אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כיום ישן עניין רב ביצירת מערכי הורה איי חלבון דבק בים של משטח פסיבציה ללימודי תא ביולוגיים. בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי תאי חיים מגיבים, לא רק לאופי ביוכימיים של המולקולות שהוצגו בפניהם, אלא גם דרך מולקולות אלה מוצגות. יצירת מיקרו-דפוסי חלבון ולכן עכשיו תקן במעבדות הביולוגיה רבים; דפוסים-ננו הם גם יותר נגישים. עם זאת, בהקשר של אינטראקציות תא-תא, יש צורך הדפוס לא רק חלבונים אלא גם bilayers שומנים. דפוסים proteo-lipidic כפול כזה עד כה לא היה נגיש. אנו מציעים טכניקה קלילה ליצור נקודות ה- Nano חלבון נתמכות על זכוכית ולהציע שיטה לבצע מילוי חוזר של החלל הבין-הנקודה עם bilayer שומנים נתמך (SLB). מ-הלבנת תמונה של נותב ניאון שומנים כלולים SLB, אנו מדגימים כי bilayer מציג ניכר-PLנזילות Ane. Functionalizing נקודות החלבון עם קבוצות פלורסנט מאפשרת לנו לדמות אותם וכדי להראות שהם מסודרים סריג משושה רגיל. גודל הנקודה הטיפוסי הוא כ 800 ננומטר לבין המרווח הפגין כאן הוא 2 מיקרון. מצעים אלו צפויים לשמש פלטפורמות שימושיות כמו הידבקות תא, גירה ולימודים-חישת mechano.
מבוא
הידבקות התא מתבצעת באמצעות מולקולות הדבקה תא מתמחה (מצלמות), חלבונים המצויים על גבי קרום התא המסוגלים מחייב עמיתו שלהם על מטריצה חוץ-תאית או על תא אחר. על תאים דבקים, המולקולות הדבקות ביותר כולל integrin ו cadherin בכל המקום, נמצאות בצורת אשכולות 1. האינטראקציה של לימפוציטים מסוג T (תאי T) עם תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים) מספקת המחשה בולטת עוד יותר לחשיבות של אשכולות קולטן נוצרו על הממשק בין שני התאים - לעתים קרובות נקרא סינפסה אימונולוגית. לאחר יצירת הקשר הראשוני עם קולטנים בתא APC, T (TCRs) על פני השטח של האשכולות בקנה מידת T תא טופס מיקרון המשמשים איתות פלטפורמות 2,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ניקוי זכוכית כיסוי-מגלשות צ'יימברס תצפית
- מסדר את כיסוי שקופיות זכוכית על מגש רב-שקופית עשוי חומר אינרטי כמו polytetrafluoroethylene (PTFE).
- לטבול את המגש עם מגלשות ובית נבחרי התצפית בתמיסה פעילה שטח (כל מוצר מומלץ לניקוי cuvettes קוורץ מתאים).
- שימוש באמבטיה קולית, אולטרה-sonicate בפתרון הפעיל השטח עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר (בין 20 ו 30 מעלות צלזיוס).
- לשטוף 5 פעמים עם מים ultrapure (1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תמונות הקרינה נותחו על מנת למדוד את המרווח וגודל הנקודות. מרווח אופייני נמצא 1900 ± 80 ננומטר ו-גודל נקודה טיפוסי היה 600 ± 100 ננומטר (1G איור). המרווח נקבע על ידי גודל של חרוזים המשמשים את המסכה. The-גודל הנקודה מוגדר על ידי גודל החרוז כמו גם תנאים בתצהיר. SLB מופקד באופן ייחודי סביב הנקודות חלבון ולא עליהם (איור 2), עם השלמה מושלמת בין חורים הנראים ערוץ הדמיה SLB והנקודות ראיתי בערוץ הדמיה NAV. ניתוח של נתוני הל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול שתואר לעיל קשורים להיווצרות של נקודות ה- Nano חלבון או האחורי-ומילוי השטח סביב הנקודות ידי bilayer שומנים נתמך. השלב הקריטי הראשון ביחס ונקודות ננו חלבון הוא הכנת החרוז-המסכה. הניקוי של הכיסוי שקופית הוא קריטי. השקופיות צורכות לנקות או בתמיסת ניקוי כי מומלצת לניקוי cuvettes קוורץ, או עם פלזמת חמצן. טכניקות ניקוי אחרים כמו טבילה באתנול או טיפול-פרופנול ISO אינם מעבדים את הזכוכית מספיק הידרופילי ולכן אינם תומכים היווצרות monolayer חרוז גדול כיסוי. במקב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים לורן Limozin, פייר דילארד אסטריד וואהל להמשך דיונים פוריים על יישומי הסלולר. אנו מודים גם פרדריק Bedu ממתקן cleanroom PLANETE על עזרתו עם תצפיות SEM. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המועצה האירופית למחקר באמצעות מס מענק 307,104 FP / 2007-2013 / ERC.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כיסויי זכוכית | מסייעים, קרל הכט KG | ||
| תא תצפית | תוצרת | ||
| (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 | |
| אולטרה-סוניקטור | ThermoFisher | ||
| Desiccator | Labbox | ||
| Crystallizer | שוט | ||
| נויטראוודין | תרמו פישר מדעי | 84607 | |
| PBS | סיגמא-אולדריץ' | P3813 | |
| מים MQ | ELGA, Veolia צרפת | ||
| חרוזי סיליקה | Corpuscular Inc | 147114-10 | |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 | |
| BSA-ביוטין | Sigma-aldrich | A8549 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C | |
| כלורופורם | סיגמא-אולדריץ' | 650471 | |
| מזרק אטום לגז | דומיניק דשר , צרפת | 74453 | |
| איזון סרטים | NIMA | מיקרוסקופ בינוני | |
| Zeiss, גרמניה | TIRF-III | ||
| יעד אלומיניום | Kurt J. Lesker Compagny, ארה"ב | ||
| מגנטרון בתדר רדיו מקרטע Systè אני | כלי SMC 600 שונה על ידי ALCATEL , צרפת |
מקורות
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminate....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
