הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

9.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55108

⸱

21 באוקטובר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שבץ איסכמי הוא אירוע מורכב שבו התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור במוח המושפעים נחשפים גלוקוז חוסר חמצן (OGD) הוא קשה ללמוד. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשיג האסטרוציטים מבודד וללמוד שלהם תגובתיות והתפשטות בתנאים OGD.

תקציר

שבץ איסכמי הוא פגיעה מוחית מורכבת הנגרמת על ידי כגון או תסחיף חוסם את זרימת הדם אל חלקים במוח. זה מוביל לקיפוח של חמצן, גלוקוז, אשר גורם אנרגיה ולמוות עצביים. לאחר עלבון שבץ איסכמי, האסטרוציטים הפך תגובתי, להתרבות סביב האתר פציעה כפי שהוא מתפתח. בתסריט הזה, קשה ללמוד את התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור המוח חשוף איסכמיה. לכן, מאמר זה מציג מתודולוגיה ללמוד אסטרוציט העיקרי תגובתיות והתפשטות תחת מודל במבחנה של סביבה, כמו איסכמיה, שנקרא גלוקוז חוסר חמצן (OGD). האסטרוציטים הם בודדו אותנו מהמתרחש 1-4 ימים-חולדות neonatal הישן, מספר התאים astrocytic שאינם ספציפיים הוערכה באמצעות סמן סלקטיבי אסטרוציט גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) וצביעת גרעינית. התקופה שבה האסטרוציטים נחשפים לתנאי OGD יכול להיות מותאם אישית, כמו גם אחוז החמצן שהם נחשפים. גמישות זו מאפשרת למדענים לאפיין את משך התנאי איסכמי כמו בקבוצות שונות של תאים בתוך חוץ גופית. מאמר זה מתאר את מסגרת זמן של OGD זה לגרום אסטרוציט תגובתיות מורפולוגיה היפרטרופית, התפשטות כפי שהיא נמדדת immunofluorescence באמצעות מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA). מלבד התפשטות, האסטרוציטים עוברים אנרגיה סטרס חמצוני, להגיב OGD על ידי שחרור גורמים מסיסים לתוך התא האמצעי. בינוני יכול להיות ונשתמש בהם כדי לנתח את ההשפעות של מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים בתרבויות עצביים ראשי ללא אינטראקציה עם מתא לתא. לסיכום, המודל התרבות התא הראשי ניתן להשתמש ביעילות כדי להבין את התפקיד של האסטרוציטים מבודד על פגיעה.

מבוא

קו מוגדר כ- "חריפה נוירולוגיות בתפקוד כלי דם המקור עם התפתחות מהירה או פתאומית של תסמינים וסימנים, התואם מעורבותם של תחומי פעילות במוח"1,2. ישנם שני סוגים של שבץ: hemorrhagic, איסכמי. כאשר תפקוד כלי הדם נגרמת על-ידי מפרצת או תקלה עורקית, מלווה בהיחלשות עם קרע אחורי של עורק, זה נקרא שבץ מדמם3 אשר, ברוב המקרים, מובילה למוות. כאשר כגון או תסחיף מונעת זרימת הדם, גורם זמני מניעת חמצן, גלוקוז לאזור במוח, זה נקרא שבץ איסכמי4. כשל לטפח תאים סביב האזור הנגוע או מוביל איסכמי הליבה איזון homeostatic וחילוף, תפקוד אנרגטי, מוות עצביים ו דלקת5, אשר יכול לגרום נכות לכל החיים עבור חולים6.

שבץ איסכמי הוא פגיעה multifactorial המערבים מספר סוגים של תאים להגיב ולהפעיל את ההשפעות שלהם בנקודות זמן שונות. אינטראקציות רבות ליצור סביבה קשה ללמוד את אופן הפעולה של תאים בודדים. ? אז, איך לומדים את התרומה של סוג תא מסוים תחת סביבה מורכבת? מודל מקובל במבחנה של איסכמיה מורכב של חשיפת תאים כדי מניעת חמצן, גלוקוז (OGD), במשך תקופה מסוימת, ואחריו את השחזור של תאים normoxic לסביבה. מערכת זו מדמה של שבץ איסכמי ואחריו פגיעה reperfusion דם. בשיטה זו, תאים או רקמות נחשפים בתקשורת ללא גלוקוז בסביבה ללא חמצן, באמצעות תא ובשפתיים מיוחדים. זמן הדגירה OGD יכול להשתנות בין מספר דקות עד 24 h, בהתאם ההיפותזה רוצה להיבדק. מחקרים הראו כי בהתאם הזמנים של OGD, normoxic הסביבה, פנוטיפים ספציפי של שבץ (קרי, חריפה או subchronic) יכולה להיות מושגת. ראשי האסטרוציטים מבודד, נחשפים OGD עם שיקום האחורי לתנאים normoxic, הוא מודל הסלולר למד היטב כדי לחקות קו במבחנה7. שימוש OGD אפשרי לחשוף את המנגנונים המולקולריים עצמאית של תאים בודד תחת סביבה דמויי שבץ.

הידע שלנו על ביולוגיה אסטרוציט גודלת, זה הפך ברור כי הם חיוניים עבור שמירה על הסינפסות ומנחם תיקון, ופיתוח פלסטיות עצבית8. בתנאים רגילים, האסטרוציטים לשחרר ולהגיב ציטוקינים, נוגדנים, גורמי גדילה, gliotransmitters, שמירה על איזון מטבולי, הומאוסטזיס בתוך הסינפסות5,9. ב- neuroinflammation חריפה, כגון שבץ איסכמי, תאים אלה יכולים להפוך תגובתי, להראות ביטוי ארוכות טווח של גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) ולהציג היפרטרופיה שלהם מורפולוגיה5,10, 11 , 12. כמו אירוע איסכמי מתפתח, הומאוסטזיס שסופקו על-ידי האסטרוציטים הופך להיות מושפעת, לגבי ספיגת גלוטמט נורמלי, חילוף החומרים האנרגיה, חילופי מולקולות פעילים, נוגד חמצון פעילות13.

האסטרוציטים שהופעלה מחדש להתרבות סביב הרקמה לאוטם בזמן לויקוציטים נודדים לכיוון אזור lesioned14. תפוצת astrocytic ניתן למדוד באמצעות סמנים כגון מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA), Ki67 ו- bromodeoxyuridine (BrdU)15. תגובה proliferative זו נוצרת באופן תלוי-זמן והיא מסייעת ויוצרים את הצלקת גליה, מערך האסטרוציטים בלתי הפיך תגובתי לאורך parenchyma של אתר פגום אחרי הפציעה9. אחת מהפונקציות הראשונית של הצלקת הזאת היא להגביל את extravasation תא החיסון מהאזור הזה. עם זאת, מחקרים הראו כי הצלקת הופך ליקוי פיזי עבור אקסונים להרחיב, כפי הם משחררים מולקולות מעכבות את הצמיחה עצב, וליצור מכשול פיסי מניעת אקסונים הארכת סביב האזור הפגוע ה-16. עם זאת, יש ראיות מדעיות מראה כי לאחר פציעה בחוט השדרה, לגמרי מניעת היווצרות צלקת גליה עלול לפגום לרגנרציה של אקסונים17. לפיכך, ההקשר שבו נמדד התגובה astrocytic ספציפי, יש לקחת בחשבון על המסגרת של הפגיעה למד.

המתודולוגיה שהוצגו יכול להיות מיושם בו הפונקציה תגובותיהם של האסטרוציטים לאחר חוסר חמצן גלוקוזה, שניתן יהיה לשנותה בהתאם השאלות החוקר רוצה לענות. לדוגמה, מלבד שינוי מורפולוגי, את סמני הביע בזמנים שונים, OGD, supernatants מן האסטרוציטים נחשפים OGD ניתן עוד לנתח כדי לזהות גורמים מסיסים שפורסמו על ידי תאים אלה, או משתמשת באמצעי התקשורת ממוזגים להעריך שלה אפקט בתאים אחרים במוח. גישה זו מאפשרת מחקרים על תגובתיות אסטרוציט העלולה להוביל הבהרה של הגורמים ותקנות לווסת את תגובתם בתרחיש של שבץ איסכמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כמחנכת חולדות (ספראג Dawley) 1-4 ימים הישנים משמשים כדי לבודד cortices. השיטה של המתת חסד היא עריפה, כפי שאושר על ידי הנחיות NIH.

1. הכנה של מכשירים וחומרים לניתוח

  1. Sterilize מכשירים ב החיטוי (טמפרטורה: 121 ºC, לחץ: 15 psi, זמן: כשעתיים וחצי) באמצעות קופסת מתכת או רגע איטום נרתיק עיקור. ראה חומרים טבלה של חומרים.

2. להשלים את הכנת DMEM

  1. ב גביע ליטר אחד המכיל 700 מ"ל מים בלוק, להוסיף Dulbecco ' s נשר שונה ' s אבקת בינוני בטמפרטורת החדר.
  2. להוסיף 3.7 g/L סודיום ביקרבונט, בעוד הפתרון הוא מעורבב עם פגים.
  3. התאם ה-pH ל 7.4, עם מים בלוק להביא נפח עד 1 L ולאחר מכן לסנן. למטרות תרבות, תוספת הנפח הרצוי של מדיה עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, וחמים -הלעפה תרוטרפמט 37. ראה חומרים טבלה של חומרים.
    הערה: ה-pH היה להתאים ל- 7.4 באמצעות החדרת האלקטרודה מד pH לתוך כלי התקשורת. התקשורת חייב לבחוש, לאחר מכן להוסיף לאט NaOH M 1 באמצעות טפי.

3. תרבות אסטרוציט הראשי

הערה: לאחר זריעה, מדיה תא לשנות כל שלושה ימים, תאים יכולים להיות בוגר עד confluency (11-13 ימים). ביום השלישי, הקש את הבקבוק מספר פעמים כדי להרים microglial תאים ו אוליגודנדרוציטים ובתאים את התרבות, הסר את כל ' בת ' מדיה, לשטוף פעמיים באמצעות 10 מ"ל ל- PBS, וארוקן את PBS, ואז להוסיף מדיה חדשה טריים. ראה חומרים טבלה של חומרים.

  1. ניתוח מוח היילוד עכברוש
    1. בצע הקרע בשכונה תרביות רקמה. לקבל 1-4 ימים הגורים היילוד עכברוש זקן (2 מוחות עכברים משמשים לכל 75 ס מ 2 הבקבוק).
    2. להכין שלוש צלחות פטרי 60 מ מ, פיפטה 5 מ של DMEM מלאה על כל אחד.
      הערה: והם יכולים להיות מחולקים כדלקמן: #1 עבור כל עכברוש המוח-#2 עבור כל cortices את המוח, ו- #3 עבור כל cortices קלופים (ללא קרומי המוח).
    3. לתפוס את הגור ולרסס עם 70% אתנול. לערוף אותו ולמחוק את הגופה בתוך מיכל פסולת חומרים מסוכנים קטן.
    4. באמצעות את הפינצטה לנתח מיקרו, תחזיק את הראש. ולחתוך את העור מעל הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
    5. עם עוד זוג מספריים, להפוך " T " החתך מתחיל מן הצד האחורי של הגולגולת לכיוון האף. השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר בעדינות את הגולגולת.
    6. להסיר את המוח החשוף עם זוג מלקחיים ומניחים המוח באחת צלחות פטרי בעבר מילא בינונית.
    7. קבוצה נוספת של מכשירים סטריליים לשימוש והשלבים הבאים.
    8. להשתמש מלקחיים לנתח מיקרו הנח בעדינות את המוח על המכסה הפוך של צלחת פטרי 60 מ מ. כאשר הפטרי מושם על גזה סטרילית, ניתן להציג את המוח בבירור וזה יותר קל לנתח.
    9. לייצב את המוח עם מלקחיים לנתח מיקרו ולהפריד את הכדור מוחי על ידי בעדינות להקניט לאורך סדק קו האמצע עם החוד של המלקחיים לנתח מיקרו-
    10. Deflect, לקלף את cortices, משאיר מאחור את חומר לבן, ומעבירים אותם אל צלחת פטרי, בעבר עם התווית #2. חזור על התהליך עבור כל המוחות, המשלב את כל cortices גזור בצלוחית הפטרי שכותרתו #2-
    11. להוציא את ההיפוקמפוס מ מתחת לכל קליפת ולבטל את זה
    12. להשתמש את הפינצטה לנתח מיקרו פטרי 60 מ מ לקלף בעדינות קרומי המוח של האונות קורטיקלית בודדים, ולמקם אותם לתוך הפטרי שכותרתו #3-
  2. רקמות דיסוציאציה: שיטת בלנדר מהמגן
    1. שופכים ההשעיה רקמות/בינוניים (קלופים cortices של המוח) לתוך השקית בלנדר סטרילי ולהוסיף בינוני מספיק להביא את הנפח הכולל בתיק מ ל.
    2. מניחים את השקית לתוך הבלנדר מהמגן, עוזב כ 2 ס מ של התיק גלוי מעל הדלת הסגורה. הדיסוציאציה תא נעשית בזמן 2.5 דקות במהירות גבוהה.
      הערה: לחלופין, ניתן לבצע זאת על-ידי סגירת התיק וחובטים זה בעדינות עם גביע בשכונה. הקפד להשתמש מטלית בין התיק ואת הספל כדי למנוע חיכוך.
    3. שופכים התליה תא לתוך מסננת רשת מספר 60, ואז לשפוך את זרימת מסוננים דרך על גבי מסננת המספר 100, ומאפשרת לסנן לפי כוח המשיכה.
    4. באמצעות 15 מ"ל צינורות, centrifuge התליה תא ב g 200 x ומפרידה קליניים (רצוי הנדנדה דלי. רוטור) עבור 5 דק.
    5. יוצקים את תגובת שיקוע בתוך, ואז בעזרת פיפטה סרולוגית, מחדש להשעות מביצועם בגדר של תאים במקסימום של 5 מ של המדיה-
  3. תא ספירת
    1. micropipette, לאסוף 100 µL תא השעיה צינור microcentrifuge 1.5 mL, להוסיף 100 µL של trypan blue.
    2. להכניס hemocytometer 10 µL של ההשעיה שנאספו ולספור כל התאים הם קיימא בארבע פינות של הכיכר-
      3. הן נוסחות חישוב הצפיפות של התאים בהכנת המבחנות
    3. :
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
    4. להוסיף תאים לפחות 500,000 לכל 25 ס מ 2 הבקבוק. פיפטה עד 5 מ"ל של DMEM לתוך כל הבקבוק. התערובת לא צריך להגיע את צוואר הבקבוק. מקם אותם בתוך חממה 37 ° C-5% CO 2, 3 ימים ולאחר מכן לשנות את המדיה-
  4. טכניקות טיהור אסטרוציט: מדיה לשנות, מכאני וכימי אסטרטגיות
    הערה: קצב חילוף החומרים של האסטרוציטים הוא גבוה לעומת סוגי תאים אחרים, לכן, תזונתית מקופח תנאים, תאים אלה להראות שיעורי הישרדות נמוכים אחרי כמה ימים. בניגוד האסטרוציטים, מיקרוגלייה אינם מושפעים מחסור תזונתי, להתרבות כזה בסביבות 18. כדי לשמור על מספר מצומצם של תאים microglial, המחברים לשנות astroglial תא תרבות התקשורת כל 3 ימים. שינוי זה קבוע בתקשורת תא יקטן גם האוכלוסייה microglial שיכול לגדול מעל טפט תא astrocytic הבקבוקון 19.
    1. שימוש פסטר פיפטה לרוקן את התקשורת עם תאים שאינם מחסידי microglial מכל אחת המבחנות. שטיפת נפולת השאיר מאחור באמצעות סטרילי-מסוננים PBS לכל המבחנות באופן dropwise (5 מ ל/הבקבוק).
    2. להוסיף את DMEM סטרילי-מסוננים (עם סרום שור אנטיביוטי ו עוברית) dropwise כל הבקבוק (5 מ ל/הבקבוק). להתסיס בעדינות בתנועות מעגליות כדי לכסות את המשטח כולו.
    3. המקום התאים ב- 37 ° חממה C ב- 5% CO 2 8-10 ימים עד המבחנות להגיע confluency (> 95% לוחית כיסוי).
      הערה: מספר פרוטוקולים הראו כי כאשר האסטרוציטים מגיעים confluency, שיטות מכנית, כגון טלטול התרבות בין 2 ל 24 שעות, מוביל הניתוק של תאים שנמצאים על גבי האסטרוציטים אלה, בעיקר מיקרוגלייה, קודמן תאים 19 , 20-
    4. תאים Non-astrocytic מופחתים בתרבות על-ידי ביצוע רועד מסלולית-סל ד 180 למשך 30 דקות. לאחר הסרת התאים בתגובת שיקוע, מדיה חדשה היא pipetted לתוך הבקבוק (~ 15 מ"ל).
    5. לחסל את אוליגודנדרוציטים ובתאים, להגביר את המהירות חזק ל 200 סל ד 6-אייץ ' 21 , 22 , 23, תגובת שיקוע וביופסיה של מדיה חדשה pipet.
      הערה: כדי להקטין את הנוכחות של מיקרוגלייה בתרבויות, שתי שיטות כימיות ניתן להשתמש ברצף (לא זמנית) בהמתודולוגיה התרבות התא העיקרי: אראבינוז ציטוזין (Ara-C) ו ללאוסין מתיל אסטר (LME) 24.
    6. מיד כאשר תאים להגיע confluency (100%), 3-4 ימים לאחר הסרת מכני מיקרוגלייה, תאים אלה יכולים להיות מטופלים עם 8 מיקרומטר של antimitotic מתחם אראבינוז ציטוזין (Ara-C) ב- DMEM במשך 5 ימים (שינוי טריים Ara-C ב- DMEM מדי יום).
      הערה: נקודת הזמן כדי להוסיף Ara-C הוא קריטי מכיוון המתחם הזה הוא סם antimitotic, אשר מפחית את מספר התאים חלוקת במהירות מיקרוגלייה 19 , 25 ו fibroblasts 26 . בניגוד מיקרוגלייה, כאשר confluent, האסטרוציטים להפסיק מתרבים באמצעות סימן דיכוי 27.
    7. לאפשר 2 ימים עבור תאים להתאושש טיפול Ara-C.
    8. כדי להוסיף ולצמצם את זיהום microglial, לאחר תאים להגיע confluency, להשתמש מ 50 מ ללאוסין מתיל אסטר (LME) ב- DMEM קבוע ב- pH 7.4, עבור h 1 הלעפה תרוטרפמט 37.
      הערה: LME חוצה את הממברנה של התאים, organelles, לאחר, להיות הידרוליזה ללאוסין המיוצר שמצטבר lysosomes של תאים אלה. ההצטברות של חומצה אמינית זו מובילה קרע של 28 , lysosomes 29 ונפיחות osmotic. LME הוא יעיל ב חיסול מיקרוגלייה, לעומת תאים אחרים, 20 , 30-

4. טיפוח האסטרוציטים ב 6-ובכן צלחות

  1. ציפוי coverslips עם פולי-D-ליזין
    1. coverslip לשים אחד בכל 35 מ מ פטרי צלחת, ואז להוסיף 100 µL של הפתרון מדולל פולי-D-ליזין coverslip כל ולחכות ח' 1
    2. להסיר את פולי-D-ליזין. ולשטוף פעמיים עם 2 מ"ל מים סטריליים.
    3. להסיר מים ולחכות coverslips להתייבש בתוך המנוע. לאחסן את coverslips ב-20 ° C עד שבועיים.
      הערה: להקפיא את הפתרון מדולל פולי-D-ליזין; ניתן לאחסן עד שבועיים.
  2. Trypsinization
    1. באמצעות פיפטה של פסטר, תשאף האמצעי המבחנות. הוסף 5 מ ל/הבקבוקון של PBS סטרילי-מסוננים לשטוף בעדינות את התאים.
    2. וביופסיה כבוי החינוכית ולאחר מכן הוסף 5 מ ל/הבקבוק בפתרון סטרילי-מסוננים 0.25% טריפסין ו- 0.5 מ מ EDTA. הכנס את הבקבוקון הלעפה תרוטרפמט 37, 5% CO 2 מגשים עבור 10 דקות
      הערה: בעוד התאים הם המקננת, חם 5 מ"ל הבקבוקון של טרי DMEM מלאה ב- 37 מעלות צלזיוס.
    3. אחרי 10 דקות של דגירה, להתסיס כדי לוודא כי כל התאים מוסרות את הבקבוק. להוסיף במהירות של 5 מ של DMEM מלאה חמה לכל מבחנה לנטרל את טריפסין.
    4. Pipette בעדינות את התאים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשבור את כל " גושים ". להעביר תאים מושעה שתי מבחנות שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 mL-
    5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g כדי לאסוף בגדר התא. מחדש להשעות את צניפה ב 500 µL בינוני והמשך כדי למקם את התאים המבחנות.
      הערה: דוגמאות של ניתוחים להתבצע עם תאים: 1) שעתוק במהופך תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) כדי לנתח ביטוי גנים; 2) תספיג להעריך ביטוי חלבון; 3) ניתוח cytometry זרימה לכמת את מספר ובתאים עצבית, חלבונים עניין; 4) immunofluorescence כדי לנתח בלוקליזציה וביטוי חלבונים.
  3. האסטרוציטים זריעת
    1. לאחר בטיפול את האסטרוציטים ראשי עם טריפסין (עיין 4.2), לאסוף 100 μL תא השעיה צינור microcentrifuge 1.5 mL ולהוסיף 100 μL של 0.5% trypan blue.
    2. להוסיף 10 μL של ההשעיה שנאספו ב- trypan כחול כדי hemocytometer ולספור כל התאים הם קיימא.
    3. להשתמש נוסחות את שלב 3.3 כדי לחשב את צפיפות התאים בהכנת המבחנות.
      4. מנות
    4. הכן הבאר מרובות על-ידי הוספת אחד סטרילי, פולי-D-ליזין מצופה coverslip אל כל טוב. Pipette התאים 50,000 ולמלא את שאר אמצעי האחסון בכל צלחת רב טוב טרי בינוני (כ 2 מ"ל).
    5. למקם את הכלים היטב רב לתוך החממה הלעפה תרוטרפמט 37 ב- 5% CO 2 ו, לאחר 5-7 ימים, האסטרוציטים עשוי לגדול לכסות את המשטח כולו של coverslips.

5. פרוטוקול OGD האסטרוציטים הראשי

  1. הכנה בינונית OGD
    1. Dulbecco תוספת ' s ששינה הנשר ' s בינונית ללא גלוקוז עם 3.7 g/L סודיום ביקרבונט, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. ראה חומרים בטבלה 4.
    2. לטהר 20 מ"ל של המדיום גלוקוז חופשי על ידי מבעבעים עם 95% N 2 / 5% CO 2 10 דקות-זרם של 15 ליטר/דקה (מסומן עם מד זרימה) על-ידי הוספת על פיפטה סרולוגית למערכת הגז המדיום.
      הערה: לאחר טיהור המדיום של חמצן, להתאים את רמת ה-pH-7.4 (עיין הערה על שלב 2.1).
    3. לסנן המדיום ללא גלוקוז לצמיתות באמצעות מערכת סינון שפופרת 50 מ ל.
      הערה: להכין טרי בינוני OGD עבור כל ניסוי, מבעבעים עם 95% N 2 / 5% CO 2 לפני השימוש, כדי להבטיח כי התאים חשופים לסביבה ללא חמצן.
  2. ניתוח ניסיוני
    1. בתוך המנוע תרביות רקמה, להסיר מדיה אסטרוציט coverslips בעבר מוכן (עיין שלב 4.3.5), תשטוף עם PBS הסלולר פעמיים כדי להסיר כל גלוקוז בתאים.
    2. להוסיף 2 מ"ל של התקשורת OGD לכל אחד טוב ומניחים את הכלים רב טוב בתוך החדר היפוקסיה עם הנהגים העפעפיים שלהם
    3. להתחבר את התערובת שסתום הכניסה ולהשאיר את שסתום היציאה פתוחה. לרוקן את המיכל עם תערובת גז של 95% N 2 / 5% CO 2, ב- 15 ליטר/דקה במשך 5 דק
    4. לעצור את זרימת הגז, קודם לסגור את המלחציים שסתום היציאה ואז לסגור את המלחציים לאורך צינור שסתום הכניסה גז-
      הערה: ודא שיש אין נזילה הגז על ידי כיסוי החותם של התא עם סבון ומים. אם החותם הוא מאובטח, אין בועות יוצרות.
    5. למקם את התא כולו לתוך החממה התרבות התא ב 37 ° C 1 h או 6 h ב- OGD.
    6. אחרי זמן הדגירה, האחות OGD המדיה ולעבד בקפידה pipet 2 מ של DMEM מלאה בכל ס מ 4.67 2 טוב בשביל normoxic ה 24

6. פרוטוקול הכנה Immunofluorescence אסטרוציט הראשי

הערה: כדי להעריך אסטרוציט טוהר, סוגי לתא מוח כמו נוירונים מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך יכול יזוהו על-ידי immunofluorescence באמצעות סמנים תאים שונים. התפשטות סמני PCNA, propidium יודיד (PI) יכול לשמש על ראשי האסטרוציטים נחשפים OGD ואחריו normoxic תנאים. ראה חומרים טבלה של חומרים.

  1. Immunofluorescence הכנת
    הערה: זה פרוטוקול immunofluorescence כללי, שינויים מזעריים שניתן לבצע כדי להשיג את אות אופטימלית (למשל, תקופות ארוכות יותר של דגירה, בטמפרטורת דגירה). כל סמן בטבלה 1 יכול לשמש על פי היצרן ' פרוטוקול s.
    1. להערכת הכדאיות תאים, התאים יכולים להיות מודגרות למשך 5 דקות ב 37 ° C עם PI (5 מיקרומטר ב DMEM מלאה) ולשטוף פעמיים עם 2 מ של PBS עבור 5 דק תאים המציגים PI מכתים הם פחות קיימא.
      הערה: שימוש בתאים מטופלים בשלב 5.2.6.
    2. לתקן תאים לאחר PI מכתים, להוסיף 2 מ של 4% פורמלין לכל ס מ 4.67 2, עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. לקבלת דוגמאות המסומנת PCNA, תיקון הפתרון המועדף הוא מתנול 10 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט.
      התראה: פורמלין, מתנול רעילים.
      הערה: תמיד לבדוק נוגדנים ספציפיים פרוטוקולים של כל חברה.
    3. לרחוץ תאים עם 2 מ של PBS במשך 5 דקות, חזור על שלב זה 3 פעמים.
    4. דגירה בתאים חסימת פתרון (0.5% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 10% FBS ב- PBS) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
    5. לרחוץ את התאים עם 2 מ של PBS במשך 5 דקות, חזור על שטיפת 3 פעמים.
    6. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס, למשך הלילה (16 שעות), עם נוגדן ראשוני (PCNA, GFAP) בריכוז של 1% FBS ב- PBS.
    7. להסיר הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS במשך 5 דקות, חזור על שלב זה 3 פעמים.
    8. Incubate עם נוגדנים משניים מצומדת עם fluorophore בריכוז של 1% FBS ב- PBS, לשעה בטמפרטורת החדר.
    9. לרחוץ את התאים עם 2 מ של PBS במשך 5 דקות, חזור על שלב זה 3 פעמים. להוסיף 1 µg/mL של דאפי (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) עבור 5 דקות כדי להכתים את גרעין התא.
    10. לרחוץ תאים עם 2 מ של PBS 5 דקות, חזור על שלב זה פעמיים ולשמור ב- PBS.
    11. להכין את coverslips בשקופית מיקרוסקופ באמצעות הרכבה בינונית.
  2. מיקרוסקופ קונפוקלי
    1. לאחר הגדרת המיקרוסקופ, מניחים בצד coverslip למטה על הבמה מיקרוסקופ.
    2. באמצעות התוכנה, בחר קרן לייזר אל 543nm עבור נוגדן מצומדת GFAP-Cy3.

7. תא Assay הכדאיות

  1. Trypsinize ולכמת האסטרוציטים על-ידי ביצוע שלבים 4.3 ו- 4.4.
  2. להוסיף 1 x 10 4 תאים/טוב צלחות 96-ובכן, לגדל אותם כדי confluency.
  3. באמצעות המתודולוגיה משלב 5, לחשוף את צלחות 96-ובכן בתרבית או normoxic 1 h OGD או 6-אייץ ' OGD.
  4. OGD לאחר הטיפול, הוספת מדיה normoxic על כל התאים במשך 24 שעות ביממה ואת הכדאיות נמדדת באמצעות MTT ריאגנט assay (להשתמש בתור יצרן ' s ההוראות מציינות).
  5. פתרון MTT 5 מ"ג/מ"ל, להוסיף 10% מהנפח הכולל מכל קידוח, תקופת דגירה של h 3 הלעפה תרוטרפמט 37 עם הכימית MTT.
  6. להסיר מדיה, resuspend גבישים באמצעות 200 µL דימתיל סולפוקסיד. לקרוא את הצלחת בספקטרופוטומטר ב 570 nm.
    הערה: ספיגת ירידה יחסית תאים שליטה לתאם עם הכדאיות פחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אחד החששות העיקריים של התרבות astrocytic העיקרי הוא הנוכחות של תאים אחרים כגון נוירונים, oligodendrocytes להפוך, fibroblasts מיקרוגלייה. איור 1, תאים מבודדים מן החולדה cortices היו שינויים מדיה כל 3 ימים והיו גם אינו מטופל או שטופלו עם הוספת LME עבור 1 ה 24 שעות מאוחר יותר, התאים היו immunostained עבור GFAP, counterstained עם דאפי. תאים לא מטופלת הראה ממוצע של 39% הלא-GFAP תאים חיובי, ואילו תאים שטופלו LME הראה 8%. תוצאות אלו מראות איך הטיפול LME ומדיה לשנות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את ניתוקה של האסטרוציטים מן החולדה cortices. בשיטה זו, חיוני כדי להקטין זיהום עם סוגי הסלולר אחרים כגון מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך fibroblasts. כדי לצמצם את מספר מיקרוגלייה, ניתן לנקוט בכמה צעדים: לשנות את המדיה מסלולית רועדת, טיפולים כימיים. ברגע טוהר התרבות הוא אישר immunofluorescence באמצעות סמנים הסלולר סלקטיבית או מזהמים הבולטים של התא, ניתן לבצע ניסויים. למשל, נוגדן נגד סידן מיונן מחייבת מתאם מולקולה 1 (רשות השידור-1) יכול לשמש כדי לזהות מיקרוגלייה. המוות עצביים מתחיל בשלב מוקדם של התרבות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות Paola לופס Pieraldi לסיוע טכני. A.H.M. הוא אסיר תודה עבור מענקים 8G12MD007600 ו- U54-NS083924 נתמך בפרסום זה. אנו מודים NIH-NIMHD-G12-MD007583 גרנט על התמיכה מתקן. D.E.R.A. הוא אסיר תודה על האחווה שסופקו על-ידי-NIHNIGMS-R25GM110513. אנחנו אסירי תודה על השימוש באזור מכשור המשותף ולהעניק הסיוע של ד ר Priscila Sanabria עבור השימוש במתקן הדמיה אופטית של התוכנית RCMI על ידי G12MD007583. בנוסף, אנו רוצים להודות חוסה פאדילה על תפקידו מצטיינים צילום ועריכה פרוטוקול חזותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<מכשירים חזקים>לניתוח - שלב 1
מספריים ניתוחים 5.5 אינץ'חברת רובוזRS-6812כלים המשמשים לעריפת ראשי החולדות.
מלקחיים מעוקלים 7 אינץ'  חברת RobozRS-5271מחזיק את עור החולדה בזמן הסרת הגולגולת.
מספריים מיקרו חיתוך 4 אינץ'  חברת RobozRS-5882חותכת גם את העור וגם את הגולגולת של החולדה.
מלקחיים מיקרו-מלקחיים בזווית 4 אינץ', חדה עדינה חברת RobozRS-5095מחזיק את עור החולדה בזמן הסרת הגולגולת.
מיקרו מלקחיים 4 אינץ' מעוקל מעט 0.8Roboz CompanyRS-5135כלי המשמש להפרדת קליפות.
פינצטה מיקרו-מנתחתRoboz RS-4972מקלפת את קרומי המוח במוח.
מיקרוסקופ דיסקציהאולימפוסSZX16חשוב להסרת קרומי המוח מקליפת המוח.
הכנת DMEM - שלב 2
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)GibCo. חברה11995-065תומכת בצמיחת תאים.
תוסף נתרן ביקרבונטSigma-Aldrich CompanyS7277למדיית תרבית התאים.
סרום בקר עוברי (FBS)GibCo. חברה10437-010תוסף סרום לתרבית התאים.
פניצילין-סטרפטומיצין ג'יבקו. חברה15140-148מעכבת צמיחה של חיידקים בתרבית התאים.
מערכת סינון 1 ליטר עם נקבוביות 0.22umקורנינג431098
<חזק>תרבית אסטרוציטים - שלב 3
צנרת סרולוגית 5 מ"לVWR89130-896לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים.
פיפטות סרולוגיות 10 מ"לVWR89130-898לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים.
צנרת סרולוגית 25 מ"לVWR89130-900לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים.
צינור חרוטי צנטריפוגה 15 מ"לסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-200250
צינור נעילה בטוחה 1.5 מ"ל022363204אפנדורף
200 uLSanta Cruz Biotechnologysc-201725
טיפים למחסום 1 מ"לסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-201727
תיק כתום Biohazard 14 x 19 אינץ'VWR14220-048
צלחות פטרי 60 מ"מפלקון351007
רפידות גזה סטריליותHoneywell Safety89133-086
Stomacher 80 BiomasterSewar Lab System030010019טריטורציה של רקמת המוח.
Stomacher 80 בלנדר שקיות סטריליותSewar Lab SystemBA6040שקית סטרילית להומוגניזטור תאי הקיבה.
400 מ"לפיירקס1000
מסננת דיסוציאציה של תאים סטריליים, רשת #60 חברת סיגמא-אולדריץ'S1020להשגת מתלה אחיד של תא יחיד.
מסננת דיסוציאציה של תאים סטריליים, רשת #100חברת סיגמא-אולדריץ'S3895להשגת מתלה אחיד של תא יחיד.
מיקרוסקופ פאזה הפוךNikonEclypse Ti-Sאמת תאים לזיהום או צמיחת תאים חריגה.
75 ס"מ צלוחיות סטריליותFalcon353136
Multi-well PlateFalcon353046
משקפי כיסוי מיקרו (כיסויים), 18 מ"מ, עגולVWR48380-046
Bright-Line hemacytometerCompany Sigma-Aldrich CompanyZ359629
פיפטות פסטרפישר סיינטיפיק13-678-20D
אלכוהול אתילי חברת Sigma-AldrichE7023
L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלוריד 98% (LME)חברת Sigma-AldrichL1002מקדמת חיסול של תאי מיקרוגליה בתרבות האסטרוציטים הראשונית בקליפת המוח.
ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside (Ara-C)חברת סיגמא-אולדריץ'C1768
פולי-D-ליזין הידרוברומיד, מול משקל 70,000-150,000חברת סיגמא-אולדריץ'P0899
טריפסין/EDTAGibCo. חברה15400-054
Trypan BlueSigma-Aldrich CompanyT8154
טבליות מלח פוספט (PBS)Calbiochem524650
מים סטרילייםSigma-Aldrich CompanyW3500
  OGD הכנה בינונית - שלב 5 חרוטי חזק>
צנטריפוגה 50 מ"לVWR89039-658
Dulbecco' s שונה Eagle' s גלוקוז חופשי בינוניSigma-Aldrich CompanyD5030תומך בצמיחת תאים.
תוסף נתרן ביקרבונטSigma-Aldrich CompanyS7277למדיית תרבית התאים.
פניצילין-סטרפטומיצין ג'יבקו. חברה15140-148מעכבת צמיחה של חיידקים בתרבית התאים.
200 מ'M  ל-גלוטמין ג'יבקו. חברה25030-081חומצת אמינו המשלימה את צמיחת התאים.
טבליות מלח מאגר פוספהט (PBS)Calbiochem524650
מערכת סינון 50 מ"ל עם נקבוביות 0.22umקורנינג430320
צינור חרוטי צנטריפוגה 50 מ"לVWR89039-658
מד זרימה יחיד בילופס-רוטנברגSMF3001מדידת זרימת הגז בטיהור חמצן.
תא חממת היפוקסיה StemCell27310מייצר סביבה היפוקסית לתרבית התאים.
מד חמצן מומס ניתן למעקבVWR21800-022
95% N2 / 5% תערובת גז CO2Lindeמטהר את הסביבה מחמצן.
<אימונופלואורסצנציה אסטרוציטים חזקה>ראשונית - שלב 6
טבליות מלח פוספט (PBS)Calbiochem524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%Sigma-AldrichHT501128Solution המשמשת לקיבוע תאים.
מתנול פתרון פישרA4544המשמש לתיקון תאים.
חומר פעילי שטח לא יוני (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
סרום בקר עוברי (FBS)GibCo. חברה10437-010תוסף סרום לתרבית התאים.
Anti-NeuNCell Signaling24307מזהה נוירונים בוגרים, משמש לאימות התרבות האסטרוציטית.
איתות תאים נגד PCNA2586מזהה תאים מתרבים.
Propidium Iodide (PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170צביעת אפופטוזיס.
Anti-Olig1AbcamAB68105מגלה אוליגודנדרוציטים בוגרים.
Anti-IBA1+Wako016-20001מזהה תאי מיקרוגליה.
אנטי-GFAP מצומד עם Cy3 חברת Sigma-AldrichC9205מזהה אסטרוציטים תגובתיים בתאים המטופלים.
Alexa Fluor 488Molecular Probe Life TechnologyA1101נוגדן משני נגד עכברים.
Alexa Fluor 555Molecular Probe Life TechnologyA21428נוגדן משני נגד ארנב.
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542צביעה גרעינית.
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוס
חברת טיפים למחסום

מקורות

  1. Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
  2. Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
  3. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  4. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  5. Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).
  6. Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
  7. Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574(2012).
  8. Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
  9. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  10. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282(2013).
  11. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  12. Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987(2016).
  13. Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
  14. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  15. Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
  16. Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
  17. Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
  18. Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
  19. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  20. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  21. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
  22. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
  23. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  24. Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
  25. Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
  26. Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
  27. Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
  28. Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
  29. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  30. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  31. Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
  32. Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
  33. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
  34. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
  35. Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
  36. Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
  37. Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
  38. Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד אסטרוציטיםמחסור בחמצן ובגלוקוזתרבית אסטרוציטים ראשוניתאימונופלואורסצנציית GFAPבדיקת פרוליפרציה של PCNAקורטקס של חולדה רך-גילדיסוציאציה של רקמהתא היפוקסיהפרוליפרציית תאיםאסטרוציטים תגובתיים
ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.