גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה
במאמר זה
סיכום
תקציר
תגובות נוגדנים מוכשרות דרך מספר תהליכי תא B קריטי-מהותי, לרבות היפרמוטציה (SHM), מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) התמיינות תאים פלזמה. בשנים האחרונות שינויים epigenetic או גורמים, כגון היסטון deacetylation מיקרו Rna (miRNAs), הוכחו אינטראקציה עם תוכניות גנטי B-cell לעיצוב תגובות נוגדנים, בעוד כבר מצאו את תפקוד של גורמים epigenetic להוביל נוגדן עצמי תגובות. ניתוח miRNA הגנום כולו והביטוי mRNA בתאים B בתגובה מאפננים epigenetic חשוב להבנת epigenetic ויסות התגובה נוגדן והפונקציה B-cell. . הנה, נדגים פרוטוקול גרימת B תאים לעבור התמיינות CSR ותא פלזמה, מתייחס האלו תאי B עם מעכבי היסטון deacetylase (HDAC) (HDIs), וניתוח mRNA microRNA הבעה. ב פרוטוקול זה, ננתח ישירות רצפי DNA (cDNA) משלימים באמצעות הדור הבא רצפי mRNA (mRNA-seq) וטכנולוגיות miRNA seq, מיפוי של הרצף מקריאה הגנום, ואת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית)-PCR. עם הגישות הללו הגדרנו, בתאי B המושרה לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות, HDI, הרגולטור epigenetic, באופן סלקטיבי ממיקרו miRNA והביטוי mRNA ומשנה בידול CSR ותא פלזמה.
מבוא
סימני epigenetic או גורמים, כגון מתילציה DNA, שינויים posttranslational היסטון אי קידוד RNAs (כולל מיקרו Rna), לווסת את תפקוד התא על ידי שינוי בביטוי גנים1. שינויים epigenetic לווסת את פונקציית B לימפוציטים, כגון אימונוגלובולינים מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) היפרמוטציה (SHM), התמיינות תאי זיכרון B או תאים פלזמה, ובכך להתכוונן נוגדן של נוגדן עצמי תגובות2,3. CSR SHM אנושות דורשים הפעלה-induced cytidine deaminase (סיוע, המקודדים כ- Aicda), אשר הוא מאוד המושרה בתאי B בתגובה תלויי-T ו- T-עצמאית אנטיגנים4. בתאי B class-החלפת/hypermutated נוספות להבדיל לתאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים והטיפול שימוש ועדות של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז סן אנטוניו.
1. גירוי של העכבר בתאי B CSR, פלזמה תאית התמיינות של טיפול HDI
- הכנה של הטחול תא המתלים
הערה: לבצע את כל השלבים ב תא למינארי מלבד העכבר המתת חסד, לנתיחה.- Euthanize ספציפי פתוגן ללא C57BL/6J העכבר (מגיל 8-12 שבועות) באמצעות אינהלציה 2 CO.
- שכב בעכבר בלוח ויבתר הבטן פונה כלפי מעלה. להצמיד כל מטר של העכבר עם מזרקים. אל תדאגי, 1.5 - ב.
- לחטא את העור באמצעות מגבונים לחים ספוג אתנול 70%-
- השתמש ערכה אחת של כלי ניתוח בלוק (מלקחיים ומספריי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול שלנו לטהר בתאי B להניח LPS (3 µg/mL) ו- IL-4 (5 ng/mL) עבור 96 h יכול לגרום 30-40% CSR כדי IgG1 ו ~ 10% של התמיינות תאים פלזמה. לאחר טיפול עם HDI (500µM VPA), נציג שירות הלקוחות כדי IgG1 ירד ל 10-20%, בעוד התמיינות תאים פלזמה ירד ל ~ 2% (איור 1). בתיווך HDI עיכוב של CSR אושר עוד יותר ע י מספרי ירידה של פוסט-רקומבינציה Iμ-Cγ1 ו- V בוגרHDJH-Cγ1 תעתיקים, אשר הם גולת הכותרת של CSR שהושלמו. כפי שהיא נמדדת לרביעיית-PCR, הביטוי של Aicd.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק גישות מקיף לזירוז תא B class מיתוג ובידול תאים פלזמה; כדי לנתח את השפעתם על ידי epigenetic מאפננים, כלומר HDI; כדי לזהות את ההשפעה של HDI על mRNA והביטוי miRNA בתאים אלה. רוב הגישות הללו יכולים לשמש גם כדי לנתח את השפעת גורם epigenetic על הביטוי mRNA/miRNA והפונקציה B-cell האנושי. לרביעיית-PCR וגישות mRNA-seq/miRNA-seq יכול לשמש גם כדי לנתח בתאי B מבודד עכברים שטופלו epigenetic מאפננים, כגון HDIs.
לווסת epigenetic עשוי להשפיע תא אחר פונקציות רבות כגון התפשטות תאים ואת הכדאיות,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH AI 105813 ו- AI 079705 (למחשב), הברית לזיהוי לופוס מחקר היעד בלופוס גרנט ALR 295955 (למחשב), המחקר דלקת מפרקים קרן מחקר לאומי להעניק (HZ). TS נתמכה על ידי ברפואת ילדים במרכז הרפואי, החולים Xiangya השנייה, אוניברסיטת דרום סנטרל, צ'אנגשה, סין, בהקשר של התוכנית הביקור של סטודנט לרפואה Xiangya-UT הספר של רפואה סן אנטוניו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 עכברים | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 בינוני (מוד) 1X עם L-גלוטמין (גודל: 6 x 500 מ"ל; עם L-גלוטמין) | פישר סיינטיפיק | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 מ"ל | Fisher Scientific - Hyclone | SV3007901 | |
| &בטא;-מרקפטואתנול | פישר סיינטיפיק | 44-420-3250 מ"ל | |
| מסנני תאי פלקון | פישר סיינטיפיק | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK מאגר ליזה | פישר סיינטיפיק | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | פישר סיינטיפיק | 02-671-51B | |
| EasySep מגנט | תאי גזע טכנולוגיות | 18000 | |
| פלקון צינורות פוליסטירן עגולים עם כובע | פישר סיינטיפיק | 14-959-1A | |
| EasySep עכבר B ערכת בידוד תאי | גזע Stem Cell Tech | 19854 | |
| מחט BD בלבד 18 מד 1.5 אינץ' שיפוע קצר 100/קופסה | BD ביוסיינס | ||
| PE/Cy7 נגד עכבר CD138 (Syndecan-1) נוגדן | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| נוגדן PE-Cy7 B220 | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 מ"ג) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC נגד עכברים/אנושי CD45R/B220 נוגדן | Biolegend | 103212 | |
| עכבר APC-IgG1 200 ומיקרו; g | Biolegend | 406610 | |
| FITC נגד עכבר IgM נוגדן | Biolegend | 406506 | |
| FITC נגד עכבר/אנושי CD45R/B220 נוגדן | Biolegend | 103206 | |
| PE אנטי-אדם/עכבר CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| אלבומין סרום בקר, Fraction V, טיפול בהלם חום | פישר סיינטיפיק | BP1600-100 | |
| LPS 25 מ"ג (ליפופוליסכרידים מ- Escherichia coli 055: B5) | סיגמא אולדריץ' | L2880-25MG | |
| עכבר רקומביננטי IL-4 (ללא נשא) | BioLegend | 574302 (גודל: 10 ug) | |
| מלח נתרן חומצה ולפרואית | סיגמא אולדריץ' | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II סוג A2 ארון בטיחות ביולוגית | חברת | בייקרSG404 | |
| חממת CO2 בקיבולת גדולה | Thermo Scientific | 3950 | |
| אמבטיות מים בקרה דיגיטלית איזוטמפ: דגם 205 | פישר סיינטיפיק | 15-462-5Q | |
| 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול | פישר סיינטיפיק | 14-959-5 | |
| צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל Corning CentriStar | פישר סיינטיפיק | 05-538-59A | |
| 1.7 מ"ל מיקרו-צינור, שקוף | Genesee | 22-282 | |
| מהירות גבוהה יותר Easy Reader פלסטיק צנטריפוגה צינורות 50 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| רוטור 6M | ELMI | 6M | |
| רוטור 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond נייד Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 מ"ל טיפים לפיפטה סרולוגית | פישר סיינטיפיק | 89130-900 | |
| 10 מ"ל טיפים לפיפטה סרולוגית | פישר סיינטיפיק | 89130-898 | |
| 5 מ"ל טיפים לפיפטה סרולוגית | פישר סיינטיפיק | 898130-896 | |
| צלחות 48 בארות | פישר סיינטיפיק | 07-200-86 | |
| צנטריפוגה שולחנית Allegra 6, | בקמן קולטר | 366802 | |
| GH-3.8A לא מקורר, אופקי, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R צנטריפוגה ספסלית, | בקמן קולטר | ||
| TA-15-1.5, זווית קבועה | בקמן קולטר | 368298 | |
| פישר סיינטיפיק AccuSpin Micro 17 | פישר סיינטיפיק | 13-100-675 | |
| פישר סיינטיפיק מערבולת אנלוגית | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Kit | Zymo Research | R2050 | |
| כלורופורם (כ-0.75% אתנול כחומר משמר/ביולוגיה מולקולרית) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| סט דנאז נטול רנאז (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטרים | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III מערכת סינתזה של גדיל ראשון RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq אוניברסלי SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| פישרברנד 96 בארות צלחות PCR עם חצאית למחצה, מארז של 25 | פישר | 14-230-244 | |
| אטמי דבק Microseal 'B' | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| ערכה אופטית | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II מנתח ציטומטריית זרימה | BD Biosciences | ||
| FACSDiva תוכנה | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Covaris S200 | |||
| SPRIworks Fragment Library System I עבור Illumina | בקמן קולטר | A288267 | |
| cBot אשכול Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq ערכת הכנה לספריית RNA קטנה | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina קטן ערכת ריצוף RNA v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
מקורות
- Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
- Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
- Zan, H., Casali, P.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
