הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

5.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55135

⸱

20 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio, 2Xiangya School of Medicine, Cental South University, 3Greehey Children’s Cancer Research Institute, University of Texas Long School of Medicine at San Antonio

במאמר זה

סיכום

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

תקציר

תגובות נוגדנים מוכשרות דרך מספר תהליכי תא B קריטי-מהותי, לרבות היפרמוטציה (SHM), מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) התמיינות תאים פלזמה. בשנים האחרונות שינויים epigenetic או גורמים, כגון היסטון deacetylation מיקרו Rna (miRNAs), הוכחו אינטראקציה עם תוכניות גנטי B-cell לעיצוב תגובות נוגדנים, בעוד כבר מצאו את תפקוד של גורמים epigenetic להוביל נוגדן עצמי תגובות. ניתוח miRNA הגנום כולו והביטוי mRNA בתאים B בתגובה מאפננים epigenetic חשוב להבנת epigenetic ויסות התגובה נוגדן והפונקציה B-cell. . הנה, נדגים פרוטוקול גרימת B תאים לעבור התמיינות CSR ותא פלזמה, מתייחס האלו תאי B עם מעכבי היסטון deacetylase (HDAC) (HDIs), וניתוח mRNA microRNA הבעה. ב פרוטוקול זה, ננתח ישירות רצפי DNA (cDNA) משלימים באמצעות הדור הבא רצפי mRNA (mRNA-seq) וטכנולוגיות miRNA seq, מיפוי של הרצף מקריאה הגנום, ואת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית)-PCR. עם הגישות הללו הגדרנו, בתאי B המושרה לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות, HDI, הרגולטור epigenetic, באופן סלקטיבי ממיקרו miRNA והביטוי mRNA ומשנה בידול CSR ותא פלזמה.

מבוא

סימני epigenetic או גורמים, כגון מתילציה DNA, שינויים posttranslational היסטון אי קידוד RNAs (כולל מיקרו Rna), לווסת את תפקוד התא על ידי שינוי בביטוי גנים1. שינויים epigenetic לווסת את פונקציית B לימפוציטים, כגון אימונוגלובולינים מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) היפרמוטציה (SHM), התמיינות תאי זיכרון B או תאים פלזמה, ובכך להתכוונן נוגדן של נוגדן עצמי תגובות2,3. CSR SHM אנושות דורשים הפעלה-induced cytidine deaminase (סיוע, המקודדים כ- Aicda), אשר הוא מאוד המושרה בתאי B בתגובה תלויי-T ו- T-עצמאית אנטיגנים4. בתאי B class-החלפת/hypermutated נוספות להבדיל לתאי פלזמה, אשר מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים אופנה אנושות תלויה ההבשלה לימפוציטים B-induced חלבון (Blimp1, בקידוד Prdm1) 15. שינויים epigenetic נורמלי בתאי B עלול לגרום תגובות נוגדנים סוטה/נוגדן עצמי, אשר יכול להוביל תגובה אלרגית או מחלת חיסון עצמי1,4. הבנת epigenetic כמה גורמים, כגון miRNAs, לווסת תא B-מהותי ביטוי גנים הוא לא רק חשוב להתפתחות חיסון, אך היא חיונית כדי לחשוף את המנגנון של תגובות נוגדנים חריג/נוגדן עצמי פוטנציאליים.

היסטון acetylation deacetylation שינויים של משקעי ליזין על חלבוני היסטון מזורז בדרך כלל על ידי היסטון acetyltransferase (כובע) היסטון deacetylase (HDAC) בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. לבצע שינויים אלה להוביל הנגישות עולה או יורדת של כרומטין, עוד יותר לאפשר או למנוע את הכריכה של גורמי שעתוק או חלבונים ל- DNA ואת משינוי של ג'ין ביטוי5,6, 7 , 8. מעכבי HDAC (HDI) הם קבוצה של תרכובות להפריע הפונקציה של HDACs. כאן השתמשנו HDI (VPA) לכתובת ברגולציה של HDAC על הפרופיל ביטוי גנים פנימיים של תאים B ועל מנגנון שלה.

miRNAs הם קטנים, ללא קידוד RNAs כ 18 עד 22 נוקלאוטידים אורך הנוצרות דרך מספר שלבים. miRNA מארח את הגנים הם עיבד ויוצרים מיקרו Rna ראשוני סיכת ראש (pri-miRNAs). והם מיוצאים אל הציטופלסמה, איפה pri-miRNAs הם עיבוד נוסף לתוך קודמן miRNAs (pre-miRNAs). לבסוף, בוגרת miRNAs נוצרות דרך החריץ של טרום-miRNAs. miRNAs לזהות את רצפי משלימה באזור 3' לא מתורגם של6,mRNAs7שלהם היעד. דרך להשתיק post-transcriptional, miRNAs לווסת את פעילות הסלולר, כגון התפשטות, התמיינות אפופטוזיס10,11. כיוון miRNAs מרובים ניתן לייעד את ה-mRNA זהה, miRNA יחיד אחד ניתן לייעד באופן פוטנציאלי mRNAs מרובים, חשוב לקבל תצוגה לפי הקשר של פרופיל ביטוי miRNA כדי להבין את הערך של הפרט ואת השפעת miRNAs קולקטיבית. miRNAs הוכחו להיות מעורב B-cell פיתוח, בידול היקפיים, כמו גם בידול ספציפיות שלב B-cell נוגדנים בתגובה, מחלת חיסון עצמי1,4,9. 3' UTR של Aicda , Prdm1, ישנם מספר מאומתים או החזוי אבולוציונית שנשמרת אתרי ניתן לפלח מאת miRNAs8.

אפנון epigenetic, לרבות שינוי היסטון שעתוק שלאחר miRNAs, להציג דפוס ספציפיות שלב התקנה מסוג תא ותא של ביטוי גנים9. כאן, אנו מתארים שיטות כדי להגדיר את אפנון בתיווך HDI של miRNA ואת הביטוי mRNA, CSR, ו פלזמה תאית התמיינות. אלה כוללים את הפרוטוקולים עבור גרימת B תאים לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות; לטיפול תאי B עם HDI; עבור ניתוח miRNA והביטוי mRNA מאת לרביעיית-PCR miRNA-seq, mRNA-seq10,11,12,8,13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים והטיפול שימוש ועדות של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז סן אנטוניו.

1. גירוי של העכבר בתאי B CSR, פלזמה תאית התמיינות של טיפול HDI

  1. הכנה של הטחול תא המתלים
    הערה: לבצע את כל השלבים ב תא למינארי מלבד העכבר המתת חסד, לנתיחה.
    1. Euthanize ספציפי פתוגן ללא C57BL/6J העכבר (מגיל 8-12 שבועות) באמצעות אינהלציה 2 CO.
    2. שכב בעכבר בלוח ויבתר הבטן פונה כלפי מעלה. להצמיד כל מטר של העכבר עם מזרקים. אל תדאגי, 1.5 - ב.
    3. לחטא את העור באמצעות מגבונים לחים ספוג אתנול 70%-
    4. השתמש ערכה אחת של כלי ניתוח בלוק (מלקחיים ומספריים ויבתר) כדי לחתוך העור מתחת קשת הצלעות להמחיש את הטחול (בצד שמאל של הבטן, ממש מתחת הכבד).
    5. להשתמש מלקחיים סטרילי אחר ומספריים מספריים כדי לחלץ את הטחול, הנמצא מתחת שכדור גדול של הקיבה, על-ידי מחבר חובק למעקה הטחול בעדינות עם מלקחיים, כורתים את כל רקמת חיבור עם לנתח. הקפד להסיר את כל רקמת חיבור-
    6. מקום הטחול לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge המכיל 1,000 µL בינוני RPMI1640 מלאה (RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% לא פעיל חום העובר עגל סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין, פניצילין µg/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין, µg 0.25 mL/המפוטריצין ו- 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol).
    7. מניחים מסננת תא 70-מיקרומטר שפופרת צנטרפוגה חרוט פוליפרופילן 50-mL ויוצקים הטחול מהצינור microcentrifuge על גבי מסננת התא. להשתמש מועכים בעדינות הטחול דרך מסננת קצה צינור פוליפרופילן צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל. לשטוף את התא מסננת 15-20 מ של מדיום מלאה.
    8. ספין למטה התאים ב- 350 גרם x 5 דקות, להשליך תגובת שיקוע.
    9. להסיר כדוריות דם אדומות של המתלים תא הטחול. Resuspend בגדר תא במאגר פירוק ACK (5 מ"ל לכל הטחול). תקופת דגירה של 4 דקות בטמפרטורת החדר ברעידות ומדי פעם, ואז להרוות 25 מ של מדיום מלאה.
    10. ספין למטה את התאים ב- 350 גרם x עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 1 או 10 מ"ל של מדיום מלאה. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer.
  2. B-cell בידוד
    הערה: B לבודד תאים לפי בחירה שלילי בעקבות היצרן ' s הוראות. Non-B תאים המיועדים להסרת עם biotinylated נוגדנים נגד תאי-B (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6C/G (Gr-1) ו- TER119) ואת מצופים streptavidin חלקיקים מגנטיים. צינור עגול-התחתון
    1. הכן השעיה תא 0.25 ל 2 מ"ל של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל מלאה במדיום פוליסטירן סטרילי 5 מ ל (12 x 75 מ מ). להוסיף סרום עכברים רגילה (50 µL/mL) הדגימה.
    2. בידוד µL/mL להוסיף 50 בקוקטייל המדגם. לערבב את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה, למטה 2 - 3 פעמים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
    3. להוסיף µL/mL 75 מצופים streptavidin חלקיקים מגנטיים המדגם. לערבב את התערובת על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים דגירה 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להוסיף בינוני RPMI 1640 מלאה. לערבב את התאים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים.
    5. למקם את הצינור (ללא המכסה) לתוך המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2.5 מינימלית לשפוך את תגובת שיקוע המכיל תאי B לא נגעה לתוך צינור חרוטי 15-mL-
    6. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer הכתם Trypan Blue. להעריך את הטוהר של תאי B על ידי ניתוח cytometry זרימה של סמנים משטח B-cell, כגון B220 ו- CD19.
  3. B-cell גירוי וטיפול HDI
    1. Resuspend בתאי B מטוהרים בינוני מלא RPMI 1640-ריכוז סופי של 0.3 x 10 6 תאים למ"ל.
    2. השתמש צלחת התרבות 48-ובכן תא תרבית תאים. כל טוב, הוסיפו 1 מ"ל של B-cell מטוהרים ההשעיה (0.3 x 10 6 תאים למ"ל), LPS (ריכוז סופי µg 3/mL) מ- Escherichia coli, IL-4 (ריכוז סופי 5 ng/mL), ו- 0 או 500 מיקרומטר HDI (חומצה ולפרואית; VPA).
    3. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עבור 60 h לרביעיית-PCR וניתוח תפוקה גבוהה mRNA - ו miRNA-רצף, או h 96 לניתוח cytometry זרימה.
  4. Flow cytometry ניתוח של CSR ו פלזמה תאית התמיינות
    1. לאחר h 96 של תרבות, לנתק את התאים מכל קידוח מאת pipetting התאים למעלה ולמטה מספר פעמים. העברת התליה תא לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge. ספין למטה התאים ב- 350 גרם x עבור 5 דקות באמצעות צנטריפוגה ספסל-העליון ולמחוק את תגובת שיקוע.
    2. Resuspend התאים עם 100 µL HBSS מאגר המכיל 1% BSA ו- 0.5 ng/mL fluorescein (FITC) - מצומדת עז אנטי-נוגדן IgM העכבר – (אלב) , 0.2 ננוגרם למ"ל allophycocyanin (APC)-העכבר אנטי חולדה מצומדת IgG1 monoclonal Ab (mAb), 0.2 ננוגרם למ"ל phycoerythrin (PE)-מצומדת עכבר עכבר אנטי B220 mAb 0.2 ננוגרם למ"ל עכברוש PE-Cy7-מצומדת העכבר אנטי CD138 mAb, 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-מ)-
    3. דגירה התאים עם פלורסצנטיות מצומדת נוגדנים (שלב 1.4.2) בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות
    4. לרחוץ את התאים עם 1 מ"ל של HBSS עם 1% BSA.
    5. ספין למטה התאים ב g x 1,500 למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה benchtop להשליך תגובת שיקוע.
    6. Resuspend תאי µL 300 של HBSS עם 1% BSA ולהעביר התליה תא ל צינור עגול-התחתון פוליסטירן. לכסות את הצינור עם נייר כסף כדי למנוע חשיפה קלה.
    7. ניתוח cytometry זרימה בצע על השעיה תא בודד. איסוף אירועים 50,000 עבור כל דגימה פיצוי ואירועים 250,000 על הדגימות אחרים. לנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ציוד.
    8. לשלול את הלכלוך ואת doublets באמצעות שער הגיאומטריה הדופק (FSC-H-FSC-A והאס-H x האס-A). בהתאם שער העלילה על 7-מ כדי לא לכלול תאים מתים.

2. תפוקה גבוהה mRNA-Seq

  1. לאחר 60 h של תרבות, לחלץ את הרנ א סה כ 2-4 × 10 6 תאים באמצעות ערכת בידוד RNA הכולל לשחזור RNA קטנים בעקבות היצרן ' s הוראות. כוללים DNase אני שלב הטיפול.
  2. לוודא את תקינות RNA באמצעות של bioanalyzer, בעקבות היצרן ' הוראות s.
  3. השתמש 500-1, 000 ng של RNA סך באיכות גבוהה (RNA תקינות מספר רין > 8.0) עבור ה-RNA-seq הכנה ספריה RNA מסחריים מדגם pערכת נציג בעקבות היצרן ' הוראות s.
  4. מאגר של ספריות ה-mRNA בודדות-seq בהתבסס על שלהם בהתאמה מדד 6-bp חלקים המתאמים, רצף של הספריות ב- bp 50/רצף. להשתמש במערכת ה-DNA תפוקה גבוהה על פי היצרן ' פרוטוקולים s.
  5. לאחר רצף לברוח, demultiplex עם CASAVA כדי ליצור את קובץ fastq עבור כל דגימה. לבצע קריאות מיפוי וניתוח ביואינפורמטיקה, כמו המתוארים להלן 11.
  6. יישר כל קריאות רצף עם הפניה הגנום שלהם (UCSC העכבר הגנום לבנות mm9) באמצעות הגדרות ברירת המחדל TopHat2 14. לעבד את הקבצים באם יישור באמצעות HTSeq-count כדי להשיג את ספירת לכל הגנים בדגימות כל.

3. תפוקה גבוהה miRNA-Seq

  1. µg ng-1 השתמש 100 של RNA סך באיכות גבוהה, כפי המבושלות צעד 2.1, להכנה ספריית ה-RNA-seq קטן באמצעות ערכת ה-RNA-seq מסחרי קטן.
  2. Ligate 3 מנוונת ' מתאם אל 5 ′ הקצוות של ההתחלה מולקולות RNA קטנים עם ערכת מצדו מסחרי. מאתרים ומפסיקים את 5 מנוונת ' מתאם על גבי 3 ′ הקצוות של ההתחלה מולקולות RNA קטנים עם ערכת מצדו מסחרי. להמיר את הרנ א cDNA על-ידי שעתוק במהופך ומגבירים את ספריית ה-RNA-seq קטן על ידי הגברה PCR עם ערכות מסחריות.
  3. השתמש TBE 6% ילידי ג'ל דף כדי לבודד את ספריית ה-RNA-seq קטן הסופי. להפעיל את הג'ל עם מאגר X TBE 1 ב- 200 וולט עד הלהקה bromophenol כחול מעקב לצבוע סיומו התחתון של הג'ל (0.5 - 1 ס מ)-
  4. להסיר את הג'ל הזכוכיות, כתם עם אתידיום ברומיד (0.5 µg/mL במים) במיכל נקי עבור 2-3 דקות הג'ל להקות transilluminator UV או כלי אחר של תיעוד ג'ל Visualize.
  5. לחתוך החוצה את הלהקה ~ 150-bp באמצעות סכין גילוח נקי ולמקם אותו לתוך צינור 1.7 mL-
  6. לחלץ את הדנ א באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הוראות יצרן.
  7. לבדוק את התפלגות גודל הספרייה הסופי עם assay DNA מסחרי רגישות גבוהה וריכוז עם וזמינותו המסחרית dsDNA לכל היצרנים ' הוראות.
  8. מאגר של הספריות עבור הגברה ורצף עוקבות לרוץ עם מערכת רצף ה-DNA תפוקה גבוהה מסחרי לכל היצרן ' פרוטוקולים s.
  9. Demultiplex עם CASAVA כדי ליצור את קובץ fastq עבור כל דגימה לפי היצרן ' פרוטוקולים s.
  10. לניתוח קטן RNA-seq של כל דגימה, להשתמש הבהוב ליישור RNA קטנים לכל היצרן ' s פרוטוקולים.
    1. להסיר קריאות כי מיושרים מזהמים, כמו המיטוכונדריה, rRNA, תחל וכן הלאה.
    2. ליישר את הנתונים להבשיל רצפים miRNA.
    3. ליישר את הנתונים כדי סיכת ראש לולאה רצפים (קודמן miRNA).
    4. יישור נתונים אחרים רצפים (באמצעות מסד הנתונים fRNA) קטן RNA 15.
  11. אחרי כל דוגמאות הן לכמת, להגדיר את miRNAs ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות שונות/דוגמאות. לחזות miRNAs המספקים לקהלי היעד הנבחר mRNAs או mRNAs זה ניתן לפלח מאת miRNA סלקטיבית באמצעות כלים חיזוי מקוון miRNA היעד, כגון TargetScan 16, מיקרוקוסמוס 17 PicTar 18 .
  12. אם אנליזה פונקציונלית ביאור או מסלול יש צורך, להגיש את הגנים החזוי תחכום מסלול לניתוח (IPA) או דוד.

4. כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR) של mRNAs ושל miRNAs

  1. ניתוח לרביעיית-PCR של mRNA
    1. RNA לחלץ מ 0.2-5 × 10 תאים 6 שימוש מסחרי הכולל RNA בידוד ערכה לשחזור RNA קטנים, בעקבות יצרן ' s הוראות. כוללים DNase אני שלב הטיפול.
    2. לסנתז cDNA של RNA הכולל עם מערכת סינתזה הראשון-strand cDNA באמצעות פריימר oligo-dT-
    3. לכמת cDNA מאת לרביעיית-PCR עם תחל המתאים באמצעות 2 x מיקס מאסטר בזמן אמת של PCR עם פרוטוקול הבאים: 95 ° C 15 s, 40 מחזורי 94 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 ס
    4. לבצע רכישת נתונים במהלך השלב סיומת 72 ° C ולבצע ניתוח עקומת ההיתוך מ- 72 עד 95 מעלות צלזיוס
  2. ניתוח לרביעיית-PCR של miRNA
    1. Aliquot RNA מדגימות מוכן בשלב 4.1.1.
    2. הפוכה-לתמלל הרנ א לתוך cDNA. להשתמש ערכת שעתוק במהופך microRNA מסחרי, בעקבות היצרן ' הוראות s.
    3. לבצע PCR בזמן אמת עבור microRNA באמצעות שילוב SYBR Green מאסטר PCR בזמן אמת עם 250 ננומטר miRNA בוגרת קדימה תחל בשיתוף עם פריימר הפוכה אוניברסלי. פריימר
      1. הפשרה 2 x מיקס מאסטר PCR miRNA ספציפיים פריימר לפנים, לאחור אוניברסלי בטמפרטורת החדר. לערבב את הפתרונות בודדים.
      2. להכין תערובת התגובה כדלקמן עבור אמצעי אחסון 25 תגובה µL-לכל-ובכן (בשימוש 96-ובכן PCR צלחות):
        2 x 12.5 מיקס מאסטר PCR µL
        miRNA קדימה תחל (2.5 μM) 2.5 µL
        יוניברסל הפוך פריימר (2.5 μM) 2.5 µL
        RN ללא ase water5 µL
      3. 22.5 להוסיף μL של התגובה שילוב צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 2.5 µL של תבנית cDNA (ng pg-3 50) הבארות צלחת בודדים.
      4. חותם בחוזקה את הצלחת הסרט. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g וטמפרטורת החדר.
      5. למקם את הצלחת הצנטרפוגה בזמן אמת, הפעלת התוכנית אופניים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 40 מחזורי 94 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 ס
    4. להשתמש בשיטת ΔΔCt לניתוח נתונים לרביעיית-PCR עם גיליון אלקטרוני. לנרמל את הביטוי של miRNAs רלוונטי ביטוי קטן גרעיני/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 ו- Snord70/SNORD70.
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. לבצע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע הערכים p על ידי לזווג אינטראקצית סטודנט ' s t - לבדוק בעזרת גיליון אלקטרוני, שקול ערכים p < 0.05 כמו משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול שלנו לטהר בתאי B להניח LPS (3 µg/mL) ו- IL-4 (5 ng/mL) עבור 96 h יכול לגרום 30-40% CSR כדי IgG1 ו ~ 10% של התמיינות תאים פלזמה. לאחר טיפול עם HDI (500µM VPA), נציג שירות הלקוחות כדי IgG1 ירד ל 10-20%, בעוד התמיינות תאים פלזמה ירד ל ~ 2% (איור 1). בתיווך HDI עיכוב של CSR אושר עוד יותר ע י מספרי ירידה של פוסט-רקומבינציה Iμ-Cγ1 ו- V בוגרHDJH-Cγ1 תעתיקים, אשר הם גולת הכותרת של CSR שהושלמו. כפי שהיא נמדדת לרביעיית-PCR, הביטוי של Aicd...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק גישות מקיף לזירוז תא B class מיתוג ובידול תאים פלזמה; כדי לנתח את השפעתם על ידי epigenetic מאפננים, כלומר HDI; כדי לזהות את ההשפעה של HDI על mRNA והביטוי miRNA בתאים אלה. רוב הגישות הללו יכולים לשמש גם כדי לנתח את השפעת גורם epigenetic על הביטוי mRNA/miRNA והפונקציה B-cell האנושי. לרביעיית-PCR וגישות mRNA-seq/miRNA-seq יכול לשמש גם כדי לנתח בתאי B מבודד עכברים שטופלו epigenetic מאפננים, כגון HDIs.

לווסת epigenetic עשוי להשפיע תא אחר פונקציות רבות כגון התפשטות תאים ואת הכדאיות,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH AI 105813 ו- AI 079705 (למחשב), הברית לזיהוי לופוס מחקר היעד בלופוס גרנט ALR 295955 (למחשב), המחקר דלקת מפרקים קרן מחקר לאומי להעניק (HZ). TS נתמכה על ידי ברפואת ילדים במרכז הרפואי, החולים Xiangya השנייה, אוניברסיטת דרום סנטרל, צ'אנגשה, סין, בהקשר של התוכנית הביקור של סטודנט לרפואה Xiangya-UT הספר של רפואה סן אנטוניו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57BL/6 עכבריםJackson Labs664
Corning cellgro RPMI 1640 בינוני (מוד) 1X עם L-גלוטמין (גודל: 6 x 500 מ"ל; עם L-גלוטמין)פישר סיינטיפיקMT 10-040-CV 
FBSHycloneSH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 מ"לFisher Scientific - HycloneSV3007901 
&בטא;-מרקפטואתנולפישר סיינטיפיק44-420-3250 מ"ל
מסנני תאי פלקוןפישר סיינטיפיק21008-952   
Trypan Blue Stain 0.04%GIBCO/Life Technologies/Inv15250
ACK מאגר ליזה פישר סיינטיפיקBW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamberפישר סיינטיפיק02-671-51B
EasySep מגנטתאי גזע טכנולוגיות18000
פלקון צינורות פוליסטירן עגולים עם כובעפישר סיינטיפיק14-959-1A
EasySep עכבר B ערכת בידוד תאיגזע Stem Cell Tech19854
מחט BD בלבד 18 מד 1.5 אינץ' שיפוע קצר 100/קופסה BD ביוסיינס 
PE/Cy7 נגד עכבר CD138 (Syndecan-1) נוגדןBioLegend 142513 (25 ug)
נוגדן PE-Cy7 B220BioLegend103222
7-AAD (1 מ"ג)Sigma AldrichA9400-1MG
APC נגד עכברים/אנושי CD45R/B220 נוגדןBiolegend103212
עכבר APC-IgG1 200 ומיקרו; gBiolegend406610
FITC נגד עכבר IgM נוגדןBiolegend406506
FITC נגד עכבר/אנושי CD45R/B220 נוגדןBiolegend103206
PE אנטי-אדם/עכבר CD45R (B220) (RA3-6B2)Biolegend103208
HBSS 1XFisher ScientificMT-21-022-CM
אלבומין סרום בקר, Fraction V, טיפול בהלם חום פישר סיינטיפיקBP1600-100
LPS 25 מ"ג (ליפופוליסכרידים מ- Escherichia coli 055: B5)סיגמא אולדריץ'L2880-25MG
עכבר רקומביננטי IL-4 (ללא נשא)BioLegend574302 (גודל: 10 ug)
מלח נתרן חומצה ולפרואיתסיגמא אולדריץ'P4543
SterilGARD e3 Class II סוג A2 ארון בטיחות ביולוגיתחברתבייקרSG404
חממת CO2 בקיבולת גדולה Thermo Scientific3950
אמבטיות מים בקרה דיגיטלית איזוטמפ: דגם 205פישר סיינטיפיק15-462-5Q
5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגולפישר סיינטיפיק  14-959-5
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל Corning CentriStar פישר סיינטיפיק 05-538-59A
1.7 מ"ל מיקרו-צינור, שקוףGenesee22-282
מהירות גבוהה יותר Easy Reader פלסטיק צנטריפוגה צינורות 50 מ"לפישר סיינטיפיק06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MTELMICM-6MT
רוטור 6MELMI6M
רוטור 6M.06ELMI6M.06
Drummond נייד Pipet-Aid XP Pipet ControllerDrummond Scientific4-000-101
25 מ"ל טיפים לפיפטה סרולוגיתפישר סיינטיפיק89130-900
10 מ"ל טיפים לפיפטה סרולוגיתפישר סיינטיפיק89130-898
5 מ"ל טיפים לפיפטה סרולוגיתפישר סיינטיפיק898130-896
צלחות 48 בארותפישר סיינטיפיק07-200-86
צנטריפוגה שולחנית Allegra 6,בקמן קולטר366802
GH-3.8A לא מקורר, אופקי, ARIES Smart BalanceBeckman Coulter366650
Allegra 25R צנטריפוגה ספסלית,בקמן קולטר
TA-15-1.5, זווית קבועהבקמן קולטר368298
פישר סיינטיפיק AccuSpin Micro 17פישר סיינטיפיק13-100-675
פישר סיינטיפיק מערבולת אנלוגית Fisher Scientific02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50)Qiagen217004
Direct-zol RNA MiniPrep KitZymo ResearchR2050
כלורופורם (כ-0.75% אתנול כחומר משמר/ביולוגיה מולקולרית)Fisher ScientificBP1145-1
סט דנאז נטול רנאז (50)QIAGEN79254
NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטריםThermo ScientificND-2000
Superscript III מערכת סינתזה של גדיל ראשון RT-PCRInvitrogen175013897
iTaq אוניברסלי SYBR Green SupermixBio-rad 172-5121
פישרברנד 96 בארות צלחות PCR עם חצאית למחצה, מארז של 25פישר14-230-244
אטמי דבק Microseal 'B'Bio-RadMSB-1001
MyiQ Optics ModuleBio-Rad170-9744
iCycler ChassisBio-Rad170-8701
ערכה אופטיתBio-Rad170-9752
BD LSR II מנתח ציטומטריית זרימהBD Biosciences
FACSDiva תוכנהBD Biosciences
FlowJo 10BD Biosciences
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2943CA
S200 Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I עבור Illuminaבקמן קולטרA288267
cBot אשכול Generation StationilluminaSY-312-2001
HiSeq 2000 Genome SequencerIlluminaSY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2IlluminaRS-122-2001
TruSeq ערכת הכנה לספריית RNA קטנהIlluminaRS-200-0012
NEXTflex Illumina קטן ערכת ריצוף RNA v3Bioo Scientific5132-05
2200 TapeStationAgilentG2964AA
305199 רוטור רוטור מקורר 369434

מקורות

  1. Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
  2. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
  3. Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631(2015).
  4. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
  5. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
  6. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  7. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
  8. White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
  9. Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
  10. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
  11. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
  12. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
  13. Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627(2015).
  14. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
  15. Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
  17. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  18. Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

BHDACmRNAmiRNARNAQRT PCR
הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.