מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

Summary

שבב מיקרופלואידי יוצר כדי לייצר זוגות של נקודות זהב ליצירת בועות טנדם ואיים מצופים פיברונקטין לדפוס תא בודד בקרבת מקום. שדה הזרימה שנוצר התאפיין במהירות תמונת חלקיקים ושימש לחקר השפעות ביולוגיות שונות, כולל נקבוביות קרום התא, עיוות ממברנה ותגובת סידן תוך תאית.

Abstract

בכתב היד הזה, אנחנו ראשונים מתארים את פרוטוקול הייצור של שבב microfluidic, עם נקודות זהב ואזורים מצופים פיברונקטין על מצע הזכוכית אותו, כי בדיוק שולט הדור של בועות טנדם תאים בודדים בדוגמת סמוכה עם במקומות מוגדרים היטב צורות. לאחר מכן, אנו מדגימים את הדור של בועות טנדם באמצעות שני לייזרים פעמו ומאיר זוג נקודות זהב עם שהייה כמה המיקרו. אנו לדמיין את אינטראקצית בועת הבועה והיווצרות סילון ידי הדמיה מהירה ולאפיין את שדה הזרימה כתוצאה באמצעות velocimetry תמונת חלקיקים (PIV). לבסוף, אנו מציגים כמה יישומים של הטכניקה הזו לניתוח תא בודד, כולל poration קרום תא עם ספיגת מקרומולקולה, דפורמציה קרום המקומי שקבעה ההתקות של חרוזי integrin המחייב מצורפים, ותגובת סידן תאיים הדמית ratiometric. התוצאות שלנו מראות כי תזרים טיסות הללו מהיר כיוונית הוא פרוduced ידי אינטראקצית בועת טנדם, אשר יכול להטיל מאמץ גזירה מקומית מאוד על פני השטח של תאים גדלים בסמיכות. יתר על כן, יכול להיגרם bioeffects שונים על ידי שינוי עוצמת הזרם הטיסות הללו על ידי התאמת המרחק תיקו מהתא אל בועות טנדם.

Introduction

יש הכרה גוברת כי ההטרוגניות הסלולר, הנובעים ביטוי סטוכסטיים של גנים, חלבונים, מטבוליטים, קיימת בתוך אוכלוסיית תאים גדולה ומשמשות כעיקרון יסוד בביולוגיה כדי לאפשר הסתגלות תא אבולוצית ^1. לכן, הוא לעתים קרובות לא מדויק ולא אמין להשתמש מדידות בתפזורת מבוססת אוכלוסייה להבין את תפקידם של תאים בודדים ואת האינטראקציות ביניהם. פיתוח טכנולוגיות חדשות לניתוח-תא בודד ולכן הוא בעל עניין רב במחקר ביולוגי תרופתי, והוא יכול לשמש, למשל, להבין את מסלולי איתות מפתח טוב יותר תהליכים בביולוגיה תא גזע וסרטן טיפול ^2-4. בשנים האחרונות, את הופעתה של פלטפורמות microfluidic יש להקל מאוד ניתוח תא בודד, שבו המיצוב, טיפול, והתצפית על תגובת תאים בודדים בוצעו עם אסטרטגיות האנליטי חדישות ^5.

Cavitation ממלא תפקיד חשוב במגוון רחב של יישומים ביו, כולל לטיפול בסרטן על ידי-ממוקד בעוצמה גבוהה אולטרסאונד (HIFU) ^6, הפיצול לא פולשנית של אבנים בכליות על ידי lithotripsy גל הלם (SWL) ^7, משלוח סמים או גנים על ידי sonoporation ^8, והרס דיווחה לאחרונה של תאים או רקמות ידי ^9,10 cavitation בועה הידרודינמית. למרות זאת, התהליכים הדינמיים של בועת cavitation (ים) אינטראקציות עם רקמות ביולוגיות ותאים לא הובנו היטב. זאת בשל אקראית בדינמיקת ייזום בועת cavitation המיוצרת על ידי אולטרסאונד, גלי הלם, ואת לחץ הידראולי מקומי; יתר על כן, קיים חוסר המאפשר טכניקות לפתרון תגובות מורכבות ומהירות מיסודו של תאים ביולוגיים, במיוחד ברמת התא הבודד.

בגלל האתגרים הללו, אין זה מפתיע כי מחקרים מעטים יש דבורהn דיווח לחקור אינטראקציות תאי בועה בתנאים ניסיוניים מבוקרים היטב. לדוגמא, poration הממברנה של תאים בודדים לכודי השעית ¹¹ ואת העיוות הגדולה אימפולסיבית של תאי דם אדומים אדם ¹² הודגמה באמצעות בועות יחידות שנוצר ליזר בערוצי microfluidic. הטכניקה השנייה, לעומת זאת, יכולה לייצר רק עיוות קטנה מאוד בתאים איקריוטיים בגלל הנוכחות של הגרעין ^13. יתר על כן, קשה לפקח bioeffects במורד הזרם כאשר מטפלים התאים בתרחיף. במחקרים אחרים, עירור אולטרסאונד של microbubble כלוא (או חומר ניגוד אולטרסאונד) להפקת poration קרום ו / או תשובות סידן תאי בתאי חסיד יחידים דווח ^8. Poration ממברנה של תאים חסידים יחידים יכול גם להיות מיוצר באמצעות בועות טנדם שנוצר ליזר בשכבת נוזל דקה המכיל פתרון הכחול Trypan קליטת אור ^14, אועל ידי בועת גז נדנוד שנוצרה על ידי פעימות ליזר המיקרו irradiating דרך מצע סופג אופטי ב microchambers ^15. כשמשווה, המצע הקליט האופטי יש יתרון על פני הפתרון הכחול הליזר סופג Trypan משום שהאחרון הוא רעיל לתאים. יתרה מכך, בועות שנוצרו ליזר יותר לשליטה מבחינת גודל בועה ומיקום מ בועות נרגשות מבחינה אקוסטית. אף על פי כן, בכל המחקרים הקודמים הללו, תא הצורה, הנטייה, ותנאי ההידבקות לא נשלטו, אשר עשויים להשפיע באופן משמעותי את תגובת תא bioeffects המיוצר על ידי מכני מדגיש ^16.

כדי להתגבר על חסרונות אלה במחקרים קודמים, פתחנו לאחרונה מערכת ניסיונית עבור דור בועה, דפוסי תא, אינטראקציות בועת בועת תאים, ו- bioassays בזמן אמת של תגובת תא שבב microfluidic נבנה באמצעות שילוב ייחודי של techn microfabricationiques. שלושה מאפיינים עיקריים להבחין המערכת הניסיונית שלנו מאחרים בתחום הם: 1) הדפוסים של נקודות זהב בגודל מיקרון על מצע הזכוכית כדי לאפשר קליטת ליזר מקומית לייצור בועה ^17; 2) דפוסים של איים בגודל מיקרון של תאי מטריקס (ECM) עבור הידבקות התא על פני המצע אותו לשלוט הן את המיקום ואת הגיאומטריה של תאים בודדים; ו -3) דחיסה של הממד של תחום האינטראקציה בועות תאים בועה מ 3D למרחב מעין-2D כדי להקל ב-המטוס להדמיה של אינטראקציות בועה בועה, jetting שדות זרימה, עיוות התא, bioeffects, כל שנתפסו אחד רצף הדמיה יעיל (איור 1D).

איור 1: השבב ו שרטוטי microfluidic של מבחנים שונים. א) שבב microfluidic התאסף עם ערוצים מלא דיו כחול לשם ויזואליזציה. ב) באזור בתוך השבב microfluidic עם תאים בדוגמת נקודות זהב (המרחק בין שתי נקודות זהב בסמיכות הוא 40 מיקרומטר). זוגות רבים של יחידות עבודה ניתן לארגן בתוך ערוץ. ג) תמונה מקרוב של יחידת עבודה, מורכב של זוג נקודות זהב ו תא הלה דבק באזור תא-הדפוסים. ד) סכמטי של פעולת המכשיר. תא בודד דבק ומתפשט על האי "H" -shaped מצופה פיברונקטין. זוג בועות cavitation (בועת טנדם) עם תנודה אנטי שלב מיוצר על-ידי הארת קרן ליזר פעמה על נקודות הזהב (ראה תרשים 4 א), שמובילה את הדור של מטוס מהיר מקומי נע לכיוון תא המטרה סמוך. התא עלול להיות מעווה, porated לספיגת macromolecular, ו / או מגורה עם תגובת סידן, בהתאם למרחק התיקו _(ד S) של התא לבועה טנדם.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פלטפורמה זו ניתן לשלב נוסף עם מבחני קרינה וחרוזים פונקציונליים המחוברים אל פני השטח של תא bioeffects נגרמת cavitation. בפרט, פלטפורמה זו סוללת את הדרך עבור מבחני אמין וכמותיים ברמת התא הבודד. עד עכשיו, יש לנו השתמשתי במכשיר לניתוח דפורמציה קרום תא הנגרמת בועת טנדם, poration תא ספיג תאי, כדאיות, אפופטוזיס, ותגובת סידן תוך תאים. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את תהליך ייצור שבבי ההליך לניתוח bioeffects השונה המוזכר לעיל. יתר על כן, הפעילות של השבב גם מתוארת.

Protocol

1. microfabrication

הערה: כל נהלי microfabrication מבוצעים חדר נקי. מסכת כרום נועדה לפני microfabrication, רואה איור 2.

איור 2: סכמטי של עיצוב ערוץ השבב microfluidic ואת הממדים של יחידות עבודה. א) עיצוב מסכה של microchannels PDMS מזדהה (הירוק) לבין הדפוסים על מצע הזכוכית (כחול ואדום). ב) תמונה המוגדלת של עיצוב מסכת קטע מייצג של המערכים יחידי עבודה. ג) סכמטי של יחידה אחת עבודה מראה דפוס תא (כחול) וזוג נקודות זהב (אדום). כל סולמות אורך מוצגים בצד ימין למטה. אנא לחץ כאן כדי להציג את העדפתהגרסת ger של נתון זה.

1. דפוסי נקודת זהב
   הערה: שטח כל נקודת זהב נועדה להיות בתוך 25-30 מיקרומטר ^2, כך שהוא גדול מספיק כדי לספוג אנרגית ליזר לייצור בועה, אך קטן מספיק כדי למנוע תאים בודדים שדבקו בו. תרשים סכמטי עבור ייצור נקודת זהב מוצג באיור 3 א.
   1. שקופיות זכוכית ניקוי (במנדף כימי)
      1. לשטוף את השקופית זכוכית עם אצטון ואחריו אלכוהול איזופרופיל (IPA), ולאחר מכן לייבש אותו עם זרם N _2.
      2. משרים את השקופית בתמיסה פיראניה (H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ = 4: 1) במשך 10 דקות.
      3. קח את השקופית, לשטוף אותו עם מים די, ולאחר מכן לייבש אותו עם זרם N _2.
      4. אופה את שקופיות זכוכית על פלטה חמה ב 120 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
      5. פנקו את השקופית asher הפלזמה 100 וואט במשך 90 s.
   2. ספין-ציפוי (ספין-ציפוי מכסה מנוע)
      1. הפעל על פלטה חמה ולהמתין עד לטמפרטורה יציבה על 95 מעלות צלזיוס.
      2. בצע את הליך הציפוי:
         סל"ד 1,000 עבור 5 ימים עם רמפת 500 סל"ד / s;
         אז 3,000 סל"ד למשך 30 שניות עם רמפה 1,000 סל"ד / s.
      3. תקן את שקופיות זכוכית לנקות על coater הספין ידי החלת ואקום.
      4. מכסה את פני שטח שקופיות עם P-20 ולהתחיל את מתכון הציפוי.
      5. חזור על תהליך ציפוי עבור photoresist שלילית-NFR.
      6. אופים את השקופיות על 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות ולחכות עד שהוא מתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. פוטו-ליתוגרפיה
      1. הר מסכת הכרום על aligner המסכה ולוודא שצד הדפוס פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה.
      2. הגדר את המתכון photolithography למצב חשיפה קשה עם 9 s החשיפה ל- UV ובמהירות ליישר את מצע זכוכית עם מסכה.
      3. לאחר ביצוע חשיפת UV, לאפות את השקופיות ב 956; צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
   4. התפתחות
      1. לפתח את הדפוס בשקופית בתמיסת מפתח עבור 60 s.
      2. להסיר את השקופית מן היזם, לשטוף אותו במים DI, ולייבש אותו עם זרם N _2.
      3. בדוק את גיאומטרית הדפוס תחת מיקרוסקופ, ולמדוד ולהקליט את גודל התכונה.
   5. בתצהיר זהב (אידוי קורה E) ולהרים פעמי
      1. אופים את השקופיות על 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
      2. נקו את השקופית עם פלזמה בתחריט יון תגובתי המכונה (ורי) למשך 90 שניות ב -500 Torr ו 100 W.
      3. ננומטר הפקדה 5 של Ti ו -15 ננומטר של Au לשקופית באמצעות המאייד E-קרן ^17.
      4. משרים את השקופיות לילה בכוס זכוכית המכיל מסיר photoresist ממס להסיר את מנוחתם זהב על גבי NFR להתנגד.
      5. אחזר את השקופית, אני סומקt עם אצטון ואחריו IPA, ולייבש אותו עם זרם N _2.
      6. יבש את השקופית על צלחת חמה ב 115 מעלות צלזיוס לפני ניקויו של asher פלזמה חמצן ב -100 W עבור 90 s.
2. דפוסים מולקולרי הרכבה ידי המראה (MAPL)
   הערה: שטח כל האי פיברונקטין המצופה מוגדר להיות בתוך 700-900 מיקרומטר ² כדי להקל תא הלה נאות מתפשט באזור כיכר תוך מזעור הסיכוי מספר תאי צבירה באי. תרשים סכמטי לעריכת איי דפוסי תא מוצג איור 3B.
   1. ציפוי ספין
      1. חזור על שלב 1.1.2, אבל להשתמש photoresist S1813-חיובי בטמפרטורה של 115 מעלות צלזיוס.
   2. photolithography מיושר
      1. הר מסכת הכרום על aligner המסכה ולוודא שהצד עם הדפוס פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה עםנקודות זהב.
      2. הגדר את המתכון photolithography למצב חשיפה קשה עם 9 s החשיפה ל- UV.
      3. יישר את המסכה העליונה עם השקופיות התחתונות באמצעות סימני יישור, ממוקמים מסביב לקצה של המסכה, כהתייחסות מרחבית.
      4. בדוק את החלק המרכזי של המסכה ולוודא כי תכונות הדפוס מיושרות כהלכה.
      5. השלם את החשיפה לקרינת UV ללא לאפות פוסט.
   3. התפתחות
      1. חזור על שלב 1.1.3 אבל עם 45 שניות של פיתוח לפני ייבוש על פלטה חמה ושימור באחסון ₂ N.
3. טיפול כימי
   1. הכן את הפתרון passivating: 0.5 מ"ג / מ"ל ​​PLL-ז-PEG ב 10 חיץ HEPES מ"מ.
   2. תחזר את השקופית מאחסון N ₂ ולנקות אותו באמצעות ורי עם הגדרת הפרמטר: 500-Torr לחץ, כוח 100-W, ו 90-s משך.
   3. אחד פיפטה טיפת passivating פתרון על חתיכת סרט פרפין.
   4. סנדוויץ הפתרון עם הסרט ואת השקופיות, מוודא שהצד עם דפוס התכונות פונה כלפי מטה לכיוון הסרט; למנוע היווצרות של בועות.
   5. חכו 45 דקות לפני הסרת שקופיות מהסרט.
   6. משרים את השקופיות ברצף במסיר photoresist, מסיר photoresist ומים DI (1: 1), ומים DI, להתסיס אותו באמבט אולטרסאונד עבור 90 s לכל לספוג.
   7. יבש את השקופית על פלטה חמה כדי להסיר את הלחות לפני שהוא סגר אותו בתוך תא ייבוש ואחסון אותו במקרר.
4. צ'יפ הרכבה
   1. חזור על שלבי 1.1.1-1.1.4, אבל עם photoresist SU8-2025 השלילי ואת הגדרת הפרמטר מצוינת שנקרא פרוטוקול Microchem ^18, להכין תבנית סיליקון עם photomask.
   2. לפברק microchannel PDMS (40 מ"מ x 25 מ"מ x 5 מ"מ, גובה X אורך x רוחב), פרוסת PDMS קטנה (800 מבנה חריץ מיקרומטר רחב) באמצעות ליתוגרפיה רך.
   3. אגרוף microchannel עבור יציאות גישה נוזלות ונקי אותו בנייר ואז עם IPA.
   4. מגן באזור בדוגמת של מצע זכוכית עם לוח PDMS, ולהחיל ורי (100 W, 500 mTorr, 60 שניות) כדי להסיר PLL-ז-PEG מאזור הפריפריה.
   5. פנקו את microchannel עם מינון מופחת של ורי (25 W, 500 mTorr, 25 שניות), ולאחר מכן יישר אותו מצע זכוכית בדוגמת (עם לוח PDMS קטן הסיר); להביא את microchannel ואת מצע זכוכית בדוגמת במגע קונפורמי תחת stereoscope.

איור 3: דיאגרמות סכמטי להרכבת microfabrication שבב. א) תבנית של נקודות זהב על מצע זכוכית. ב) הכנת מצע הזכוכית עבור דפוסי תא באמצעות MAPL. ג) האסיפה של ערוץ microfluidic עם מליטה פלזמה. עיין ברשימת חומרי ההגדרות of את הקיצורים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. מצורף נייד
   הערה: תאים הלה נשמרות באופן שגרתי DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% / אנטיביוטיקה פתרון antimitotic בתוך תרבית תאים חממה. תרשים סכמטי עבור מצורף שבב הרכבת תא מוצג איור 3c.
   1. ראש השבב עם PBS למשך 30 דקות ב 1 μL / דקה, ולאחר מכן להשרות פתרון פיברונקטין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​PBS, 1 μL / min) במשך 45 דקות.
   2. בזמן ההמתנה, trypsinize תרבית תאים עם 0.25% טריפסין- EDTA, לשטוף אותם במדיום תרבות, תאים בודדים צנטריפוגות, ולגבש מחדש את ההשעיה תא מחומם מראש (37 ° C) בינוני התרבות ב 5x10 ⁶ תאים / מ"ל.
   3. החלף את הפתרון פיברונקטין עם PBS ולשטוף את השבב ב -10 μL / דקה 5 דקות.
   4. לְהַזרִיקהשעית התא המוכנה לתוך השבב, לעצור את הזרם, מהדקת את לשקע, ולשמור על השבב בתוך תרבית תאי חממה למשך 30 דקות.
   5. שחרר את לשקע ולשטוף את השבב עם תרבית תאים בינוניים ב 10 μL / דקה 5 דקות. הפחת את קצב הזרימה זלוף של המדיום תרבות ל -0.75 μL / min ולשמור על תרבית תאים עבור 2 שעות בחממה.

2. דור בועה ויזואליזציה הזרימה

הערה: סכמטי של הגדרת הניסוי מוצג באיור 4 א עבור דור בועת טנדם ואינטראקצית הזרימה כתוצאה עם תא בודד גדל סמוך ערוץ microfluidic.

1. הדור של טנדם בועות עם שני לייזרים ושליטה העיתוי
   1. מניחים את שבב microfluidic על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה וליישר מוקדים של שני פעמו Nd: YAG לייזר (λ = 532 ננומטר, משך הדופק 5-NS) על זוג נקודות זהב בדוגמת ב מופרדיםy 40 מיקרומטר.
   2. השתמש גנרטור עיכוב דיגיטלי להפעיל שני לייזרים עם השהיה על 2.5 מיקרו-שניות לייצר שתי בועות יזם על נקודות זהב.
   3. התאם את האנרגיה פלט ליזר (~ 10 μJ) לייצר קוטר מרבי של הבועות בתוך 50 ± 2 מיקרומטר.
   4. סנכרון מצלמה במהירות גבוהה (חשיפת 200-NS ו -2 מיליון פריימים לשנייה (fps)) אל הלייזרים ללכוד את הדינמיקה של התפשטות בועה, התמוטטות, אינטראקצית בועת בועה, והיווצרות סילון.
2. כימות של מהירות סילון
   1. להקליט את המיקום של קצה הסילון (J ₁₎ בסוף הפרוקסימלי של הבועה הראשונה (B _1), ואת הקצה הדיסטלי של B _1, החל מ הדור של בועת השני (B ₂₎ וכלה את הנחיתה של J ₁ לקראת סוף דיסטלי של B _1; לראות את סכמטית ציור 5a.
   2. באופן ליניארי להתאים את מהלך הזמן של מיקום עבור בוטh הפרוקסימלי (טיפ סילון) ואת הקצוות דיסטלי. חשב את השיפוע של עמדת קצה לעומת עקומת זמן לסוף הפרוקסימלי כדי לקבוע את מהירות סילון. הצטלבות שני הקווים מציינת את זמן נחיתת מטוס. ניתן למצוא פרטים נוספים הפניה 19.
3. ויזואליזציה של שדה זרימת טנדם הנגרמת בועה
   1. כן 1 מיקרומטר קלקר השעיה חרוזה (PS) במי DI (2.6% w / v) ולהזריק את החרוזים לתוך שבב microfluidic.
   2. צור בועות טנדם כמתואר בשלב 2.1.1-2.1.3.
   3. רשום את דינמיקת בועת טנדם באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה בשיעור מסגור של 5 M fps עם זמן חשיפה של 100 ננו-שניות.
   4. העלה את התמונה ברצף רכש לתוך תוכנת PIV מסחרית.
   5. מחלקים כל תמונה לתוך חלונות חקירה קטנים של 16 x 16 פיקסלים (px) עם חפיפה של 75%.
   6. החל איטרציה מרובה עוברים ומסננים אזוריים להפחית את טעויות חישוב שדה מהיר, ופלט תוצאות מפת וקטור מהירות.

איור 4: סכמטי של הגדרת הניסוי והקלטת תמונה. א) התקנה ניסיונית עבור דור בועת טנדם. ב) רצף זמן לשמש עבור סוגים שונים של רכישות הדמיה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי, BF: FL שדה בהיר, IFT: זמן interframe. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח 3. תאים בודדים Bioeffects

הערה: בועת טנדם מיוצרת ליד תאי היעד, ואת bioeffects כתוצאה נלמד באופן מרחק תלויות תיקו. רצף הזמן עבור סוגים שונים של רכישות תמונה מתואר איור 4 ב.

1. Poration ממברנה ספיגת macromolecular
   הערה: הספיגה של מולקולות תאיות לתוך תא המטרה מתאפיינת דיפוזיה המתקדמת של יודיד propidium קרום impermeant (PI) דרך אתר poration על קרום התא.
   1. בעקבות צעד 1.5, להחליף את המדיום תרבות קבוע (כלומר, DMEM) עם פתרון PI (100 מיקרוגרם / מ"ל DMEM) פועל בקצב זרימה זלוף של 0.5 μL / דקה לאורך הניסוי.
   2. לתכנת את תוכנת בקרת מיקרוסקופ כדי לבחור את קוביית PI הניאון אוטומטי על הצריח מסתובב לתזמן את הזמנים של מצלמת CCD עם עירור קרינת PI ללכוד תמונות קרינה עם זמן חשיפה של 200 ms.
   3. לאחר שני מוקדי הליזר מיושרים זוג נקודות זהב ליד תא המטרה, שיא הוא בתחום בהיר (BF) ו פלואורסצנטי (פל) תמונות לפני טיפול בועת טנדם.
   4. השתמש בתוכנת שליטה מיקרוסקופ מידלהתחיל הקלטת תמונת קרינת הזמן לשגות של תא המטרה זמן קצר לאחר צעד 2.1 כדי ללכוד את ההיסטוריה של ספיגת PI.
2. עיוות ממברנה
   1. כן חרוזים 1 מיקרומטר (1% w / v, מופעל עם carbodiimide מסיס במים) ו functionalize אותם עם-2000 פפטיד (100 מיקרוגרם / מיליליטר PBS).
   2. בעקבות צעד 1.5, דגירת התאים המצורפים עם החרוזים הפונקציונליים בצפיפות של 1x10 ⁹ חרוזים / מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   3. חזור על שלב 2.1 לייצר בועות טנדם ליד תא המטרה ולהקליט את העיוות תא עם מצלמת אולטרה-גבוהה מהירות הריצה בקצב מסגור של 5 מיליון fps.
   4. זהה את השלישיה של 3 חרוזים שנותרו במישור הדמיה לאורך הניסוי ולעבד עמדותיהם כמו (x _1, y ₁₎ (x _2, y ₂₎ ו- (x _3, y ₃₎ בניסוי קואורדינטות.
   5. לחשב את השטח של השלישיה לפני after טיפול בועת טנדם באמצעות הנוסחא:
      
   6. חשב את המתח באזור כמו:
      
   7. בהתבסס על הקואורדינטות של השלושה קודקודים לפני ואחרי טיפול בועת טנדם, לחשב את המתח לכאבה המקומי העיקרי בא פרוטוקולים הוקמו ^20,21.
3. כדאיות אפופטוזיס
   הערה: FITC Annexin V תוויות בתאים, כולל אלה אפופטוטיים, דרך ההחצנה של phosphatidylserine (פלואורסצנטי ירוק). PI תוויות הגרעינים של תאי נימקים (אדום פלואורסצנטי). הדמיה שדה מוארת משמש לתעד מורפולוגיה תאים כדי לסייע בזיהוי של כדאיות התא אפופטוזיס.
   1. רשום את המיקום של כל תא מטופל הערוץ microfluidic (בהנחייתם של תוויות כתובת בערוץ, ראה איור 2b
   2. דגירה בתאים שטופלו במדיום תרבית תאים עבור 2 שעות אחרות לפני מרוססת השבב עם פתרון FITC Annexin V במשך 15 דקות. תאים חיוביים להציג פלואורסצנטי ירוק.
   3. חזור על שלב 3.3.2 24 שעות לאחר טיפול בועת טנדם ללמוד את bioeffects לטווח ארוך התאים הממוקדים.
4. בתגובה סידן
   1. מערבבים 3 μL של פתרון פורעה-2 לפני הצהריים המניה (1 מ"ג / מ"ל ​​ב DMSO) עם 3 μL של 10% w / v Pluronic F-127 ב 500 μL של מדיום סרום מופחת להכין את הפתרון תיוג הסופי (6 מיקרומטר).
   2. בעקבות צעד 1.5, להחליף את תרבית תאים בינוניים עם הפתרון תיוג דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 40 דקות (1 שיעור זלוף μL / min).
   3. מלא את הערוץ עם מדיום הסרום המופחת (0.75 שיעור זלוף μL / min) לפני תחילת ניסוי התא.
   4. התחל הדמיה ratiometric (אורך גל: 340/380 ננומטר, 50-ms חשיפה)של תא המטרה באמצעות מערכת PTI המסחרית.
   5. לאחר 10 שניות של הדמית ratiometric של התא ברמה מנוחה, לייצר בועות טנדם כמו בשלב 2.1; תקליט ראשון עם זמן interframe (IFT) של 0.1 s דקות 1, ולאחר מכן להגדיל את IFT עד 1 s עבור דקות אחרות, עלייה נוספת עד 5 שניות לאחר 2 דקות.
   6. השתמש בתוכנת PTI לחשב את יחס R = F340 / F380 באזור של עניין (ROI), אשר עומד ביחס לריכוז סידן תוך תאי.

Results

פלטפורמת microfluidic המתוארת בעבודה זו יכולה לשמש כדי לחקור אינטראקציות בועת בועה וכדי לנתח מגוון של bioeffects נגרמת cavitation ברמת התא הבודד. כאן, אנו מציגים מספר דוגמאות להפגין מגוון של מחקרים ניסויים ו- bioassays שניתן לבצע במערכת הניסוי שלנו. נדגים את האינטראקציות החולפות ראשון של בועות בד בבד עם היווצרות הסילון, ההדמיה של שדה הזרימה כתוצאה, ואת חישוב מהירות סילון (איור 5 א). אנו דוגמאות אז נוכחיות של טנדם בועה הנגרמת דפורמצ...

Discussion

ניתוח מתא בודד, בשילוב עם הדמיה לחיות תאים, שיפרה מאוד את הבנתנו של תהליכים דינמיים ולעיתים קרובות משתנה בתאים בודדים, כגון פיתוח פנוטיפ התגובה החיסונית ^23. בניגוד תרבית התא הקונבנציונלי במנות או צלוחיות, מערכות microfluidic לאפשר שליטה מדויקת של microenvironment, עד לרמת התא הבודד, בזמן אמת. כתוצאה מכך, התפתחות טכנולוגית microfluidic וטכניקות בעיקר שפרו את התפוקה ואת השחזור של ניתוח תא בודד. על ידי שילוב דפוסים ליתוגרפיה משטח רכים, מערכות microfluidic יכולות להיות מתוכ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>מגיב / חומרים< / חזק>
75 מ"מ x 38 מ"מ שקופיות מיקרוסקופ רגיל	קורנינג	2947-75X38
אצטון	סיגמא אולדריץ', ושות'	320110	מגיב ACS, ≥ 99.5%
אלכוהול איזופרופיל	סיגמא אולדריץ', ושות'	W292907	≥ 99.7%, FCC,
חומצה גופרתית	סיגמא אולדריץ', ושות'.	320501	מגיב ACS, 95.0-98.0%
מי חמצן	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 wt.% ב-H2O
פריימר P-20	Microchem	MCC פריימר 80/20
NFR Photoresist	JSR	NFR016D2
Photomask	Photomask	N /A	4x4 מסכת כתיבה ישירה
MF-319 מפתח	שיפלי (רוהם והאס)	Microposit MF-319
1165 Photoresist Remover	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-מתיל-2-פירולידינון מבוסס
S1813 פוטו-רזיסט	שיפלי (רוהם והאס)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
סרט פרפין	HACH	251764
SU-2025 Photoresist	Microchem	SU-2025
PDMS	דאו קורנינג	184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג
צינורות מיקרובור	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
פיני מתכת	צינור קטן ניו אינגלנד	NE-1300-01	צינור חתוך (ישר), 0.025 אינץ' קוטר חיצוני x 0.017 אינץ' מזהה x 0.50 אינץ' תאי HeLa ארוכים
	מתקן תרבית תאי דיוק	(307-CCL-2) HeLa, עמ '148
מאגר DPBS (1x) ThermoFisher	Scientific	14190144
מדיום תרבית DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
חלבון בקר פיברונקטין, פלזמה	ThermoFisher Scientific	33010018
0.25% טריפסין-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P21493
Carboxylate Microspheres 1.00  μ מ	Polysciences, Inc	08226-15
קרבוקסילט מיקרוספירות 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (1-אתיל-3-(3-דימתילאמינפרופיל)קרבודימיד הידרוכלוריד)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Annexin V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 ומיקרו; m מסונן (תמיסה של 10% במים)
מדיית סרום מופחתת	ThermoFisher Scientific	11058021
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O2 / אפר פלזמה של פוטו-רזיסט וחומרים אורגניים אחרים
יישור מסכה	SUSS MicroTec	קארל סוס MA6/BA6
מאייד קרן אלקטרונית	CHA Industries CHA	Industries פתרון תעשיות E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(תחמוצת / ניטריד / פולימר) תחריט
סטריאוסקופ	AmScope	אמריקאי SM-4TZ-FRL	סטריאו מיקרוסקופ
משאבת מזרק	Chemyx Inc	NanoJet
חממת תרבית תאים	NuAire	AutoFlow NU-8500 מעיל מים CO2 incubator
ארונות בטיחות ביולוגיים	NuAire	NU-425-400
אמבט מים	VWR	1122s
	IEC	Centra CL2
מיקרוסקופ	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG לייזר  (לייזר 1)	חדש מחקר	סערה
Nd:YAG לייזר  (לייזר 2)	מחקר גלים חדשים	עיכוב אוריון
	ברקלי נוקלאוניקס	BNC 565-8c
	Dyna-Lite	ML1000 מצלמת פלאש
	DRS Hadland	Imacon 200
במהירות גבוהה  מצלמה	Shimadzu	HPV-X
מצלמה במהירות גבוהה	Vision Research	Phantom V7.3
PIV תוכנה	LaVision	DaVis 7.2
מצלמה	Zeiss	AxioCam MRc 5
תוכנה	Zeiss	AxioVision
PTI מערכת	Horiba	S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio תוכנה	Horiba	Easy Ratio Pro 2	גרסה 2.3.125.86
63 פעמים; המטרה	Zeiss	LD תוכנית Neofluar