μL של המדיום הסלולרי של chamber עם שקופיות.
  7. מניחים את החדר עבור 10 דקות ב 37 ° C לפני הוספת תאים.

5. הפקדת Cell (ראה התייחסות 7 לפרטים נוספים)

  1. בזהירות להפקיד 400 μL של ההשעיה תא לתא. דגירת התאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. תקן את התא עם 2% של paraformaldehyde (PFA) עבור 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. החלף את PFA עם PBS על ידי הסרת חוזרות והוספה של 500 μL של PBS.

תצפית 6.

  1. Proteo-lipidic-דפוס ננו ובזרימה SLB
    1. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונת דפוס החלבון במצב EPI-קרינה באמצעות גל תאורה מתאים (639 ננומטר) וקוביות מסננות (למשל כאן, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
      הערה: עוצמת האות ניתן לכמת לאמוד את כמות החלבון בתוך ומחוץ הנקודה. השתמש גל תאורה מתאים (330 ננומטר) ו- Fקוביית ilter לתמונה bilayer (BP 365/12, 395 FT, LP 397), אשר מופיע בהיר עם חורים כהים.
    2. השתמש הלבנת תמונה רציפה (CPB) טכניקה 13, 15 כדי למדוד את הדיפוזיה של ליפידים נותב ב bilayer. תצפית זו רצויה עשתה רק לאחר הפקדת SLB.
      הערה: על מנת לכמת את הדיפוזיה, שני פרמטרים נמדדים במהלך תהליך CPB: בפעם ההלבנה הספציפית של הצבע (המתוח) ואת אורך הריקבון של הפרופיל פלורסנט של ההילה נוצרה מסביב לאזור המולבן (tauD). הראשון מתקבל על ידי התוויית ההתפתחות בזמן של עוצמת הקרינה במרכז השדה המואר במהלך תהליך CPB. השני מתקבל על ידי התוויית הפרופיל בעצמה בקצה האזור המואר (בממוצע לכל 12 קווים 5 תמונות לאחר יציב הוא הגיע). העקומות מצויד להשיג מתוח tauD. הדיפוזיה ניתנת על ידי taא.ד. 2 / מתוח (D = figure-protocol-1 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמונות הקרינה נותחו על מנת למדוד את המרווח וגודל הנקודות. מרווח אופייני נמצא 1900 ± 80 ננומטר ו-גודל נקודה טיפוסי היה 600 ± 100 ננומטר (1G איור). המרווח נקבע על ידי גודל של חרוזים המשמשים את המסכה. The-גודל הנקודה מוגדר על ידי גודל החרוז כמו גם תנאים בתצהיר. SLB מופקד באופן ייחודי סביב הנקודות חלבון ולא עליהם (איור 2), עם השלמה מושלמת בין חורים הנראים ערוץ הדמיה SLB והנקודות ראיתי בערוץ הדמיה NAV. ניתוח של נתוני הל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול שתואר לעיל קשורים להיווצרות של נקודות ה- Nano חלבון או האחורי-ומילוי השטח סביב הנקודות ידי bilayer שומנים נתמך. השלב הקריטי הראשון ביחס ונקודות ננו חלבון הוא הכנת החרוז-המסכה. הניקוי של הכיסוי שקופית הוא קריטי. השקופיות צורכות לנקות או בתמיסת ניקוי כי מומלצת לניקוי cuvettes קוורץ, או עם פלזמת חמצן. טכניקות ניקוי אחרים כמו טבילה באתנול או טיפול-פרופנול ISO אינם מעבדים את הזכוכית מספיק הידרופילי ולכן אינם תומכים היווצרות monolayer חרוז גדול כיסוי. במקב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים לורן Limozin, פייר דילארד אסטריד וואהל להמשך דיונים פוריים על יישומי הסלולר. אנו מודים גם פרדריק Bedu ממתקן cleanroom PLANETE על עזרתו עם תצפיות SEM. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המועצה האירופית למחקר באמצעות מס מענק 307,104 FP / 2007-2013 / ERC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כיסויי זכוכיתמסייעים, קרל הכט KG 
תא תצפיתתוצרת
(Hellmanex)Hella Analytics9-307-011-4-507
אולטרה-סוניקטורThermoFisher
DesiccatorLabbox
Crystallizer שוט
נויטראוודיןתרמו פישר מדעי84607
PBS סיגמא-אולדריץ'P3813
מים MQ ELGA, Veolia צרפת
חרוזי סיליקהCorpuscular Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-ביוטיןSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
Dansyl-PEAvanti Polar Lipids810330C
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'650471
מזרק אטום לגז דומיניק דשר , צרפת74453
איזון סרטיםNIMAמיקרוסקופ בינוני
Zeiss, גרמניהTIRF-III
יעד אלומיניום Kurt J. Lesker Compagny, ארה"ב
מגנטרון בתדר רדיו מקרטע Systè אני כלי SMC 600 שונה על ידי ALCATEL , צרפת
תרכיז פעילי שטח אלקליין בית מערכת

מקורות

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
  2. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  3. Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
  4. Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
  7. Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
  8. Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
  9. Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
  10. Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
  11. Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
  12. Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
  13. Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
  14. Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
  15. Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
  16. Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
  17. Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
  18. Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
  19. Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
  20. Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
  21. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  22. Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
  23. Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
  24. Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
  25. Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398(2012).
  26. Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ננו-צבירי חלבוניםמערכי ליגנדיםטכניקת מסכת חרוזיםשיקוע אלומיניוםפונקציונליזציה של APTESציפוי BSA-Biotinמיקרוסקופיית TIRFמיקרוסקופיית RICMנזילות של שכבה ליפידית דו-שכבתית
מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.