השתלת עור בעובי מלאת Murine היא מודל ומבוסס ללמוד דחייה בסביבת alloimmune. כאן, אנו מספקים הדרכה של כל שלב המעורב בביצוע BALB / ג - השתלת עור> C57BL / 6 בעובי מלא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
השתלת עור בעובי מלא Murine
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת עור בעובי מלאת Murine היא מודל in vivo ומבוסס ללמוד alloimmune תגובת דחיית שתל. למרות היישום המוגבל שלה לבני אדם, השתלת עור בעכברים הועסקה נרחבת למחקר השתלה. הנוהל הוא קל ללמוד ולבצע, וזה אינו דורש טכניקות מייקרו עדינות ולא הכשרה מקיפה. יתר על כן, דחיית שתל במודל זה מתרחשת תגובה אימונולוגית מאוד לשחזור מנוטר בקלות על ידי בדיקה ישירה ומישוש. בנוסף, השתלת עור משני עם שתלים בהתאמה או צד שליש עור יכולה להתבצע על מודלי השתלה מורכבים יותר כמו שיטה חלופית ולא מסובכת להעריך סובלנות תורם ספציפי. הסיבוכים נמוכים והם בכלל מוגבלים יתר הרדמה או מצוקה נשימתית לאחר ההליך. לכישלון השתל, מצד שני, בדרך כלל מתרחשת כתוצאה הכנה לקויה של גרמיצוב ומאחור, שגוי במיטת השתל, או מיקום לא ראוי של התחבושת. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת עור בעובי מלא בעכברים ולתאר הצעדים החשובים דרושי הליך מוצלח.
מבוא
השתלת איברים היא טיפול הבחירה בחולים עם כשל איברים סופנית, ותוצאות השתפרו פלאים עם ההתקדמות ניתוחים ופרוטוקולים דיכוי חיסוני. עם זאת, דיכוי מערכת חיסוני לטווח ארוך קשור לתופעות לוואי משמעותיות, לבין ההתפתחות של אסטרטגיות חדשות המקדמות סובלנות נשארת מטרת מחקר השתלה המודרנית.
במודלים של בעלי חיים רבים פותחו למחקר בסיסי בהשתלות, כדי לחקור את המנגנונים של דחייה של השתל וכדי לבחון גישות דיכוי חיסוני למניעת דחיית שתל ו לקידום סובלנות לטווח ארוך 1-3. מודלי העכבר הפכו התווך של מחקר האימונולוגי בשל הזמינויות הבלעדיות מכריעות של נוגדני אבחון וטיפול ומוגדרים היטב זנים טהורים ו מהונדסים. השתלת עור היא הליך פשוט שאינו דורש מיומנויות microsurgical מיוחדות והוא יכולבקלות להיות במעקב אחרי הניתוח. יחדיו, השתלת עור העכבר כבר כלי יוצא דופן ללמוד היבטים רבים המעורבים בתגובה alloimmune, כולל משלוח אנטיגן, סחר התא, והרס רקמות במהלך דחיית שתל 4,5.
כאן, אנו מציגים את הצעד-אחר-צעד הליך השתלת עור בעובי מלא תוך שימוש במודל העכבר, אנו מתארים את הצעדים החשובים הכרחיים עבור engraftment מוצלח של העור המושתל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ושימוש (JHUACUC). הנהלים הספציפיים בוצעו תחת MO13M292 פרוטוקולי ACUC המאושרות MO13M370.
קציר עור תורם 1.
- להרדים את העכבר התורם עם isoflurane (מאדה אינדוקציה ב 4% אחזקה ל 1 - 2% דרך חרוט העכבר). השתמש רפלקס נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על עומק ההרדמה.
- באמצעות מכונת גילוח חשמלית, לגלח את הגב של החיה ולחטא אותו ביוד povidone 10% (למשל, בבטאדין).
- בעזרת מספרי סטריליות, כפפות, וטכניקה ספטית, עור בחזרה תורם קציר ממותן עד הצוואר, עם דיסקציה קהה ברמה של רקמת חיבור areolar.
- להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר קצירתשתל עור.
- תחת מיקרוסקופ, להפריד את רקמת חיבור, רקמת שומן, מִרפָּד carnosus מהעור בחזרה באמצעות מספרי tenotomy בסדר. Carnosus מִרפָּד הוא שריר דק, שקוף אחראי תנועות מתעוות עור.
- באמצעות טכניקה בכלים סטריליים, לגזור שתלי 15 מ"מ x 15 מ"מ מהעור בחזרה במשך 10 מ"מ 10 מ"מ x 15 מ"מ x המיטה שתל 15 מ"מ.
- אחסן את השתלים על gauzes ספוגה פוספט שנאגר המלוח סטרילית (PBS) בצלחת פטרי על קרח.
הערה: 8 - 10 שתלים ניתן להשיג עכבר תורם אחד.
השתלת 2. נמען עור
- להרדים את העכבר הנמען עם isoflurane (מאדה אינדוקציה ב 4% אחזקה ל 1 - 2% דרך חרוט העכבר). השתמש רפלקס נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על עומק ההרדמה.
- נהל 0.02 מ"ג / ק"ג BW של עצירות להקלה על הכאב לאחר הניתוח.
- לגלח את הצד של החלק האחורי של החיה שבו wi שתלll להיות מוכנס ולחטא עם יוד povidone 10%.
- בעזרת מספריים, לחתוך 10 מ"מ x 10 מ"מ עד 15 מ"מ x 15 מ"מ מרובע של העור. גודל הפגם צריך להיות מעט גדול (10%) מאשר את השתל. גזור באופן שטחי ככל האפשר. תשמור על עצמך כדי לשמר את מִרפָּד carnosus וכלי. Carnosus מִרפָּד ניתן להבחין מן fascia הבסיסית על ידי הניידות שלה ואת כלי הדם שמופעלים שטחי אליו.
- מקם את השתל על מיטת השתל, הימנעות קפלים בשולים.
- מניח 8 תפרים על הפינות על האמצע של כל קצה. עבור כל תפר, להעביר את המחט דרך השתל ולאחר מכן דרך carnosus מִרפָּד של השתל למיטה מתחת לעור הנמען שמסביב.
- הסר את מסכת ההרדמה ולתת החיה להתאושש חלקית מן ההרדמה לפני החלת פלסטר.
- עוטף את עכבר נמען תחבושת דבקה עם גזה מקופלת על השתל. הפוך את התחבושת על ידי שילוב של שתי תחבושות, חיתוךהחלק הדבק של אחד והעמיד יחד שתי רפידות סופגות.
- צג את העכבר מקרוב במהלך שחזור כדי להבטיח את התחבושת אינה הגבלת טיול חזה ונושמת. הסר את התחבושת אם קצב הנשימה פוחת או החיה מתחילה להשתנק או נשימה שטחית.
3. טיפול לאחר הניתוח
- נהל Enrofloxacin 5 מ"ג / ק"ג לאחר ניתוח טיפול מונע זיהום.
- מניח את העכבר המושתל בתוך כלוב נקי מעל כרית חימום במיקרוגל עד שהוא מתאושש לחלוטין מן ההרדמה.
- שים את העכבר עבור שעה 1 לאחר ניתוח לפני החזרת אותו למוקד הדיור.
- שבעה ימים לאחר הניתוח, להרדים את העכבר כמו בשלב 2.1. הסר את התחבושת על ידי חיתוך רק דרך צד הגחון של התחבושת.
- להתבונן למשש את השתל למחרת סימנים של scabbing, התכווצות, או קשיות. אם הווה, את השתל אולי לא נחל vasculariza הנאהtion וצריך להיחשב כשל טכני.
- צג יום סימנים של דחייה. שקול שתלי דחה כאשר ≥90% של רקמת שתל הופך נמקי.
- להרדים את החיות דחו ולקצור אותם לניתוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המיקום של התחבושת על עכבר הנמען הוא צעד חשוב של ההליך. שתל עור ממוקם על גזע הנמען, בין הכתף, הירך ועמוד השדרה (איור 1). התחבושת הוא עשה עם גזה מקופלת ושילוב של שתי תחבושות דבקות פלסטיק. עכבר הנמען מושם עם השתל למטה על הגזה על המרכז את התחבושת. שימוש בשני מלקחי מייקרו מעוקלים, בקצה התחתון של התחבושת הוא המשך ראשון, ולאחר מכן את החלק העליון של התחבושת הוא עטוף על העכבר כדי בבטן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאז השקתו ידי מךוואר, ראשון במחקרים בבני אדם ולאחר מכן בארנבות ועכברים, השתלת עור כבר מודל יסולא בפז לחקר תגובות חיסוניות אלוגנאית 6,7. בכתב היד הזה, אנו מציגים מודל של בקנה מידה גדול, הלא vascularized, השתלת עור בעובי מלא באמצעות העור הגב העליון והתחתון. שיטות חלופיות שונות, לרבות באמצעות עור הזנב או עור אוזן של העכבר כמקור רקמות השתל, דווחו עד היום 8,9. מודלים אלה מרחיבים את היתרון הברור של פשטות טכנית ולאפשר העברת נתונים גבוהים כרכים. המחסור היחסי של תאי א...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק R01AI077610.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ישר מיקרו מלקחיים | Sigma | F4017 | |
| מיקרו מלקחיים מעוקלים | Aesculap | BD333R | |
| מספריים מעוקלים סטיבנס טנוטומיה | Aesculap | BC905R | |
| מאיו מספריים לניתוח | Sigma | S3146 | |
| מחזיק מחט מיקרו | Aesculap | BM563R | |
| גזה סטרילית | Covidien | ||
| 6-0 תפר ניילון | MWI | 31849 | |
| רצועות פלסטיק להקה- סיוע | לג'ונסון & ג'ונסון | שהושג מבית מרקחת | |
| צלחת פטרי 10 ס"מ | פישרברנד | FB0875712 | |
| PBS | איכות ביולוגית | 119069131 | |
| בופרנורפין | מספר DEA נדרש; מושג מבית המרקחת של בית החולים | ||
| Enrofloxacin | Bayer Health Care | 186599 |
מקורות
- Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse. J Vis Exp. , (2016).
- Oh, B., et al. A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice. J Vis Exp. , (2016).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , e50753(2014).
- Jones, T. R., Shirasugi, N., Adams, A. B., Pearson, T. C., Larsen, C. P. Intravital microscopy identifies selectins that regulate T cell traffic into allografts. J Clin Invest. 112, 1714-1723 (2003).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17, 744-749 (2011).
- Medawar, P. B. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits: A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. J Anat. 78, 176-199 (1944).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B., Sparrow, E. M. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. I. The survival times of skin homografts exchanged between members of different inbred strains of mice. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 143, 43-58 (1954).
- Garrod, K. R., Cahalan, M. D. Murine skin transplantation. J Vis Exp. , (2008).
- Schmaler, M., Broggi, M. A., Rossi, S. W. Transplantation of tail skin to study allogeneic CD4 T cell responses in mice. J Vis Exp. , e51724(2014).
- Bergstresser, P. R., Toews, G. B., Gilliam, J. N., Streilein, J. W. Unusual numbers and distribution of Langerhans cells in skin with unique immunologic properties. J Invest Dermatol. 74, 312-314 (1980).
- Chen, H. D., Silvers, W. K. Influence of Langerhans cells on the survival of H-Y incompatible skin grafts in rats. J Invest Dermatol. 81, 20-23 (1983).
- Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a015495(2013).
- Mayumi, H., Nomoto, K., Good, R. A. A surgical technique for experimental free skin grafting in mice. Jpn J Surg. 18, 548-557 (1988).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, (2009).
- Lee, C. F., et al. Preventing Allograft Rejection by Targeting Immune Metabolism. Cell reports. 13, 760-770 (2015).
- Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol. 14, 435-446 (2014).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342, 1242454(2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
