Autophagy ההפעלה מועילה במניעת מספר מחלות. אחת הגישות הפיזיולוגיות לגרום autophagy in vivo הוא פעילות גופנית. כאן אנו מראים כיצד להפעיל autophagy ידי פעילות אירובית ולמדוד רמות autophagy בעכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוטופגיה היא מסלול פירוק ליזוזומלי החיוני להומאוסטזיס, תפקוד והתמיינות של תאים. בתנאי לחץ, אוטופגיה מושרית ומכוונת למטענים שונים, כגון ציטוזול בתפזורת, אברונים פגומים וחלבונים לא מקופלים, לפירוק בליזוזומים. מולקולות התזונה המתקבלות ממוחזרות בחזרה לציטוזול לצורך סינתזת חלבון חדשה וייצור ATP. להגברת האוטופגיה יש השפעות מועילות נגד פתוגנזה של מחלות רבות, ודווח על אסטרטגיות פרמקולוגיות ופיזיולוגיות להפעלת אוטופגיה. פעילות אירובית זוהתה לאחרונה כגורם יעיל לאוטופגיה באיברים מרובים בעכברים, כולל שרירים, כבד, לב ומוח. כאן אנו מראים נהלים לגרימת אוטופגיה in vivo על ידי תרגיל הליכון מאולץ או ריצת גלגלים מרצון. אנו גם מדגימים שיטות מיקרוסקופיות וביוכימיות לניתוח כמותי של רמות אוטופגיה ברקמות עכבר, תוך שימוש בחלבוני הסמן LC3 ו-p62 המועברים לליזוזומים ומתפרקים בהם יחד עם אוטופאגוזומים.
מבוא
Autophagy הינו מסלול השפלה שמור באבולוציה, אשר נגרמת בתגובה לתנאי קיצון שונים כגון הרעבה היפוקסיה 1, 2. במהלך autophagy, שלפוחית כפולת הממברנה, שנקראה autophagosomes, לשלב רכיבי subcellular מיותרים או פגומים ולהעביר אותם לתוך lysosomes שפל 3. Autophagy בסל חיוני לתפקוד הסלולר ופיתוח האורגניזם, autophagy הבסיס לקוי הוא מעורב הפרעות רבות, כולל ניוון מוחיים, tumorigenesis וסוכרת מסוג 2 4, 5, 6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת נורת'ווסטרן ועדת שימוש (IACUC).
1. מודלים עכבר
- השתמש 8-12 עכברים שבועות בן באימון התעמלות. כדי לזהות autophagy למימוש מושרה in vivo, השתמשו העכברים המהונדסים GFP-LC3 (C57BL / 6 רקע) עבור בדיקות הדמיה ועכברי C57BL / 6 עבור ניתוחים ביוכימיים.
Autophagy 2. הנגרמת ממאמץ
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות שונות כדי לגרום autophagy ברקמות עכבר על ידי פעילות אירובית: סך של 90 דקות של פעילות גופנית כפויה על הליכון רב-ליין ולפניו ימים של הסתגלות; או שבועות של פעילות גופנית מרצון על גלגל ריצה שמוצג עכברים חד שוכן. בכל פרוטוקול פעילות גופנית, אנו יכולים למדוד את השטף autophagy ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח כתם המערבי באיברים שונים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Autophagy הוא תהליך קטבולי המספק אנרגיה ומפחית רעילות על ידי השפלה lysosomal של רכיבים הציטופלסמה או אברונים פגומים. לימוד autophagy חשוב להבין הסדרת הומאוסטזיס הסלולר מנגנוני תגובת לחץ. מודלים ומתודולוגיות חדשים צצים בתחום המחקר 15, כדי ללמוד כיצד autophagy לקוי תורם תהליכים פתולוגיים רבים 16, 17.
מניעת מזון (רעב) ואינדוקציה תרופת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים למעבדה להיסטולוגיה ופנוטיפ של עכברים באוניברסיטת נורת'ווסטרן על התמיכה הטכנית והסיוע, ול-Noboru Mizushima (אוניברסיטת טוקיו) על אספקת עכברים טרנסגניים GFP-LC3. A.R. ו-C.H. נתמכו על ידי קרנות הסטארט-אפ מאוניברסיטת נורת'ווסטרן ומענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (DK094980).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הליכון | קולומבוס מכשירים | 150-RM Exer 3/6 | |
| גלגל ריצה עכבר | סופר פט | קוטר 100079365 11.4 ס"מ | |
| מד מרחק | פעמון לוח מחוונים 100 | ||
| משאבת מזרק | KD Scientific | KDS100 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | ניקון | דגם: מיקרוסקופ הפוך ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| הומוגנייזר | IKA | 003737001 / דגם: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | נדרש ציוד הגנה אישי. מוצר זה עשוי לשחרר גז פורמלדהיד, כימיקל הידוע כגורם לסרטן. |
| מדיה הרכבה | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 נוגדן | BD Biosciences | 610833 | |
| נוגדן LC3 | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
מקורות
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
