מאמר שיטה

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

DOI:

10.3791/55112

⸱

28 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאים אנושיים לניתוח גורמי התחלת תרגום הקושרים את מכסה ה-5' של mRNA בתנאי חמצן פיזיולוגיים. שיטה זו משתמשת באנלוגי כובע m7GTP המקושר לאגרוז ומתאימה לחקירת גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקרה תרגומית היא מוקד של ויסות גנים, במיוחד בתקופות של לחץ תאי. תרגום תלוי כובע באמצעות קומפלקס eIF4F הוא ללא ספק המסלול הנפוץ ביותר להתחלת סינתזת חלבון בתאים אוקריוטיים, אך וריאציות ספציפיות למתח של קומפלקס זה צצות כעת. טיהור חלבונים קושרי כובע עם שרף זיקה המורכב מ-m7GTP המקושר לאגרוז (אנלוגי כובע mRNA 5') הוא כלי שימושי לזיהוי גורמים המעורבים בוויסות התחלת התרגום. היפוקסיה (חמצן נמוך) היא מתח תאי שנתקל בו במהלך התפתחות העובר והתקדמות הגידול, והיא תלויה מאוד בוויסות התרגום. יתר על כן, לאחרונה דווח כי לאיברים בוגרים אנושיים יש תכולת חמצן נמוכה יותר (פיזיוקסיה 1-9% חמצן) הקרובה יותר להיפוקסיה מאשר האוויר הסביבתי שבו התאים מגודלים באופן שגרתי. עם האפיון המתמשך של קומפלקס eIF4F היפוקסי (eIF4FH), יש עניין גובר בהבנת התחלת תרגום תלוית חמצן דרך מכסה ה-mRNA 5'. לאחרונה פיתחנו שיטת תרבית תאים אנושיים לניתוח חלבונים קושרי כובע המווסתים על ידי זמינות חמצן. פרוטוקול זה מדגיש כי תרבית תאים וליזה יבוצעו בתחנת עבודה היפוקסיה כדי למנוע חשיפה לחמצן. יש לדגור תאים למשך 24 שעות לפחות כדי שהמדיה הנוזלית תתאזן עם האטמוספירה בתוך תחנת העבודה. כדי להימנע ממגבלה זו, ניתן להוסיף לתאים מדיה מותנית מראש (נטולת חמצן) אם נדרשות נקודות זמן קצרות יותר. חלבונים מסוימים קושרי כובע דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים להידרוליזה של ה-m7GTP, ולכן חלק מהאינטראקטורים של הכובע עלולים להחמיץ בתהליך הטיהור. ניתן להחליף אנלוגים של כובע המקושר לאגרוז לעמידות אנזימטית בפרוטוקול זה. שיטה זו מאפשרת למשתמש לזהות גורמי תרגום חדשים המווסתים על ידי חמצן המעורבים בתרגום תלוי מכסה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שליטה Translational מתגלה צעד חשוב לא פחות לרגולציה תעתיק בביטוי הגנים, במיוחד בתקופות של מתח הסלולר 1. מוקד שליטת תרגום הוא צעד שער הגבלת חניכה שבו הצעדים הראשונים של סינתזת חלבון לערב הכריכה של 4E גורם ייזום איקריוטיים (eIF4E) אל 7-methylguanosine (מ 7 GTP) 5 'כובע של mRNAs 2 . eIF4E הוא חלק ממכלול trimeric בשם eIF4F הכולל eIF4A, גידול helicase RNA, eIF4G, חלבון פיגומים הנדרש לגיוס של גורמי תרגום אחרים ואת 40S הריבוזום 3. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, רוב mRNAs המכריע מתורגם באמצעות מנגנון כובע תלוי, אבל תחת תקופות של מתח הסלולר כ 10% של mRNAs האנושי מכילים 5 'UTRs עלולה לאפשר תרגום עצמאי-כובע טכס חניכת 1,4. תרגום שווה תלויה כבר היסטורי נרדףמפוקפק עם eIF4F, לעומת זאת, וריאציות ספציפי לחץ של eIF4F הפכו נושאי טרנדים 5-8.

מדגיש תאיים שונה לגרום לפעילות eIF4E צורך להדחיק באמצעות היעד היונק של rapamycin מורכבי 1 (mTORC1). קינאז זה הופך לקוי תחת לחץ, וכתוצאה מכך את הפעילות המוגברת של אחד היעדים שלה, 4E-חלבון מחייב (4E-BP). ללא פוספורילציה 4E-BP נקשר eIF4E וחוסם את יכולתה לקיים אינטראקציה עם eIF4G גורם לדיכוי של תרגום תלוי כובע 9,10. נקודה מעניינת היא homolog של eIF4E בשם eIF4E2 (או 4EHP) יש זיקה הרבה יותר נמוך עבור 4E-BP 11, אולי שמאפשר לו לחמוק הדחקה בתיווך מתח. ואכן, בתחילה לאפיין מדכא של התרגום בשל היעדר האינטראקציה עם eIF4G 12, eIF4E2 יוזם את התרגום של מאות mRNAs המכילים אלמנטים בתגובה היפוקסיה רנ"א 3 שלהם 'UTR במהלך מתח היפוקסי 6,13. אני הפעלה זושעות מושגת באמצעות אינטראקציות עם eIF4G3, RNA חלבון מחייב מוטיב 4, והגורם היפוקסיה מושרה (HIF) 2α להוות מורכבים eIF4F חוסר חמצן, או eIF4F H 6,13. כתוצאה מדכאת בתנאים רגילים, eIF4E2 נקשר עם GIGYF2 ו ZNF598 14. מתחמים אלה היו, בין שאר, שזוהו באמצעות שרפי זיקת GTP מ 7 Agarose צמודים. השיטה הקלאסית זה 15 הוא תקן בתחום התרגום והוא הטוב ביותר הנפוץ טכניקה לבודד מתחמי מחייב כובע לנתץ ו במבחנה מחייב מבחני 16-19. כמו מכונות תרגום תלוי כובע מתגלה גמישות להתאמה עם חלקים בין-שינוי 6-8,13, שיטה זו היא כלי רב עצמה כדי לזהות חלבוני כובע מחייב רומן במהירות מעורב תגובת הלחץ. יתר על כן, וריאציות eIF4F עשויות להיות השלכות רחבות כמערכות מודל מספר איקריוטיים להופיע להשתמש homolog eIF4E2 לתגובות מתח כזהכמו א thaliana 20, ס Pombe 21, ד melanogaster 22, ו- C. elegans 23.

הראיות עולה כי שינויים eIF4F לא יכול להיות מוגבל למצבי לחץ, אבל להיות מעורבים בפיזיולוגיה נורמלי 24. אספקת חמצן לרקמות (בקצוות נימי) או בתוך רקמות (נמדד באמצעות microelectrodes) נע בין 2-6% במוח 25, 3-12% בתוך הריאות 26, 3.5-6% במעי 27, 4% ב הכבד 28, 7-12% בכליה 29, 4% בשריר 30, ו 6-7% ב מח עצם 31. תאי המיטוכונדריה מכילים פחות מ -1.3% חמצן 32. ערכים אלה הם הרבה יותר קרובים היפוקסיה מאשר באוויר הסביבה שבה תאים בתרבית באופן שגרתי. הדבר מצביע על כך מה בעבר נחשבו כמו תהליכים תאיים ספציפי היפוקסיה עשויים להיות רלוונטיים בסביבה פיזיולוגית. מעניין, eIF4F ו eIF4F H להשתתף באופן פעיל בייזום התרגום של ברכות או כיתות נפרדות של mRNAs בכמה שורות תאים אנושיות שונות נחשפות לחמצן פיסיולוגי או "physioxia" 24. חמצן נמוך גם דוחפת להתפתחות תקינה של העובר 33 ותאי בדרך כלל יש שיעורי התפשטות גבוה, תוחלת החיים ארוכה יותר, פחות נזק בדנ"א ותגובות הלחץ הכללי פחות physioxia 34. לכן, eIF4F H עשויה גורם מפתח בביטוי של גנים בוחרים בתנאים פיסיולוגיים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לתאי תרבות בתנאי חמצן פיסיולוגיים קבועים או במגוון משתנה דינמי כי סביר יותר נציג microenvironments רקמות. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי התאים lysed בתוך תחנת עבודה היפוקסיה. לא לעתים קרובות ברור כיצד מעבר מתרבות תא היפוקסי תמוגה התא מתבצע פרוטוקולים אחרים. תאים הם לעתים קרובות להסיר תחילה מן חממת היפוקסיה קטנה להיותקדמי תמוגה, אבל לחשיפה זו חמצן יכולה להשפיע הביוכימיים כתגובה הסלולר לחמצן היא מהירה (אחד או שתיים דקות) 35. חלבוני כובע מחייב מסוימים דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים hydrolyze GTP מ 7, ולכן חלק interactors הכובע עלול לרדת לטמיון בתהליך הטיהור. Agarose-צמוד אנלוגים כובע עמיד enzymatically ניתן להחליף בפרוטוקול זה. היכרות עם הפעילות ורכב eIF4F H וריאציות אחרות של eIF4F באמצעות השיטה המתוארת כאן שתשפוך אור על מנגנוני ביטוי הגנים המורכבים שתאיים לנצל במהלך מצבים פיסיולוגיים או תגובות דחק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכשירי תרבית תאים

  1. לרכוש מניות זמינות המסחרי של תאים אנושיים.
    הערה: פרוטוקול זה מנצל HCT116 קרצינומה המעי הגס ותאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות אדם מן המעלה הראשונה (HRPTEC).
  2. הפוך 500 מ"ל בינוני לתרבות של HCT116: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) / בינוני גלוקוז גבוהה בתוספת 7.5% עוברית שור סרום (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
  3. הפוך 500 מ"ל בינוני לתרבות של HRPTEC: המדיום הסלולרי אפיתל השלימו עם FBS 5%, 1% תוספת צמיחת תאים אפיתל, ו -1% P / S.
  4. הכן 500 מ"ל של 1x פוספט-בופר (PBS): 140 מ"מ NaCl, KCl 3 מ"מ, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 15 מ"מ KH 2 PO 4. התאם ל- pH 7.4 לעקר ידי מעוקר במשך 40 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.

2. ייזום של culturing תא

  1. בזהירות לשאוב את המדיום מצלחת ומחוברות 80-90% מבלי להפריע tהוא התאים.
  2. Aliquot 3-5 מ"ל של 1x PBS לכל צלחת תרבות, בעדינות רוק בקבוק אחד כדי לצפות את פני השטח של המנה, ובזהירות לשאוב PBS 1x. חזור עבור לשטוף 1x PBS שני.
  3. Aliquot 3 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לתוך כל מנה תרבות בעדינות רוק כדי מעיל באופן שווה את התאים עם טריפסין-EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות.
  4. העברת התאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב 4000 XG במשך 90 שניות.
  5. גלולה תא גלולה ב 1 מ"ל של DMEM מלאה.
  6. ספירת תאים באמצעות haemocytometer. לחשב כמה שאינם pyrogenic ומנות תרבית תאים קלקר 100 מ"מ נדרשים להשיג צפיפות זריעה ראשונית של כ 2,500-5,000 תאים לס"מ 2.
  7. תרבית תאים בינוני מלאה טרום חמה שנעשה צעדי 1.2 או 1.3 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 30-45.
  8. לטהר את הבקבוק הבינוני בקבוקון תא עם 70% אתנול. מכאן ואילך כליש לבצע פעולות בסביבה נקייה מחיידקים.
  9. Aliquot 6 מיליליטר של DMEM המלא לתוך צלחות תרבית תאים רבות 100 מ"מימ נדרשו להשתמש כל הנפח של תאים קפואים בתוך צפיפות הזריעה שצוינה בשלב 2.6.
  10. מעבירים את נפח תא ההשעיה המחושב בשלב 2.6 לכל אחד את הכלים תרבות 100 מ"מ. רוק כל צלחת באופן ידני כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני השטח של הצלחת.
  11. מניחים את צלחת תרבות 100 מ"מ תא זרע בחממה ב 37 ° C באווירה 2 5% CO. אפשר תאים כדי לדגור לפחות 24 שעות לפני הצעדים הבאים.

3. Subculturing

  1. צג כל מנת תרבית תאים תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את אחוז התאים confluency (תאי% מכסים את השטח של המנה). חזור תאי החממה הבינוני מלאים מראש חמים 1x PBS. המשך לשלב הבא אם התאים הם 80-100% ומחוברות.
  2. בזהירות לשאוב את המדיום בילה מבלי להפריעתאים בכל צלחת תרבות.
  3. Aliquot 3-5 מ"ל של 1x PBS לכל צלחת תרבות, בעדינות רוק בקבוק אחד כדי לצפות את פני השטח של המנה, ובזהירות לשאוב PBS 1x. חזור עבור לשטוף 1x PBS שני.
  4. Aliquot 3 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA לתוך כל מנה תרבות בעדינות רוק כדי שווה לצפות את התאים עם טריפסין-EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות.
  5. במהלך הדגירה זה, aliquot 10 מ"ל של מדיום מלאה לתוך הכלים תרבות רבים ככל נדרשים להשיג צפיפות התאים של 2,500-5,000 תאים לס"מ 2.
  6. כאשר התאים יש מנותקים מן הצלחת, להוסיף במהירות 3 מיליליטר של מעכבי טריפסין 1x מוגדרים בעדינות מערבולת את מנת דקות 1 כדי להבטיח שכל של טריפסין-EDTA נוטרל.
  7. העברת התאים מנותקים לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל ומניחים בצד. הוסף 3 מ"ל 1x PBS על צלחת לאסוף כל התאים הנותרים, ולהעביר כי אל הצינור צנטריפוגות אותו 15 מ"ל.
  8. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG 150במשך 5 דקות.
  9. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מ"ל של מדיום מלאה.
  10. ספירת תאים באמצעות haemocytometer וזרעי 150 מ"מ צלחות תרבות המכיל 15 מ"ל של מדיום מלאה להשיג צפיפות התאים של 2,500-5,000 תאים לס"מ 2. השתמש בשני 150 מ"מ עבור כל assay מחייב כובע.
    הערה: דיפוזיה חמצן לתאים דרך תקשורת נוזלית תלויה בנפח 36. מומלץ לשמור על נפח התקשורת העקבית בין ניסויים אם תאים חסידים או תאים בתרחיף משמשים. מדיה ניתן מראש מותנה (וטופחו על ידי תחנת עבודה עבור 24 שעות כפי שפורט דיון) להימנע variabilities אלה דיפוזיה.
  11. מניח את כלי התרבות הזורעת בחממה ב 37 ° C באווירת 2 5% CO. אפשר תאים כדי לדגור לפחות 24 שעות לפני שתמשיך את הצעדים הבאים.

4. חשיפה Physioxic

  1. הצג את התאים תחת המיקרוסקופ. לקבלת BESתוצאות t, להבטיח כי תאים הם ומחובר 70-80% עבור חשיפת 24 שעות, ומחוברות 50-60% עבור חשיפת hr 48, ו ומחוברים 40-50% עבור חשיפת 72 שעות.
  2. מניח את התאים לתוך תחנת עבודה היפוקסיה בפעם הרצויה (24, 48, או 72 שעות בהתאם הניסוי).
  3. הגדר את העבודה על physioxia המתאים.
    הערה: לדוגמה, הגדרה 3% O 2 תלווה 5% CO 2 ו -92% N 2.
    הערה: אם תנודות חמצן בטווח דינאמי הרצוי על מסגרת זמן ספציפית, תוכנית לוח הזמנים לתוך המכשיר או באופן ידני את הגדרות חמצן בתדירות הרצויה.
  4. הגדר את הלחות ל -60%. אווירת העבודה מאוד יבשה בכל זאת, ומדיה תתאדה ניכרת במהלך ניסויים ארוכים (> 48 שעות). לשמור עתודת תקשורת בבקבוק תרבית תאים בתוך תחנת העבודה (כך שהתקשורת היא equilibrated עם אווירת תחנת העבודה) כדי לחדש את התקשורת דיס תרבית תאיםהס.
    הערה: כל פתרון יהיה אינטראקציה עם תאים לפני תמוגה (כגון PBS טריפסין-EDTA) צריך להיות מראש מותנה למשך 24 שעות לפני השימוש בתוך תחנת עבודה היפוקסיה כך החמצן המומס equilibrates עם חמצן אטמוספרי 36.
  5. שמור את התאים בתוך תחנת עבודה עד תמוגה.

5. חוצצים הכנות לקראת Assay Cap-מחייב

  1. כן 1x טריס שנאגר מלוח (TBS).
    1. בשנת 800 מ"ל של DH 2 O, לפזר 8.76 גרם NaCl ו 6.05 גרם טריס הבסיס.
    2. תביאו את פתרון ה- pH הסופי של 7.4 באמצעות 1 M HCl.
    3. תביאו את הנפח הסופי ל 1 L באמצעות DH 2 O.
  2. הכן חיץ תמוגה הלא denaturing. כן תמוגה חיץ היום של assay מחייב הכובע. הפוך חיץ תמוגה נוסף כדי לשטוף את החרוזים הריקים agarose ואת agarose GTP γ-aminophenyl-מ 7 חרוזי C10-צמודים (צעדי 7.9 ו 7.13).
    1. ב 7 מ"ל של DH 2 O, להוסיף 160 μl 5 M NACl, 160 μl 1 M טריס- HCl pH 7.4, 40 μl 200 מ"מ NaF, 40 μl 1 M MgCl 2, ו -40 μl 1 מ"מ נתרן orthovanadate.
    2. הוסף 40 μl של Igepal לפתרון 7 מ"ל. חותכים את קצה פיפטה כדי לסייע לאחזר Igepal כפי שהוא צמיגה מאוד.
    3. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה, או מערבולת, הפתרון 7 מ"ל עד שכל Igepal כבר מומס.
    4. הרם את הנפח הסופי של פתרון 8 מיליליטר ולשמור על קרח.
  3. כן 4x נתרן Dodecyl סולפט (SDS) -PAGE לדוגמא הצפה.
    1. בכוס, לשלב 16 מ"ל 1 M טריס-HCl pH 6.8, 12.64 מ"ל גליצרול, ו -8 מ"ל dithiothreitol (DTT).
    2. להוסיף 3.2 גרם של SDS ו 0.16 גרם של כחול bromophenol. אפשר אבקה לפזר באופן מלא על ידי ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי.
    3. Aliquot לתוך 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

6. תא תמוגה

  1. הכן חיץ תמוגה הלא denaturing ולשמור על הקרח יום הדואר מחייב כובע assay.
  2. טרום חם 1x PBS טריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. Aliquot 980 μl של חיץ תמוגה לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge עבור כל assay מחייב כובע מבוצע.
  4. הוסף 10 μl של 4- (2-aminoethyl) hydrochloride benzenesulfonyl פלואוריד 10 μl של קוקטייל מעכבי פרוטאז 100x אל 980 μl של חיץ תמוגה. שמור על הקרח.
  5. מחק את התקשורת מכל מנה 150 מ"מ מיכל פסולת בתוך תחנת עבודה היפוקסיה.
  6. שוטפים את התאים עם 3-4 מ"ל של PBS 1x חם וזורקים את כל הנוזל.
  7. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA חם על כל מנה ולתת לשבת במשך 2 דקות או עד תאים לא הם דבקו יותר לצלחת.
  8. בעזרת פיפטה, העברת תאים של צלחת אחת לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. חזור על פי הצורך, כך כל צלחת של תאים מועבר צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge נפרד.
  9. צנטריפוגה 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ב 6000 XG במשך 90 שניות to גלולת התאים.
  10. לשאוב טריפסין בעזרת פיפטה מבלי להפריע גלולה. אם הגלולה מופרת, מחדש צנטריפוגות צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ב -6,000 XG במשך 90 שניות.
  11. שוטפים את התאים עם PBS 1x חם על ידי pipetting בעדינות 200 μl של PBS לתוך הצינור בדיוק מעל גלולה. Re-צנטריפוגה אם הגלולה מופרת.
  12. לשאוב PBS מבלי להפריע גלולה.
  13. פיפטה 500 μl מן 1 מ"ל מוכן פתרון חיץ תמוגה על גלולה הסלולרית הראשונה. Resuspend גלולה לחלוטין על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  14. מערבבים את התאים resuspended עם גלולה התא השני ו resuspend גלולה השני על ידי pipetting למעלה ולמטה. חזור על תהליך זה עד שכל הכדורים שולבו ו resuspended עבור כל דגימה.
  15. מערבבים את lysate עם למאגר תמוגה 500 μl של שנותרו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  16. הסר דגימות מתחנת העבודה היפוקסיה.
    הערה: לאחר הוספת חיץ תמוגה,השלבים הבאים ll הם להתבצע באוויר הסביבה כמו תחנת עבודת היפוקסיה מוגדרת 37 מעלות צלזיוס, השלבים הבאים הם כדי להתבצע קר (4 מעלות צלזיוס או על קרח).
  17. Lyse את התאים באמצעות תסיסה עדינה על ידי החלפה של דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5-2 שעות.
  18. צנטריפוגה התאים lysed ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת הסלולר.
  19. מעבירים את lysate אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש וזורקים את הכדור.
  20. שמורת חלק (5-10%) של supernatant לשמש כביקורת קלט כל תא lysate לניתוח כתם המערבי בעתיד.

Assay 7. מחייב יתר

  1. עבור כל דגימה, להעביר 50 μl של slurry מלא חרוז ריק agarose ו -50 μl של agarose GTP γ-aminophenyl-מ 7 slurry החרוז C10 הצמוד להפריד 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. השתמש במספריים כדי להסיר את קצה פיפטה כדי להקל על אוסף של slurry חרוז.
  2. גלולה ב החרוזיםy centrifuging את התערובת הדלילה XG ב 500 במשך 30 שניות.
  3. הסר את supernatant בזהירות resuspend את החרוזים 500 μl של TBS.
  4. חזור על שלבים 7.2 ו -7.3. גלולת חרוזי XG ב 500 במשך 30 שניות ולהסיר supernatant.
  5. מעבירים את supernatant המכיל את lysate משלב 6.19 אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את החרוזים agarose ריק.
    הערה: חרוזי agarose הריקים לפעול כצעד טרום סליקה להסיר חלבונים מן lysate כי אינטראקציה הלא במיוחד עם החרוז.
  6. דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C עם תסיסה עדינה.
  7. גלולת חרוזי agarose הריק על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות.
  8. מעבירים את lysate אל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל את החרוזים γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10.
  9. שטפו את החרוזים agarose ריק על ידי resuspending את החרוזים 500 μl של חיץ תמוגה, pelleting את החרוזים על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות, ולהשאיר את supernatant. חזרו על התרגיל ארבע פעמים עבור סכום כולל של חמישה שוטף.
  10. Resuspend החרוזים agarose ריק במאגר מדגם 1x SDS-PAGE, ומרתיחים חרוזים עבור 90 שניות על 95 מעלות צלזיוס. חנות ב -20 ° C לניתוח כתם מערבי בעתיד לראות האם החלבון של עניין נקשר הלא במיוחד כדי החרוז.
  11. דגירה lysate עם חרוזים צמודי C10 agarose GTP γ-aminophenyl-מ 7 עם תסיסה עדינה במשך שעה 1 ב 4 ° C כדי ללכוד חלבונים קושרי כובע.
  12. גלולת חרוזי γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות. בטל supernatant.
  13. שטפו את החרוזים γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 ידי חזרה צעד 7.9.
  14. Resuspend את החרוזים 600 μl של חיץ תמוגה.
  15. להוסיף GTP לריכוז סופי של 1 מ"מ.
  16. דגירה חרוזים γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 + 1 מ"מ GTP עם תסיסה עדינה במשך שעה 1 ב 4 ° C.. הערה: זהיהיה לנתק חלבונים אינטראקציה הלא במיוחד עם GTP מ 7 (כלומר, גם אינטראקציה עם GTP הלא מפוגל).
  17. גלולת חרוזי γ-aminophenyl-מ 7 GTP agarose צמודות C10 על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 30 שניות.
  18. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדשה ולהוסיף 200 μl של חיץ מדגם 4x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 מ"מ DTT, 2% SDS, 0.1% bromophenol כחול, ו -10% גליצרול). חנות מדגם שליטת GTP ב -20 ° C לניתוח כתם מערבי בעתיד 37. שטפו את החרוזים על ידי חזרה על שלב 7.9.
  19. Resuspend החרוזים במאגר מדגם 1x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 מ"מ DTT, 2% SDS, 0.1% bromophenol כחול, גליצרול 10%), ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. אחסן את מ 7 חלק GTP הנכנס ב -20 ° C לניתוח כתם המערבי בעתיד 37.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח יכולת Cap-מחייב תגובה חמצן של eIF4E ו eIF4E2 בבית מ 7 טור GTP זיקה

איורים 1 ו -2 מייצגים כתמים המערבי של טיהור זיקה מ 7 GTP טיפוסי של שני חלבונים כובע מחייב מרכזי בתגובה לתנודות חמצן בשני שורות תאים אנושיים: תאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות אדם מן המעלה הראשונה (HRPTEC) ב קרצינומה F

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח של חלבוני קושרי כובע בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיסיולוגיים יכול לאפשר זיהוי של גורמי ייזום תרגום רומן מוסדר חמצן. הזיקה של הגורמים הללו עבור המכסה '5 של mRNA או חלבונים הקשורים כובע אחרים ניתן למדוד את עוצמת הקשר שלהם אל מ 7 GTP צמודים חרוזי Agarose. אזהרה אחת של טכניקה זו היא כי הוא מודד את הפוטנציאל מחייב כובע של חלבונים-ימסו פוסט, אבל זה מבוצע בתנאים שאינם denaturing המקיימים אינטראקציות חלבון-חלבון ופוסט translational שינויים (PTMs). אינטראקציות חלב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ומשרד המחקר והחדשנות של אונטריו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked חרוזים JenaBioscienceAC-1555Agarose-linked m7GTP
100 מ"מ צלחת תרביתקורנינג877222 10 ס"מ צלחת תרבית
150 מ"מThermofisher130183צלחת תרבית 15 ס"מ
AEBSF הידרוכלורידACROS אורגניA0356829AEBSF
חרוזי אגרוזJena Bioscience AC-0015בקרת חרוזי אגרוז
ברומופנול בלופישרBP112-25רכיב של מאגר טעינה SDS-PAGE
1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגהFroggaBio1210-00Sמשמש לצנטריפוגה בנפחים קטנים
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפישר1495970Cמשמש בתרבית תאים ראשוניים
מעכב טריפסין מוגדרפישרR007100DTI
DithiothreitolFisherBP172-25DTT
מדיום תאי אפיתל (ערכה מלאה)ScienCell4101כולל תוספי סרום וגורמי גדילה)
גליצרולפישרBP229-1רכיב של מאגר טעינה SDS-PAGE
100 מ"מ גואנוזין 5'-טריפוספט, 1 מ"לJena Bioscience272076-0251MGTP
HCT116 קרצינומה של המעי הגסATCCCCL-247קו תאי סרטן אנושי
תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים של הכליה האנושיתATCCPCS-400-010HRPTEC
Hyclone DMEM/High GlucoseGE Life SciencesSH30022.01מדיה סטנדרטית לתרבית תאים אנושיים
Hyclone תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןGE Life SciencesSV30010רכיב אנטיביוטי של DMEM
H35 HypOxystationHypoxygenN/Aתחנת עבודה היפוקסיה
Igepal CA-630MP ביו-רפואי2198596רכיב דטרגנט של מאגר ליזה
מונופוטסיום פוספטפישרP288-500KH2PO4
אשלגן כלוריפישרP217-500KCl
מגנזיום כלורידפישרM33-500MgCl2
נתרן כלוריפישרBP358-10NaCl
נתרן פלואורידפישר5299-100NaF (רכיב מעכב פוספטאז של מאגר ליזה)
דיסודיום פוספטפישר5369-500Na2HPO4
Premium Fetal Bovine SerumSeradigm1500-500
קוקטייל מעכב פרוטאז FBS (100x)איתות תאים58715רכיב של מאגר ליזה
נתרן דודציל סולפטפישרBP166-100SDS
נתרן אורתוואנדאטסיגמא56508Na3VO4
Tris BaseFisherBP152-5רכיב של מאגרים
0.05% טריפסין-EDTA (1x)Life Technologies2500-067טריפסין המשמש לניתוק תאים נצמדים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90(2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394(2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cap binding ProteinsOxygen RegulationHypoxia Workstationm7GTP Agarose BeadsAffinity PurificationWestern Blot AnalysisCell Lysis ProtocolPhysiological Oxygen ConditionsTranslation Initiation FactorsGTP Wash Specificity

מאמרים קשורים