Method Article

מערכת Microfluidic עם דפוסי Surface לחקירת בועת Cavitation (ים) אינטראקציה דו תא ואת Bioeffects הנובע מהן ברמת התא הבודד

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבב מיקרופלואידי יוצר כדי לייצר זוגות של נקודות זהב ליצירת בועות טנדם ואיים מצופים פיברונקטין לדפוס תא בודד בקרבת מקום. שדה הזרימה שנוצר התאפיין במהירות תמונת חלקיקים ושימש לחקר השפעות ביולוגיות שונות, כולל נקבוביות קרום התא, עיוות ממברנה ותגובת סידן תוך תאית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב היד הזה, אנחנו ראשונים מתארים את פרוטוקול הייצור של שבב microfluidic, עם נקודות זהב ואזורים מצופים פיברונקטין על מצע הזכוכית אותו, כי בדיוק שולט הדור של בועות טנדם תאים בודדים בדוגמת סמוכה עם במקומות מוגדרים היטב צורות. לאחר מכן, אנו מדגימים את הדור של בועות טנדם באמצעות שני לייזרים פעמו ומאיר זוג נקודות זהב עם שהייה כמה המיקרו. אנו לדמיין את אינטראקצית בועת הבועה והיווצרות סילון ידי הדמיה מהירה ולאפיין את שדה הזרימה כתוצאה באמצעות velocimetry תמונת חלקיקים (PIV). לבסוף, אנו מציגים כמה יישומים של הטכניקה הזו לניתוח תא בודד, כולל poration קרום תא עם ספיגת מקרומולקולה, דפורמציה קרום המקומי שקבעה ההתקות של חרוזי integrin המחייב מצורפים, ותגובת סידן תאיים הדמית ratiometric. התוצאות שלנו מראות כי תזרים טיסות הללו מהיר כיוונית הוא פרוduced ידי אינטראקצית בועת טנדם, אשר יכול להטיל מאמץ גזירה מקומית מאוד על פני השטח של תאים גדלים בסמיכות. יתר על כן, יכול להיגרם bioeffects שונים על ידי שינוי עוצמת הזרם הטיסות הללו על ידי התאמת המרחק תיקו מהתא אל בועות טנדם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש הכרה גוברת כי ההטרוגניות הסלולר, הנובעים ביטוי סטוכסטיים של גנים, חלבונים, מטבוליטים, קיימת בתוך אוכלוסיית תאים גדולה ומשמשות כעיקרון יסוד בביולוגיה כדי לאפשר הסתגלות תא אבולוצית 1. לכן, הוא לעתים קרובות לא מדויק ולא אמין להשתמש מדידות בתפזורת מבוססת אוכלוסייה להבין את תפקידם של תאים בודדים ואת האינטראקציות ביניהם. פיתוח טכנולוגיות חדשות לניתוח-תא בודד ולכן הוא בעל עניין רב במחקר ביולוגי תרופתי, והוא יכול לשמש, למשל, להבין את מסלולי איתות מפתח טוב יותר תהליכים בביולוגיה תא גזע וסרטן טיפול 2-4. בשנים האחרונות, את הופעתה של פלטפורמות microfluidic יש להקל מאוד ניתוח תא בודד, שבו המיצוב, טיפול, והתצפית על ת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. microfabrication

הערה: כל נהלי microfabrication מבוצעים חדר נקי. מסכת כרום נועדה לפני microfabrication, רואה איור 2.

figure-protocol-1
איור 2: סכמטי של עיצוב ערוץ השבב microfluidic ואת הממדים של יחידות עבודה. א) עיצוב מסכה של microchannels PDMS מזדהה (הירוק) לבין הדפוסים על מצע הזכוכית (כחול ואדום). ב) תמונה המוגדלת של עיצוב ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמת microfluidic המתוארת בעבודה זו יכולה לשמש כדי לחקור אינטראקציות בועת בועה וכדי לנתח מגוון של bioeffects נגרמת cavitation ברמת התא הבודד. כאן, אנו מציגים מספר דוגמאות להפגין מגוון של מחקרים ניסויים ו- bioassays שניתן לבצע במערכת הניסוי שלנו. נדגים את האינטראקציות החולפות ראשון של בועות בד בבד עם היווצרות הסילון, ההדמיה של שדה הזרימה כתוצאה, ואת חישוב מהירות סילון (איור 5 א). אנו דוגמאות אז נוכחיות של טנדם בועה הנגרמת דפורמצ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח מתא בודד, בשילוב עם הדמיה לחיות תאים, שיפרה מאוד את הבנתנו של תהליכים דינמיים ולעיתים קרובות משתנה בתאים בודדים, כגון פיתוח פנוטיפ התגובה החיסונית 23. בניגוד תרבית התא הקונבנציונלי במנות או צלוחיות, מערכות microfluidic לאפשר שליטה מדויקת של microenvironment, עד לרמת התא הבודד, בזמן אמת. כתוצאה מכך, התפתחות טכנולוגית microfluidic וטכניקות בעיקר שפרו את התפוקה ואת השחזור של ניתוח תא בודד. על ידי שילוב דפוסים ליתוגרפיה משטח רכים, מערכות microfluidic יכולות להיות מתוכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להכיר בשימוש במתקן החדר הנקי SMIF באוניברסיטת דיוק. אנו רוצים גם להודות להאו צ'יאנג על עזרתו במדידת מהירות הסילון. המחברים מודים לטוד רמבו מ-Hadland Imaging על שסיפק את מצלמת Shimadzu HPV-X ששימשה במחקר זה. העבודה מומנה בחלקה על ידי ה-NIH באמצעות מענקים 5R03EB017886-02 ו-4R37DK052985-20.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>מגיב / חומרים< / חזק>
75 מ"מ x 38 מ"מ שקופיות מיקרוסקופ רגילקורנינג2947-75X38
אצטוןסיגמא אולדריץ', ושות'320110מגיב ACS, ≥ 99.5%
אלכוהול איזופרופילסיגמא אולדריץ', ושות'W292907≥ 99.7%, FCC,
חומצה גופרתיתסיגמא אולדריץ', ושות'.320501מגיב ACS, 95.0-98.0%
מי חמצןSigma Aldrich, Co.21676330 wt.% ב-H2O
פריימר P-20MicrochemMCC פריימר 80/20
NFR PhotoresistJSRNFR016D2
PhotomaskPhotomaskN /A4x4 מסכת כתיבה ישירה
MF-319 מפתחשיפלי (רוהם והאס)Microposit MF-319
1165 Photoresist RemoverDow Chemical, Co. DEM-100180731-מתיל-2-פירולידינון מבוסס
S1813 פוטו-רזיסטשיפלי (רוהם והאס)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
סרט פרפיןHACH251764
SU-2025 PhotoresistMicrochemSU-2025
PDMSדאו קורנינג184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג
צינורות מיקרובורSaint-Gobain PPL Corp.S-54-HL
פיני מתכתצינור קטן ניו אינגלנדNE-1300-01צינור חתוך (ישר), 0.025 אינץ' קוטר חיצוני x 0.017 אינץ' מזהה x 0.50 אינץ' תאי HeLa ארוכים
מתקן תרבית תאי דיוק(307-CCL-2) HeLa, עמ '148
מאגר DPBS (1x) ThermoFisherScientific14190144
מדיום תרבית DMEMThermoFisher Scientific11995065
חלבון בקר פיברונקטין, פלזמהThermoFisher Scientific33010018
0.25% טריפסין-EDTA (1x)ThermoFisher Scientific25200056
Propidium IodideThermoFisher ScientificP21493
Carboxylate Microspheres 1.00  μ מPolysciences, Inc08226-15
קרבוקסילט מיקרוספירות 2.00  μ mPolysciences, Inc18327-10
EDC (1-אתיל-3-(3-דימתילאמינפרופיל)קרבודימיד הידרוכלוריד)ThermoFisher Scientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
Fura-2, AMThermoFisher ScientificF1221
DMSOSigma Aldrich, Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 ומיקרו; m מסונן (תמיסה של 10% במים)
מדיית סרום מופחתת ThermoFisher Scientific11058021
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Plasma asherEmitechK-1050XO2 / אפר פלזמה של פוטו-רזיסט וחומרים אורגניים אחרים
יישור מסכהSUSS MicroTec קארל סוס MA6/BA6
מאייד קרן אלקטרוניתCHA Industries CHAIndustries פתרון תעשיות E-Beam
RIETrion Technology Trion Technology Phantom II(תחמוצת / ניטריד / פולימר) תחריט
סטריאוסקופAmScopeאמריקאי SM-4TZ-FRLסטריאו מיקרוסקופ
משאבת מזרקChemyx IncNanoJet
חממת תרבית תאיםNuAireAutoFlow NU-8500 מעיל מים CO2 incubator
ארונות בטיחות ביולוגייםNuAireNU-425-400
אמבט מיםVWR1122s
IECCentra CL2
מיקרוסקופZeissAxio Observer Z1
Nd:YAG לייזר  (לייזר 1)חדש מחקרסערה
Nd:YAG לייזר  (לייזר 2)מחקר גלים חדשיםעיכוב אוריון
ברקלי נוקלאוניקס BNC 565-8c
Dyna-LiteML1000 מצלמת פלאש
DRS Hadland  Imacon 200
במהירות גבוהה  מצלמהShimadzuHPV-X
מצלמה במהירות גבוההVision ResearchPhantom V7.3
PIV תוכנהLaVisionDaVis 7.2
מצלמהZeissAxioCam MRc 5
תוכנהZeissAxioVision
PTI מערכתHoribaS/N: 1705 RAM-X
EasyRatio תוכנהHoribaEasy Ratio Pro 2גרסה 2.3.125.86
63 פעמים; המטרהZeissLD תוכנית Neofluar
FG צנטריפוגה גל מחולל מנורת פלאש מצמד סיבים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

Related Articles