הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy הינו מסלול השפלה שמור באבולוציה, אשר נגרמת בתגובה לתנאי קיצון שונים כגון הרעבה היפוקסיה ^{1, 2.} במהלך autophagy, שלפוחית כפולת הממברנה, שנקראה autophagosomes, לשלב רכיבי subcellular מיותרים או פגומים ולהעביר אותם לתוך lysosomes שפל ^3. Autophagy בסל חיוני לתפקוד הסלולר ופיתוח האורגניזם, autophagy הבסיס לקוי הוא מעורב הפרעות רבות, כולל ניוון מוחיים, tumorigenesis וסוכרת מסוג 2 ^{4, 5, 6.}

Inducer autophagy הפיזיולוגי הידוע ביותר הוא רעב. עם זאת, יש לו שתי מגבלות עיקריות. ראשית, רעב לוקח תקופה ארוכה כדי לגרום autophagy ביעילות בבעלי חיים, למשל, 48 שעות של הגבלת מזון בעכבריםברוב האיברים. שנית, רעב בקושי גורם autophagy המוח, בשל אספקת חומרי מזון יציבה יחסית במוח. למעשה, זה גם קשה לזהות אינדוקצית autophagy ידי מעורר-מולקולה קטנה, כמו תרופות רבות לא יכולות לעבור את מחסום דם המוח. לכן, כדי לנתח טוב יותר את הפונקציה של הפעלת autophagy בהיווצרות מחלה, גילינו לאחרונה כי פעילות גופנית היא שיטה פיזיולוגית חזקה יותר כדי לגרום autophagy בתוך פרק הזמן קצר ^{7, 8, 9.} בהשוואה רעבה, autophagy מושרה ביעילות על ידי הפעלת הליכון מהר ככל 30 דקות. וכך, פעילות גופנית היא גישה פיזיולוגית נוחה ורב-עצמה כדי ללמוד את המנגנון של autophagy בתיווך יתרונות בריאות ולמניעת מחלות.

ישנן מספר סמנים חלבוניים לצורך זיהוי של פעילות autophagy, כולל LC3 ו p62. LC3 (1A חלבון הקשורים microtubule / 1B-אור גהיין 3) הוא חלבון cytosolic (LC3-אני טופס) כי הוא מצומדות כדי PE (phosphatidylethanolamine) על אינדוקציה autophagy. PE-lipidated LC3 (טופס LC3-II) מגויס על ממברנות autophagosomal וניתן להשתמש בו כדי להמחיש autophagosomes כאשר שכותרתו עם GFP. טרנסלוקציה שלה מן cytosol כדי punctate מבנים של autophagosomes תחת מיקרוסקופ הוא אינדיקציה אינדוקציה autophagy. p62 הוא קולטן מטענים עבור מצעים autophagy (כגון חלבונים ubiquitination), והוא שולב autophagosomes גם כן. מאחר והחלבון נפגע lysosomes יחד עם autophagosomes, רבדיו ניתן להשתמש כדי למדוד את שטף autophagy. כאן אנו מראים כיצד להשתמש סמנים אלה לכמת autophagy ברקמות עכבר שונים המושרה על ידי פעילות גופנית אירובית, כולל פעילות גופנית כפויה (הליכון) ופעילות גופנית מרצון (ריצה גלגלים). אותו הנהלים יכולים לחול גם על in vivo מדידת autophagy לאחר הטיפול של מעוררים אחרים.

כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת נורת'ווסטרן ועדת שימוש (IACUC).

1. מודלים עכבר

1. השתמש 8-12 עכברים שבועות בן באימון התעמלות. כדי לזהות autophagy למימוש מושרה in vivo, השתמשו העכברים המהונדסים GFP-LC3 (C57BL / 6 רקע) עבור בדיקות הדמיה ועכברי C57BL / 6 עבור ניתוחים ביוכימיים.

Autophagy 2. הנגרמת ממאמץ

1. התקנת הליכון - נאלץ תרגיל
   1. לאקלם ולאמן את העכברים על הליכון פתוח במעלה ההר 10 מעלות במשך 2 ימים. ביום 1, לממש את העכברים במשך 5 דקות ב 8 מ '/ דקה, וביום 2, לממש את העכברים במשך 5 דקות ב 8 מ' / דקה ואחריו 5 דקות אחר ב -10 מ '/ דקה ^10. עודד העכברים המנוהל על ידי דחיפת יד עדינה.
   2. ביום 3 ^rd, מלאפשר לעכברים לעבור התקף יחיד של ריצה במשך 90 דקות על 10 ° הליכון במעלה ההר, starting במהירות של 10 מ '/ דקה. לאחר 40 דקות, להגביר את מהירות הליכון בקצב של 1 מ '/ דקה כל 10 דקות עבור סכום כולל של 30 דקות, ולאחר מכן להגביר את המהירות בשיעור של 1 מ' / דקה כל 5 דקות עד שהוא מגיע 17 מ '/ דקה, עבור סכום כולל של 90 דקות של זמן אימון ל -1,070 מטרים של מרחק ריצה.
   3. הגדר את הגירוי החשמלי מגוון בעצימות נמוכה (1.2 הרץ), ולעודד העכברים לרוץ כדי למנוע הלם ברגל חזר.
   4. לקבלת אוסף רקמות, להרדים את העכברים משאיפת isoflurane, ואחריו נקע בצוואר הרחם מיד לאחר פעילות גופנית. שיטות מתת חסד אשרו אחרים יכולות לשמש גם, כגון CO2 או הזרקת IP של הרדמה אחרת. רמת autophagy לא נראית להיות מושפעת שיטות של המתת חסד.
2. התקנת גלגל ריצה - גופני רצונית
   1. מניחים גלגל ריצה-עכבר (11.4 ס"מ קוטר) בתוך כלוב עם העכבר חד שוכנו.
   2. בדוק את הקיבולת פועלת באמצעות מד מרחק אופניים.הגדרת פרמטר הגלגל [מרחק (במ"מ) לכל סיבוב מלא של ההגה], בעמ '358 (11.4 * π). למדוד את מרחק הריצה לאחר 24 שעות.
   3. תנו עכבר להפעיל בהתנדבות עבור 2 שבועות עם גלגל ריצה. לקבלת אוסף רקמות, להקריב את העכבר בבוקר לאחר תקופת הריצה.

3. Autophagy הערכת שטף

1. כדי למדוד את השטף autophagic בתנאים מנוחה ופעילות גופנית, טיפול בעכברים עם chloroquine autophagy מעכב במשך שלושה ימים ולהשוות אותם העכברים שטופלו PBS.
   1. ממיסים chloroquine PBS (5 מ"ג / מ"ל), ולהזריק chloroquine לעכברים intraperitoneally במינון של 50 מ"ג / ק"ג / יום, במשך שלושה ימים רצופים. קורבן עכברים ולאסוף רקמות 3 שעות לאחר הזריקה האחרונה.
   2. עבור עכברים למימוש, pretreat אותם עם chloroquine במשך יומיים רצופים במינון של 50 מ"ג / ק"ג / יום. ביום השלישי, להזריק עכברים עם ריכוז זהה של chloroquine, ואחרי90 דקות ולתת להם לרוץ על הליכון למשך 90 דקות אחרות.
   3. להרדים את העכברים משאיפת isoflurane, ואחריו נקע בצוואר הרחם. דגימות של רקמות ומייד לאחר הפעלתו, כך שבפעם הדגירה הכוללת של chloroquine זהה עכברים שליטים (מנוחה) (3 שעות).
      הערה: לחילופין, להשתמש זריקה אחת של chloroquine לקבוע את השטף autophagy ברקמות העכבר.

רקמות 4. קציר קיבוע

1. לפני הקציר רקמות להכין פוספט בופר (PBS) ו paraformaldehyde 4% טרי (PFA, זהירות: ציוד מיגון אישי חובה) ב PBS ב- pH הסופי של 7.4. לאחסן הוא פתרונות על 4 מעלות צלזיוס.
2. מלאו 30 מזרק מ"ל עם 15 - 20 מ"ל של 4% PFA (עבור עכברים GFP-LC3). חבר את המזרק עם מחט קטטר 20 G.
3. לאחר פעילות גופנית, להרדים את העכברים משאיפת isoflurane, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
4. מניח את החיה על משטח עבודה נקי על ba שלהck. גזור לפתוח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת כדי לחשוף את הלב.
5. לעשות חתך קטן על הכבד לתת את הדם לצאת, ולהזריק סך של 15 מ"ל 4% PFA לאט לתוך החדר הימני של הלב באמצעות קטטר, עד הריאות והכבד להחוויר לחלוטין. Perfuse העכבר מיד לאחר האימון, באמצעות משאבת מזרק עם קצב הזרימה המתמדת של 90 מ"ל / שעה.
6. לאחר זלוף, להוציא את המחט ולאסוף רקמות עניין (מוח למשל ¹¹ שרירי שלד). עבור שרירי השלד, לנתח את lateralis vastus. בקצרה, למשוך את העור של הרגל לאחור כדי לחשוף את השרירים, למקם את שריר הירך femoris ^12, ו לנתח את lateralis vastus, המהווה את השריר החיצוני עם חיבור אל החלק העליון של עצם הירך.
7. עבור קיבוע והתייבשות נוספים, למקם את הרקמות של עכברים-LC3 GFP ב PFA 4% למשך 24 שעות ב 4 ° C, ולאחר מכן להעביר אותם עד 15%סוכרוז- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד שהשתקעו הרקמות, ולאחר מכן ל -30% סוכרוז-PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה או לאחסון ארוך יותר. שמור את הדגימות בחושך ככל האפשר מכיוון שהם עלולים להיות רגישים לאור חזק.
8. לניתוח כתם המערבי הצמד להקפיא את רקמות מן C57BL / 6 עכברים ישירות בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 ° C.

5. ניתוח הדמיה של ה- GFP-LC3 puncta

1. תהליך רקמות
   1. טרום לטפל ברקמות (הקבועים בעבר PFA ומאוחסנים סוכרוז 30%) ב הטבעה בינונית כגון "מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלי" (אוקטובר) במשך כמה דקות בצלחת פטרי קטנה שכותרתו.
   2. העברת הרקמה בתוך cryomold שכותרתו המכיל מספיק אוקטובר הטרי כדי לכסות את הרקמה. אוריינט פני השטח חתך לכיוון החלק התחתון של cryomold (חתך עבור vastus lateralis שרירים קטע sagittal עבור המוח חמי). למנוע היווצרות של בועות.
   3. freEze דגימות ידי הצבת cryomold במשך כמה דקות בתוך צידנית קצף ממולאת קרח יבש, עד ב- OCT הופך לבן. עוטפים דגימות בודדות רדידי שכותרתו, לאטום אותם בשקית ניילון, ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר.
   4. השתמש cryostat לחתוך חלקים מדגם בעובי של 10 מיקרומטר, ו הר בסעיפים בשקופיות. אחסן את השקופיות ב -20 ° C, ותמיד לשמור את השקופיות מן האור בכל הזדמנות אפשרית.
2. הכנת שקופיות
   1. סר שקופית מהמקפיא להפשיר אותם בטמפרטורת חדר. מכסים את קטע רקמה עם ירידה של התקשורת גובר עם DAPI. מניחים coverslip בגודל המתאים על גבי למנוע היווצרות בועה.
   2. למרוח לק על הציפורניים כדי לאטום את הקצוות של coverslip, לאפשר לק להתייבש בחושך בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לאחסן את השקופיות במיכל אור חזק על 4 מעלות צלזיוס, או להמשיך עם לכידת הדמיה של puncta GFP-LC3.
3. <strong> כימות GFP - LC3 puncta ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי
   1. בצע מיקרוסקופיה epifluorescence, לכידת תמונות באותו מצב (חשיפה והגדרות) עבור כל הדגימות. עבור GFP, להשתמש אורך גל פליטה של ​​525 ננומטר; עבור DAPI, השתמש 490 ננומטר. רוכש לפחות עשר תמונות לדגימה באמצעות מטרת 60X עבור lateralis vastus ואזור האונה הקדמי של המוח.
   2. לכמת את מספר puncta GFP-LC3 באזור רקמות של 2,500 מיקרומטר ² בכל תמונה לניתוח סטטיסטי, עיוור לקבוצות הניסוי. חשבתי את המספר הממוצע מ 10 תמונות של כל דגימה, באמצעות פונקצית המדידה האוטומטית של "רוזן אובייקט". הגדרות עבור vastus lateralis שרירים הם: L סף = 10, H = 200; 2X להחליק; 1X נקי, והגדרות עבור האונה הקדמית במוח הם: L סף = 11, H = 200; 2X להחליק; 1X נקי.

6. ניתוח כתם המערבי על מרקרים Autophagy

1. <תהליך strong> רקמות
   1. הכן את החיץ תמוגה: 50 mM Tris-HCl; 150 מ"מ NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; מעכב פרוטאז מעכב phosphatase (הוסיף טרי).
   2. הסרת הרקמה של C57BL / 6 עכברים מ -80 ° C אחסון. חותכים את רקמת השריר לחתיכות קטנות עם סכין גילוח לפני התהליך הבא. להוסיף 800 μl (עבור מוח חם) או 500 μl (עבור lateralis vastus) של חיץ תמוגה קר המדגם. Homogenize המדגם ב 4 ° C עם homogenizer במהירות בינונית.
   3. מלא lyse את התערובת הומוגני במשך 30 דקות אחרות כדי השעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה.
   4. ספין למטה homogenate ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים את הכדור, ולאסוף את supernatant בצינור חדש.
2. ניתוח autophagy
   1. קביעת ריכוז החלבון של lysates רקמות באמצעות ערכת assay חלבון BCA על פי המפרט של היצרן. נרמל כל דגימהלאותו ריכוז.
   2. מערבבים את המדגם עם חיץ מדגם 2x Laemmli ביחס של 1: 1, להרתיח אותו ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 - 10 דק ', והמשך עם ניתוח כתם המערבי על autophagy סמנים ^{13, 14,} כגון p62 (נוגדן אנטי p62, 1: 500 דילול) ו LC3 (נוגדן אנטי LC3, 1: 500 דילול). מרתיח את הדגימות מייד לאחר תוספת של חיץ המדגם, כפי דגירה כבר על קרח עשויה ליצור להקות מושפלות מרובות של LC3.
   3. לכמת להקות p62 ו LC3 ידי ניתוח צפיפות באמצעות ImageJ, לנרמל את הערך הלהקה אקטין המקביל.

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות שונות כדי לגרום autophagy ברקמות עכבר על ידי פעילות אירובית: סך של 90 דקות של פעילות גופנית כפויה על הליכון רב-ליין ולפניו ימים של הסתגלות; או שבועות של פעילות גופנית מרצון על גלגל ריצה שמוצג עכברים חד שוכן. בכל פרוטוקול פעילות גופנית, אנו יכולים למדוד את השטף autophagy ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח כתם המערבי באיברים שונים.

השתמשנו קו עכבר מהונדס המבטא LC3-tagged GFP כמערכת כתב לפקח autophagy ידי תרגיל 1. עם אינדוקציה autophagy, LC3 translocates מן cytosol אל autophagosome במבנים punctate. לאחר חתך, היווצרות של puncta GFP-LC3 ניתן דמיינו ישירות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 א). לחלופין, מבנים autophagosome יכול גם להיות immunostained ידי נוגדן LC3 עבורהַדמָיָה. כך או 90 דקות של פעילות גופנית על הליכון או 2 שבועות של ריצה מרצון הגדילה את מספר puncta GFP-LC3 בשני שרירי השלד (lateralis vastus) ואת קליפת המוח, בהשוואה למצב המנוחה (איור 1B). יצוין כי באזור קליפת המוח הקדמי כבר באזור מרכזי המוח שבו autophagy מושרה בבירור על ידי אחת משיטות עד כה. פעילות גופנית גם המושרה ההמרה של LC3 מטופס cytosolic (LC3-I) לטופס השומנים מצומדות (LC3-II), אשר ניתן לאתרם באמצעות ניתוח כתם המערבי (איור 1 ג).

תרגיל מושרה תוספת של autophagosomes (המיוצגים על ידי LC3-II ו- GFP-LC3 puncta) נובעת שטף autophagic גבוה, ולא לחסום שפלת autophagosome, מוערך על ידי השימוש במעכבים של שפלת lysosomal, כגון bafilomycin A1 או chloroquine . הנה מדד השפלה של p62 קולטן מטען autophagic כקובץ לשעברמַסְפִּיק. תרגיל (90 דק 'של הליכון) גרם השפלה גבוהה של p62 בשרירי שלד מאשר מצבם המנוחה, אשר חולץ בזריקה עם chloroquine לפני לממש (איור 2). תוצאות דומות גם הם נצפו עם תרגיל מרצון על ידי הפעלת הגלגלים. וכך, פעילות גופנית אירובית על ידי גלגלים הליכון או ריצה גורמת autophagy in vivo, נמדד הרמה היציבה של LC3 ואת ההשפלה של p62.

איור 1. התעמלות אירובית גורמת Autophagy ברקמות עכבר. נציג תמונות (א) וכימות (B) של puncta GFP-LC3 בשרירי שלד (lateralis vastus) ומוח (אונה קדמית) של עכברים מהונדסים GFP-LC3 בתנאי השליטה (מנוחה), אחרי 90 דקות של פעילות גופנית כפויה (הליכון או לאחר 2 שבועות של פעילות גופנית מרצון (גלגל)). תוֹצָאָההים מייצג ממוצע ± SEM של 10 תמונות לכל עכבר. N = 5 עכברים. אורכי גל הפליטה הבאים שימשו: GFP - 525 ננומטר; DAPI - 490 ננומטר. (ג) גילוי כתם המערבי של LC3 בשרירי השלד (lateralis vastus) מ נינוח למימוש (על ידי הליכון) עכברים. נתוני כימותים מייצגים את רמת LC3-II מנורמלת יקטין (משמאל) ואת היחס של LC3-II LC3-I (מימין). N = 3 עכברים. נתון משווה כל ערך מדגם השליטה. תוצאות מייצגים ממוצע ± SEM *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001, t-test. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. Exercise מגדיל שטף Autophagy בשרירי שלד העכבר. (א) כתם המערביזיהוי של p62 ב lateralis vastus מעכברים נינוחים המבוצעים קיומו או אי קיומו של chloroquine המעכבים ליזוזומלית. (ב) (שמאל) ניתוח כימות p62 המנורמל הלהקה תקטין מקביל. (ימין) שטף p62 נקבע על ידי הפחתת ערך densitometric המנורמל של p62 PBS שטופל מזו של p62 שטופל chloroquine. תוצאות מייצגים ממוצע ± SEM N = 3 עכברים. *, P <0.05, t-test. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.