מאמר שיטה

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55150

⸱

20 בינואר 2017

 , 
1Department of Molecular Biology - Functional Genomics, Laimburg Research Centre

במאמר זה

סיכום

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

תקציר

Unravelling המנגנונים המולקולריים של גילויי המחלה חשוב להבין פתולוגיות ופיתוח סימפטום במדעי הצמח. חיידקים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי לתפעל מטבוליזם המארח שלהם לתועלתם. מניפולציה חיידקי זה בשילוב לעיתים קרובות עם פיתוח סימפטום חמור או מוות של הצמחים הנגועים. קביעת המולקולות הספציפיות חיידקי אחראי המניפולציה המארחת הפכה תחום חשוב במחקר מיקרוביולוגית. לאחר זיהוי של מולקולות חיידקים אלה, שנקראו "effectors," חשוב להבהיר את תפקידם. גישה פשוטה לבדוק את רמת התפקוד של מפעיל הוא לזהות שותף מחייב חלבוניים שלה מארח הטבעי באמצעות מסך שמרים השני היברידי (Y2H). בדרך כלל המארח בחובו רבי שותפים מחייבים פוטנציאל שלא ניתן לחזות במידה מספקת על ידי כל אלגוריתם ממוחשב. לפיכך הבחירה הטובה ביותר perfoRM מסך עם מפעיל היפותטי נגד ספרייה שלמה של חלבונים מארחים לידי ביטוי. זה מאתגר במיוחד אם הגורם הסיבתי הוא ניתן לעיבוד חקלאי כמו phytoplasma. פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הוראות טיהור DNA מצמח מארח וודי phytoplasma נגוע, ההגברה של מפעיל הפוטנציאל, ואת ההזדהות הבאה של שותף האינטראקציה המולקולרי של הצמח עם מסך Y2H. למרות מסכי Y2H משמשים, קיימת מגמה לבצע מיקור חוץ של הטכניקה הזו לחברות ביוטכנולוגיה המציעות את שירות Y2H במחיר. פרוטוקול זה מספק הוראות כיצד לבצע Y2H בכל מעבדה בביולוגיה מולקולרית מצוידת בהגינות תוך שימוש בטכניקות מעבדה סטנדרטיות.

מבוא

מסכי השני היברידי שמרים (Y2H) פותחו לפני כ 27 שנים 1 ויש לי מאז היה בשימוש נרחב בתחומים שונים כדי לקבוע אינטראקציות חלבון-חלבון מסוימים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . האינטראקציה הפיסית של מפעיל חיידקים עם חלבון מטרה מארחת היא לעתים קרובות התנאי מוקדם המניפולציה התפקודית של חלבון המטרה הזאת. ניתוח אינטראקציות אלה עבר המוקד של מגזרים שונים של זיהום ביולוגיה 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. העיקרון של מסך Y2H הוא שהאינטראקציה של שני חלבונים מוביל הכינון מחדש של גורם שעתוק פונקציונלי שמניע את הביטוי של גני כתב. המפעיל הידוע (" הפיתיון ") הוא קבע translationally לתחום ה- DNA מחייב (DBD) של גורם השעתוק, ושותפי אינטראקצית הפוטנציאל (להלן: "טרף") הם התמזגו לתחום ההפעלה (AD) של גורם שעתוק בהתאמה. מאז שותף האינטראקציה אינו ידוע, ספרייה של פוטנציאל interactors משובט לתוך מה שנקרא "הטרף-הספרייה." בדרך כלל, ספרייה זו נעשית על ידי שיבוט cDNAs לתוך פלסמיד ביטוי וקטור הטרף מתאים קידוד לספירה תואמת הווקטור-הפיתיון המקודד DBD. במקרה של אינטראקציה, את גורמי שעתוק מחדש להשרות את הביטוי של גני כתב, המאפשרים את בחירת הצמיחה בדרך כלל של שמרים.זיהוי של interactors מושג על ידי רצף הפלסמיד טרף עם פריימרים פלסמיד ספציפי.

חיידקים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי להפעיל ולנצל את חילוף החומרים של המארח שלהם או כדי להתחמק ממנגנוני ההגנה ומפרישים מולקולות מפעיל באמצעות מערכות הפרשת חיידקים שונים 19, 20, 21. קביעת השותפים המחייבים של effectors החיידקים אלה היא אפוא הצעד הראשון בזיהוי מסלול מניפולציות המארח. זה מוביל הבנה משופרת של המנגנונים פתוגניות הספציפיים.

מסכי Y2H מבוצעים לזהות אינטראקציות מפעילות חיידקים במהלך phytoplasmoses, ולעתים קרובות, Y2H הוא ניסוי ראשוני מכריע עבור האפיון הנוסף של מנגנוני הפתוגניות מולקולריים במחקר phytoplasma 22, 23. עם זאת, נפגשתיאור הוד ברוב הפרסומים די נדיר, וטכניקות אלו במיקור חוץ לעתים קרובות לחברות הביוטק. כדי למשוך תשומת לב את הכדאיות של שיטה זו, פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד במידע כדי לזהות שותפי אינטראקציה של מולקולת מפעיל חיידקים המארח שלו טבעי.

למרות השימוש הנרחב ואת המחשבה קדימה המהירה של מסך Y2H, זה אסור לשכוח כי אינטראקציות מסוימות עשויות לא להתרחש במערכת השמרים. זאת בשל העובדה כי תא השמרים משמש כסוג של "in vivo תגובת כלי" עם מגבלותינו ביולוגיות מסוימות. כמה מחברים התייחס היתרונות והחסרונות של Y2H ונגזרותיו 11, 24, 25, 26, 27. שיקולים כלליים הם, למשל, כי תא שמרים אולי לא לספק את המתאיםביטוי גנים, (שלאחר) translational, או תנאי translocational עבור החלבונים בהתאמה נלמד. זה יכול להוביל לתוצאות false-negative במסך. אינטראקציות חיוביות בתורו יכול להיות חפצים ו עשויים לא להתרחש במצב טבעי (כלומר, במקרה של effectors ב המארח המתאים). זהו אפוא הכרחיים כדי לאשר את האינטראקציות ממערכת ביטוי שמרי Heterologous עם מבחן אינטראקציה עצמאי מערכת ביולוגית יותר קשורה זה לזה.

במחקר זה, השותפים המחייב של ATP_00189 מפעיל מן הפתוגן צמח שאינו לעיבוד Candidatus Phytoplasma מאלי (פ מאלי) זוהו. התוצאות מספקות תובנה חשובות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח הסימפטום של התפשטות התפוחה 28, מחלה הגורמת להפסדים כלכליים גבוהים באזורים תפוחים וגדל מושפעים באירופה 29.

פרוטוקול

1. איסוף דוגמאות שורש ליף מעצים אינפקטד אפל

הערה: דנ"א הפתוגן- ספציפי יכול להיות מטוהרים מן השורשים או עלים. הסעיף הבא מספק פרוטוקול עבור הדגימה של שניהם.

  1. להכנת דנ"א
    1. אוסף דוגמאות והכנה מהשורשים
      1. לזהות עצים נגועים עם "ריבוי תפוח" סימפטומים -specific 30, 31 ועצים שליטה כי הם ללא סימפטום. באמצעות מזמרה לנקות, לחתוך דגימות שורש שיש בקוטר של 0.5 - 1 ס"מ ובאורך של כ -5 ס"מ. דגימות Cut משלושה אתרים שונים, רחוקים של מערכת השורשים, ולשים אותם לתוך שקיות פלסטיק שכותרתו כראוי.
        1. שמור את הדגימות בקופסא קרה עם חבילות תרמית מצוננות ולאחסן אותם במקרר ב 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
          הערה: אדריכלות שורש ומבנה יכול להשתנות ביחס o המצב הפיזיולוגיf העץ. חשוב לדגום בשלושה אתרים שונים ולא לקחת שורשונים מדי-דקים. הדגימות יכול להיות מאוחסן במשך מספר ימים בבית 4 ° C, אבל פעמים אחסון יותר להגביר את הסיכון של דפוס. דגימות מולדים לא יכולות לשמש להכנת דנ"א.
      2. שוטפים את דגימות השורש במים כדי להסיר את הקרקע. שים אותם בצלחת פטרי סטרילית ולהשתמש אזמל מעוקר כדי להסיר את האפידרמיס שורש קליפת המוח.
        1. נקה את האזמל עם רקמות נקיות נטול מוך לנגב, לטבול אותו ב -70% (v / v) פתרון מים אתנול, וחום-לעקר מעליו להבה פתוחה (למשל, מבער בונזן). גרד את השיפה עם אזמל, קוצצים אותו לחתיכות קטנות, ו aliquot 30 - 100 מ"ג של השיפה קצוץ לתוך צינור 2.0 מ"ל התגובה סטרילי. אחסן את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
    2. איסוף להכנת דגימות עלים
      1. לזהות נגוע עץ מלא ללא תסמינים, הים מתואר בשלב 1.1.1.1, ולאסוף עשרה עלים ללא פגע לכל עץ. עץ אחד לכל מצב מספיק.
      2. שוטפים את העלים במים לניקוי משטחים בהתזת 70% (v / v) פתרון אתנול. לשים את העלים בצלחת פטרי סטרילית לנתח את midrib (וריד מרכזי) של כל עלה עם אזמל סטרילי. הסר את האפידרמיס ואת קליפת מן midrib, לחתוך את midrib לחתיכות קטנות, ו מ"ג aliquot 100 של רקמות midrib לתוך צינור התגובה 2.0 מ"ל סטרילי. השתמש דגימות מיד להכנת דנ"א או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
        הערה: זה נוח aliquot החומר הצמחי במנות של 100 מ"ג ולבסוף להקפיא אותם לאחסון. ניתן להשתמש בכל aliquot ישירות להכנת דנ"א. שקילת חומר צמחי בהקפאה עמוקה היא מסורבלת, מאז החומר צמחי הקפוא נוטה ליצור גושים.

2. Cetyltrimethylammonium ברומיד (CTAB) מבוסס DNA כן

s = "jove_content"> הערה: DNA יכול להיות מטוהר באמצעות כל שיטת טיהור DNA מבוסס עמודה עבור חומר צמחי. בסעיף זה, שיטה מבוססת CTAB לטיהור DNA מתואר. טיהור DNA מתבצעת על בסיס פרוטוקול שונה תאר במקום 32.

  1. הכן את החוצצים הבאים:
    1. חיץ CTAB: ממיסים 1% w / v ברומיד cetyltrimethylammonium (CTAB, M r: 364.45 g / mol), 100 מ"מ trishydroxymethylaminomethane (טריס, r M: 121.14 g / מ"ל), 1.4 מ 'נתרן כלורי (NaCl, M r: 58.44 גרם / mol), ו -20 מ"מ מלח disodium חומצה ethylenediaminetetraacetic (NaEDTA, r M: 372.24 g / mol) במים ולהתאים אותם 8.0 pH.
    2. N-Lauroylsarcosine חיץ: ממיסים 10% w / v N-lauroylsarcosine נתרן מלח 33 (ז r: 293,38 g / mol), 100 מ"מ טריס, ו -20 מ"מ NaEDTA במים ולהתאים את ה- pH ל 8.0.
    3. טריס-EDTA (TE) חיץ: ממיסים 10 טריס מ"מ ו 1 מ"מ NaEDTA במים autoclותעיף הפתרון.
    4. פתרון אמוניום יצטט: כן (r M: 77,0825 g / mol) תצטט 5 M אמוניום פתרון במי חיטוי זה ב 120 ° C ו -1.2 רף 20 דקות.
  2. מערבבים 30 - 100 מ"ג של חומר צמחי קצוץ טרי או קפוא (שלב 1.1.2.2.) עם 300 μL של חיץ CTAB, 30 μL של חיץ N-Lauroylsarcosine, 6 μL של proteinase K (10 מיקרוגרם / μL), ו -12 μL של 2-mercaptoethanol 34 (ז r: 78,13 g / mol). Shake למשך 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. תנו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.
  3. להוסיף 360 μL של פתרון אמוניום אצטט ומערבבים נמרצות. תנו פתרון לשבת במשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות אותו ב 15,000 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את supernatant כדי בקבוקון נקי ולהוסיף 720 μL של isopropanol קר כקרח 35. להאיץ את ה- DNA עבור לפחות 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. צנטריפוגה תמהיל 15,000 XG במשך 30 דקות ב 4° C וזורקים supernatant. שטפו את הכדור עם 500 μL של אתנול 70% קרים כקרח ספין למטה זה ב 15,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. בטל supernatant אתנול ומיד טובלים את הבקבוקון על מגבת נייר נקייה להסיר טיפות שיורית. הקפד להסיר נוזלים ככל האפשר. אוויר יבש גלולה במשך 15-20 דקות או במשך 2-3 דקות בצנטריפוגה concentrator ואקום. אל מעל לייבש את הגלולה ידי חימום עודף או פעמי אידוי מורחבות.
  6. Resuspend גלולה ב 700 μL של חיץ TE ולבסוף לחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס כדי להקל המסה. הוסף 10 μL של RNAse (10 מיקרוגרם / μL) ו דגירה אותו במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 300 סל"ד.
  7. להוסיף 700 μL של כלורופורם: isoamyl אלכוהול 36 24: 1 ומערבבים היטב. צנטריפוגה תמהיל ב -20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב העליון של supernatant כדי בקבוקון חדש, נקי.
  8. להאיץ את ה- DNA של supernatant על ידי הוספת700 μL של 2-propanol 35 (isopropanol, r M: 60.1 g / mol) ו דוגרים במשך 30 דקות לפחות ב -20 ° C. צנטריפוגה תמהיל XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
  9. שטפו את הכדור עם 500 μL של אתנול ו צנטריפוגות 70% ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 °. לייבש את הגלולה כמתוארת בשלב 2.5. לפזר אותו 50 μL של TE.

3. זיהוי Candidatus Phytoplasma מאלי ספציפי DNA על ידי PCR

  1. לדלל את ה- DNA מטוהר מן החומר הצמחי 1:10 ב nuclease ללא מים ולהפעיל PCR עם פריימרים ספציפי הפתוגן 37.
    1. לוודא את נוכחותו של ה- DNA פ מאלי ספציפיים בחומר הצמח באמצעות פרוטוקול ה- PCR כמותי עם פריימרים ו בדיקות ספציפיות עבור phytoplasma פ מאלי 37. בדוק בהעדר חברי phytoplasma 16SrX האחרים על ידי ביצוע אותו PCR עם בדיקות בהתאמה עבור Cand. פ prunorum ועבור Cand. פ pyri DNA 37.
      הערה: דנ"א עץ הלא נגוע צריך להיבדק גם כן כדי לאשר בהעדר פתוגן בבקרה זו. בשלב זה, חשוב כי DNA ממינים phytoplasma אחרים קשורים באופן הדוק התאור במדגם, מאז שיגדילו את הסיכון של הגברה מפעיל מזן phytoplasma למעט פ מאלי. זיהום מעורבב עם עוד phytoplasma קבוצה קשורה קשר הדוק פ מאלי 16SrX נשלטת על ידי ניתוח המדגם עם בדיקות בהתאמה. מאז התוצאות הצפויות צריכות להיות שליליות עבור phytoplasma 16SrX אחר, חשוב לכלול בקרות החיוביות הנאות המציינות יעילות PCR.

4. מגביר את ג'ין המפעיל הפוטנציאלי subcloning לתוך וקטור פיתיון Y2H

  1. הגבר את atp_00189 הגן phytoplasmal (לא המרכיבות את חלק פפטיד האות) של פ מאלי באמצעות פריימרים 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (קדימה) ו -5 TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (הפוך), עם אתרי הגבלה עבור EcoRI ו סאלי על 5 'ו 3' קצוות, בהתאמה. לטהר את מוצר ה- PCR עם שיטת טיהור DNA מבוסס עמודה.
  2. לשכפל את amplicon לתוך וקטור הפיתיון Y2H pLexA-N דרך קשירת EcoRI ו סאלי.
    הערה: כאן, 100 ננוגרם של EcoRI ו סאלי לינארית pLexA-N וקטור אוחד עם 15 ng של מתעכל דומה atp_00189 amplicon PCR ו -1 U T4-האנזים. קשירת בוצעה מאגר המכיל 40 מ"מ טריס- HCl (pH 7.9 במהירות של 25 ° C), 10 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ dithiothreitol (DTT, M r: 154.25 g / mol), ו -0.5 מ"מ אדנוזין אדנוזין (ATP, M r: 507.18 g / mol) בהיקף כולל של 10.0 μL על 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה (14-20 שעות). ניתוח דנ"א מהעץ נגוע עם פריימרים אותה כדי לשלול פריימר נוקבים מחייב Malus domestica x </ Em> DNA.
  3. Transform 1 μL של תמהיל קשירת לתאים electrocompetent החיידק ולבחור עבור שיבוטים עמיד kanamycin על לוריא- Bertani (LB) צלחות בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin סולפט 38.
  4. לטהר את הדנ"א פלסמיד מן השיבוטים חיידקים נבחרים עם ערכת הכנת מיני פלסמיד מבוסס עמודה בעקבות הוראות היצרן, ולבדוק את השילוב וכיוון המוצלחים של הכנס על ידי רצף 39.

5. מבחן עבור הפעלה עצמית (הפעלה אוטומטית) של חלבון המפעיל הפוטנציאלי

  1. כן תקשורת המאגרים והצמיחה הבאים:
    הערה: המינוח המיקוף צלחות סלקטיבי שמרים את הקיצורים של חומצות אמינו החסרות במדיום בהתאמה עם "-" לפני הקיצור. לדוגמה, SD-TRP-Leu-שלו צלחות המכילות את כל חומצות האמינו אבל TRP, Leu ושלו.
    1. תמהיל נשירת 10x: לשקול200 מ"ג של monohydrochloride L-arginine (r M: 210.66 g / mol), 300 מ"ג של L-isoleucine (M r: 131.17 g / mol), 269 מ"ג של מונוהידראט L- ליזין (r M: 164.21 g / mol), 200 מ"ג של L-מתיונין (M r: 149.21 g / mol), 500 מ"ג של L-פנילאלנין (M r: 165.19 g / mol), 2 גרם של L-תראונין (M r: 119.12 g / mol), 300 מ"ג של-טירוזין L (מר: 181.19 g / mol), 200 מ"ג של L-אורציל (112.09 g / mol), ו -1.5 גרם של-ולין L (M r: 117.15 g / mol). ממיסים אותם ב 1 ליטר של מים מזוקקים פעמיים ו החיטוי הפתרון. שמור את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: תמהיל נשירת בהתאמה יכול להיות גם מעורבב מראש לרכוש.
    2. L-אדנין תוספת 10x: לשקול 100 מ"ג מלח hemisulfate L-אדנין (ADE, M r: 184.17 g / mol) ו לפזר אותו 50 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים. סנן לעקר את הפתרון עם מסנן נקבובי 0.22 מיקרומטר.
    3. L-היסטידין 10x תוספת: לשקול 100 מ"ג של מונוהידראט L-היסטידין monohydrochloride (שלו, r M : 209.63 g / mol) ב 50 מ"ל מים מזוקקים פעמיים ולסנן לעקר אותו עם מסנן הנקבוביות 0.22 מיקרומטר.
    4. L-לאוצין תוספת 10x: לשקול 500 מ"ג L-לאוצין (Leu, M r: 113.17 g / mol) ב 50 מ"ל מים מזוקקים פעמיים ולסנן לעקר אותו עם מסנן הנקבוביות 0.22 מיקרומטר.
    5. L- טריפטופן תוסף 10x: לשקול 100 מ"ג L-טריפטופן (TRP, r M: 204.23 g / mol) ב 50 מ"ל מים מזוקקים פעמיים ולסנן לעקר אותו עם מסנן הנקבוביות 0.22 מיקרומטר.
    6. SD-TRP-Leu-שלו-ADE-בינוני וצלחות: ממיסים 0.67% w / v בסיס שמרים חנקן (ללא חומצות אמינו) ו -2% w / v מונוהידראט D- גלוקוז (r M: 198.17 g / mol) ב כפול מים מזוקקים חיטוי. עבור צלחות אגר, להוסיף 2% w / v אגר (כיתה מיקרוביולוגית) לפני מעוקר.
    7. כדי להכין צלחות סלקטיבית, להוסיף 1x של פתרון המניות חומצת אמינו אל SD-TRP-Leu-שלו-ADE בינוני autoclaved. בעת הכנת צלחות, לוודא כי אגר הוא מקורר ל ~ 50 ° C לפני הוספתחומצות אמינו. שמור על פתרונות המניות סטרילי.
    8. בינוני YPAD: ממיסים 1% w / תמצית שמרים נ, 2% w / v peptone (כיתה מיקרוביולוגיות), 0.004% w / v אדנין hemisulfate מלח (r M: 184.17 g / mol), ו -2% w / מונוהידראט גלוקוז נ ל פעמי מים מזוקקים חיטוי. עבור צלחות אגר YPAD, להוסיף 2% w / v אגר לפני מעוקר. כדי להכין 2x YPAD, להשתמש פעמיים הריכוזים של המרכיבים הנ"ל.
      הערה: (אופציונלי) בשל ריכוז גבוה של גלוקוז בטווח הבינוני, בינוני 2x YPAD הופך-חום כהה לאחר מעוקר. כחלופה, 40% (w / v) פתרון מניות גלוקוז יכול להיות מוכן לעקר על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. פתרון המניות גלוקוז מעוקרים הסינון הוא הוסיף אז אל YPAD 2x autoclaved (גלוקוז חסר) בתנאים סטריליים. כדי להימנע משגיאות נפח, 2x YPAD חייב להיות מוכן, תוך התחשבות כי פתרון גלוקוז 10x הוא שיצטרף. כלומר, למשל, במקום 1 L of בינוני, רק 900 מ"ל מוכן (המכיל את כל החומרים מלבד גלוקוז) autoclaved, ולאחר מכן 100 מ"ל של פתרון המניות גלוקוז הוא הוסיף.
  2. ליתיום טרנספורמציה שמרים יצטט בתיווך עבור הפעלה עצמית בדיקות
    1. Streak זן הכתב שמר האפייה NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( lexAop) 4-HIS3 URA3: :( lexAop) 8-lacZ ade2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) מתוך מלאי גליצרול קפוא על צלחת אגר YPAD דגירה זה במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. פיק מושבות מהצלחת זה לחסן 50 מ"ל של מדיום YPAD. תנו שמרים לגדול למדוד את OD 600 קבוע כדי לפקח על צמיחה.
    2. תנו שמרים לגדול עד OD הסופי 600 של 0.5-0.8. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 700 XG במשך 5 דקות ו resuspend אותם 2.5 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים, autoclaved.
    3. הכן שישה aliquots עם 100 μL של ההשעיה שמרים ולהוסיף 240 μL של 50% W / v פוליאתילן גליקול 4000 (PEG, M r: 3,500-4,000 g / mol), 36 μL של 1 M מימית אצטט ליתיום (LiOAc, r M: 102.02 g / mol), ו -25 μL של 2% w / v DNA זרע סלמון (מומס). יש להכין את כל ריאגנטים עם מים פעמיים מזוקקים, סטרילי.
    4. לייבל שישה בקבוקונים המכילים השעיה שמרימה מ "" ל "ו" ולהוסיף את ה- DNA וקטור הפלסמיד הבא: קיום בקרות שליליות: (א) 1.5 מיקרוגרם של פלסמיד פיתיון עם המפעיל (pLexA-N-atp00189 28), (ב) 1.5 מיקרוגרם של פלסמיד טרף ריק pGAD-HA 41, (ג) 1.5 מיקרוגרם של וקטור הפיתיון ריק pLexA-N 41, ו- (ד) 1.5 מיקרוגרם של וקטור הפיתיון ריק pLexA-N ו -1.5 מיקרוגרם של פלסמיד טרף ריק pGAD-HA; בקרות חיוביות: (ה) 1.5 מיקרוגרם של פלסמיד הפיתיון חיובית שליטה DNA pLexA-p53 41 ו -1.5 מיקרוגרם של פלסמיד חיובית-טרף PACT-largeT 41; ומבחן ההפעלה העצמית: (ו) 1.5 מיקרוגרם של baזה פלסמיד עם מפעיל (pLexA-N-atp00189) ו -1.5 מיקרוגרם של pGAD-HA פלסמיד טרף ריק.
    5. מערבבים את התגובות במרץ דגירה אותם במשך 45 דקות ב 42 מעלות צלזיוס באמבט מים. גלולת התאים למשך 5 דקות ב 700 XG וזורקים supernatant. Resuspend התאים 250 μL של 0.9% (w / v) פתרון נתרן כלורי (NaCl, r M: 48.44 g / mol) ולהפיץ 50 μL על צלחות סלקטיבית הבאים: SD-TRP, SD-Leu, SD-trp- Leu, SD-TRP-Leu-שלו, ו SD-TRP-Leu--ADE שלו.
    6. דגירת הצלחות במשך 3 - 4 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר היום של הדגירה הראשון, לאטום את הצלחות עם סרט פרפין פלסטיק כדי למנוע את הצלחות מההתייבשות.
    7. בדוק את הצמיחה שמרים על הצלחות.

6. בדוק את הביטוי של המפעיל

  1. בדוק את הביטוי של המפעיל על ידי כתם מערבי 42 עם נוגדן נגד תג לקס-A כי מצמיד את N- הסופית של המפעיל כאשרלידי ביטוי מתוך pLexA-N.
    הערה: שקול כי תג לקס-A התמזגו translationally מוסיף כ -24 kDa למשקל בפועל של החלבון של עניין. זה חשוב בעת זיהוי גודל החלבון הכתם המערבי.

7. מסך Y2H

  1. ציירתי על pLexA-atp00189 (מפעיל) -transformed NMY51 על צלחת SD-TRP טרי ולתת לו לגדול במשך 2 - 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס, עד מופיעות מושבות אדומות.
  2. לחסן 3 מ"ל של מדיום SD-TRP בבקבוק רועד קטן עם מושבה אדום מהצלחת אגר דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד ב 120 - סל"ד 150.
  3. לחסן 20 מ"ל של-TRP SD בבקבוק רועד 1 מ"ל של התרבות לילה ולתת לו לגדול למשך 8 שעות.
  4. התאם את תרבות OD 600 = 0.2 על ידי הוספת בינוני SD-TRP ולחסן 2x 100 מ"ל רועד צלוחיות עם 10 מ"ל של התרבות המתנע כל. לגדול לילה עם רועד ב 30 ° C.
    הערה: ודא כי השמרים לא לגדול ל OD 600> 0.5 ו לדלל עם SD-TRP הטרי.
  5. למדוד את OD 600 לבין גלולה 120 OD 600 "יחידות". לדוגמה, אם OD של 600 1.2 נמדדת, ספין למטה 100 מ"ל, לבטל את supernatant, ו resuspend גלולה ב 800 מ"ל של מחומם מראש 2x YPAD בבקבוק שייקר עם בר ומערבבים מגנטי.
    1. ספין למטה aliquot 2 מ"ל, להסיר את supernatant, ו resuspend גלולה במים. ודא כי OD 600 של ההשעיה שהמרימה הוא בין 0.15 לבין 0.2. אם לא, להתאים עם 2x YPAD או להוסיף שמרים יותר מתרבות הלילה.
      הערה: 2x YPAD הוא חום כהה והוא יכול להשפיע על תוצאות המדידה OD. לפיכך, יש צורך resuspend התאים שמרים במים לפני קביעת OD. כחלופה, 2x YPAD יכול להיות מוכן על ידי עיקור גלוקוז בנפרד, כמפורט בבאור צעד 5.1.8, אשר מונע את הגוונים הכהים של המדיום.
  6. דגירת התרבות שמרים שנותרה אפליקציהropriately בגודל הבקבוק שייקר (800 מ"ל בבקבוק שייקר 2 L או לחלק 2 x 400 מ"ל לשתי 1 צלוחיות L שייקר) לדגור על 30 מעלות צלזיוס, 120 - 150 סל"ד. למדוד את OD 600 על כל 1.5 שעות עד OD 600 של 0.6 הוא הגיע (לוקח 4 - 6 שעות). בינתיים, להכין את פתרונות שמתואר בשלב הבא.
  7. הטרנספורמציה אצטט בתיווך ליתיום
    1. ממיסים 2% w / v סלמון זרע DNA במים ומרתיחים 500 μL למשך 5 דקות באמבט מים ב 100 מעלות צלזיוס. מניח את הצינור על קרח במשך 2 דקות וחזור על שלב החימום. שמור את ה- DNA על הקרח עד לשימוש נוסף.
    2. הכן את התערובות הבאות:
      1. TE / תערובת LiOAC: מערבבים 3.08 מ"ל של 1 M LiOAC, 3.08 מ"ל של 100 מ"מ טריס / 10 mM EDTA (pH 7.5), ו 21.84 מ"ל מים פעמיים מזוקקים סטריליים.
      2. תמהיל PEG / LiOAc: מערבבים 4.2 מ"ל של 1 M LiOAc, 4.2 מ"ל של מ"מ טריס / 10 mM EDTA (pH 7.5), ו 33.6 מ"ל של 50% (w / v) PEG 4000.
    3. צנטריפוגה התרבות שמרים 800 מ"ל (OD 600 = 0.6)ב XG 700 במשך 5 דקות עד גלולת התאים. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 200 מ"ל של מים פעמיים מזוקקים סטריליים. גלולה התאים שוב ב 700 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. הערה: אם לחלק הכרחי ההשעיה למספר בקבוקונים עבור צנטריפוגה. הכרכים הנזילים 7.7.3. ו 7.7.4. עיין הגלולה כולו נגזרה 800 השעית מיליליטר.
    4. Resuspend גלולה ב 16 מ"ל של תערובת TE / LiOAc (ראה שלב 7.7.1.1); ספין למטה ב 700 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 9.6 מ"ל של תערובת TE / LiOAC.
    5. הכן את התגובה הבאה מתערבב כלי פוליפרופילן התגובה בגודל מתאים: 12 צלוחיות עם 7 מיקרוגרם של וקטור הספרייה pGAD-HA-cDNA, 100 μL של ה- DNA זרע סלמון 2% (ראה שלב 7.7), ו 2.5 מ"ל של תערובת PEG / LiOAc. להוסיף 600 μL של ההשעיה תא שמרים משלב 7.10 לכל אחת 12 בקבוקונים ומערבבים נמרצות במשך 1 דקות.
    6. דגירת תערובת התגובה במשך 45 דקות ב 30 מעלות צלזיוס באמבט מיםd לערבב כל 15 דקות נמרצות. להוסיף 160 μL של DMSO לכל בקבוקון ומערבבים נמרצות. דגירת התמהיל במשך 20 דקות אחרות ב 42 מעלות צלזיוס.
    7. גלולה התאים ב XG 700 במשך 5 דקות, לבטל את supernatant, ו resuspend כל גלולה ב 3 מ"ל של 2x YPAD. בריכת כל התאים (עם סך של 36 מ"ל מתוך 12 בקבוקונים) בבקבוק שייקר 100 מ"ל ו דגירה השמרים למשך 90 דקות ב 30 ° C ו -120 סל"ד.
    8. גלולת התאים למשך 5 דקות ב 700 XG וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 4.5 מ"ל של 0.9% סטרילי (w / v) NaCl ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה בזהירות ומטה עם טפטפת סרולוגיות 10 מ"ל. משיכה 50 μL ולהכין דילולים של פי עשרה 0.9% NaCl מ 01:10 עד 1: 1,000. פלייט 100 μL של דילול כל על צלחות פטרי 90 מ"מ המכילות אגר SD-TRP-Leu.
    9. מורחים את שאר resuspension שמרים חי על 16 x בצלחות פטרי בקוטר 150 מ"מ עם אגר SD-TRP-Leu-שלו-ADE. להוסיף 3-AT למדיום להפחית הפעלה עצמית. דגירה-TRP-Leu SDצלחות במשך שלושה ימים ואת צלחות SD-TRP-Leu-שלו-ADE במשך ארבעה ימים על 30 מעלות צלזיוס.
      הערה: משובטים המופיעים על הצלחות סלקטיבית (פוטנציאל) זוגות אינטראקציה ולבצע קידוד פלסמיד pGAD-HA עבור שותף אינטראקצית הפיתיון.
    10. לקבוע את יעילות transfection על ידי ספירת מושבות של דילולים סדרתי שונים על צלחות מבחר SD-TRP-Leu. העבר כל שיבוט על ידי קטיף פסי המושבה עם קצה פיפטה סטרילית על צלחות טריות SD-TRP-Leu-שלו-ADE-סלקטיבית. דגירת הצלחות עבור 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה כל יום עד לסך של חמישה קטעים הוא הגיע.

ניתוח 8. המשובטים מהצלחות סלקטיבי

  1. הכן צינור תגובה אחת סטרילי 2 מ"ל עם 1 מ"ל של SD-TRP-Leu--ADE שלו עבור כל שיבוט מתחת למכסה המנוע סטרילית. פאנץ חור לתוך צינור אחד עם מחט חם לכסות את החור עם חתיכת אוטם גז חדיר. לחסן כל בקבוקון עם בן זוג מושבה טרי ריאל מאחד שיבוט (שלב 7.17; להשתמש שיבוטים לאחר 5 חלוף ה) דגירה במשך 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, רועד ב 150 סל"ד.
    הערה: חשוב לקחת שיבוטים מצלחת טריה, כי שמרים שנלקחו צלחות מאוחסנות במשך מספר ימים בבית 4 ° C אינם גדלים מספקים בתוך 24 שעות במדיום נוזלי.
  2. גלולה שמרים במשך 5 דקות ב 4000 XG וזורקים supernatant. Resuspend גלול במאגר resuspension המתאים (מתוך הערכת miniprep פלסמיד דנ"א בהתאמה) ולהעביר אותו צינור 2.0 מיליליטר תגובה טרי. הוספת 100 μL של חרוזי זכוכית חומצה שטף (425- 600 מיקרומטר קוטר) ומערבבים נמרצות במשך 5 דקות.
  3. מוסיף את חיץ תמוגה בהתאמה ולהמשיך עם טיהור פלסמיד באמצעות ערכת מיני הכנת פלסמיד בעקבות הוראות היצרן. Elute את ה- DNA פלסמיד עם 50 μL של מים.
  4. השתמש DNA משלב 8.3 לתגובה רצף עם פריימר פלסמיד ספציפי טרף, GAL4ADseqנ"צ "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '.
  5. בדוק את האינטראקציה על ידי דה נובו שיתוף הפיך 43, 44 את פיתיון וקטור הטרף. בחר שמרים טרנספורמציה על צלחות SD-TRP-Leu--ADE שלו הבחירה.

תוצאות

לפני מסך Y2H בפועל יכול להתבצע הפיתיון חייב להיבדק על-הפעלה עצמית. זו מושגת על ידי הפיכת וקטור ביטוי פיתיון יחד עם וקטור ספריית טרף הריק ובדיקת צמיחה על צלחות סלקטיבית.

כדי לנתח אם ATP_00189 חלבון phytoplasmal הוא-הפעלה עצמית, המבחן עצמי ההפעלה בוצע כמתואר בסעיף 5. פלסמיד הפיתיון המשלימה את TRP ואת הטרף פלסמיד auxotrophy Leu של ס cerevisiae NMY51 40. טרנספורמציה-שיתוף מוצלחת ובכך מתאפיינת בצמיחה על צלחות סלקטיבית חסרות TRP ו Leu. אינטראקציה של פיתיון חלבון טרף מוביל שלם של auxotrophy שלו ade של NMY51. אם הפעלה עצמית על ידי הפיתיון בהעדר אינטראקציה מופיעה, השמרים גדלו על צלחות סלקטיבית החסרות שלו ADE. עצמית חזקה וחלשההפעלה יכולה להתרחש. עצמית הפעלה חזקה של הפיתיון מאופיינת בצמיחה של שמרים טרנספורמציה-שיתוף על צלחות מבחר TRP-Leu--ADE שלו מדולדל. עצמית הפעלה חלשה מובילה לצמיחה על TRP-Leu-שלו אבל לא על צלחות מבחר TRP-Leu--ADE שלו מדולדלת. בקרות חיוביות נאות הן הכרחיות עבור בפירוש תוצאות של assay-ההפעלה העצמית. סיכום של התוצאות הצפויות של assay עצמית ההפעלה ופירושם מסופק בטבלה 1 ו דמיינו באיור 1.

figure-results-1
איור 1: דוגמא של בדיקות פיתיון עצמית הפעלה של פיתיון לפני ביצוע מסך Y2H. ס cerevisiae NMY51 היה שיתוף הפך עם אינטראקציה הפיתיון (Plex-p53) וטרף (PACT-largeT) כביקורת חיובית (פאנל משמאל: AC) חברה הפעלת עצמית חלש פלוס טרף ריק Libraוקטור ר"י (פנל באמצע: DF) ו פיתיון עצמי הפעלה לא בתוספת וקטור ספריית טרף ריק (פנל מימין: GI). השמרים שיתוף טרנספורמציה היו בתרבית על צלחות SD חסר TRP ו Leu (הפאנל העליון: א, ד, ז), TRP, Leu ו שלו (פאנל באמצע: B, E, H) TRP, Leu, שלו ADE (נמוך לוח: ג, ו, ט). בחירה על המדיום חסר TRP ו Leu הוא פקד חיובי על שיתוף טרנספורמציה מוצלחת, כמו וקטור הפיתיון משלים את auxotrophy TRP ואת וקטור הצד טרף Leu auxotrophy של NMY51 (צמיחה על-Leu SD-TRP). במקרה של אינטראקציה בין הפיתיון טרף או הפעלה עצמית של הפיתיון, ביטוי הכתב של NMY51 מופעלת ומשלים את auxotrophy שלו ADE (הצמיחה על SD-TRP-Leu-שלו-ADE). מופעלת עצמית חלשה מאופיינת בצמיחה על SD-TRP-Leu-שלו צלחות (פנל באמצע, DF). עצמית הפעלה חלשה של פיתיון חייבת להצטמצם לפני לניתוח הפיתיוןב מסך Y2H, למשל על ידי הוספת 3-AT אל התקשורת סלקטיבית. depletions חומצת אמינו מסומן "-" בשם מדיה בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

pLexA-N-atp00189 אף לא אחד מושבות אין צמיחה אין צמיחה אין צמיחה אין צמיחה
אף לא אחד pGAD-HA אין צמיחה מושבות אין צמיחה אין צמיחה אין צמיחה
pLexA-N אף לא אחד מושבות אין צמיחה אין צמיחה אין צמיחה אין צמיחה
pLexA-N pGAD-HA מושבות מושבות מושבות אין צמיחה אין צמיחה
pLexA-p53 ברית-largeT מושבות מושבות מושבות מושבות מושבות
pLexA-N-atp00189 pGAD-HA מושבות מושבות מושבות אין צמיחה אין צמיחה

טבלה 1: התוצאות הצפויות ב assay פיתיון עצמית ההפעלה. הפיכתו של ס cerevisiae NMY51 מניבה בצמיחת הפרש על תקשורת סלקטיבית על בסיס המאפיינים של פיתיון שיתוף טרנספורמציה ונטרפים. צמיחה על צלחות סלקטיבית הוערכה על הטרנספורמציה של שילובים שונים וקטור (AF) לאחר דגירה 72 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. עצמית הפעלה חלשה מאופיינת בצמיחה שמרים על Leu-SD-TRP-שלו עצמית הפעלה חזקה על ידי צמיחה על plat מבחר SD-TRP-Leu--ADE שלוes בהיעדר שותף אינטראקציה. ATP_00189 מפעיל phytoplasmal מקודד pLexA-N אינו תערוכת הפעלה עצמית, אשר מאופיינת על ידי חוסר היכולת של וקטור פיתיון טרנספורמציה NMY51 לגדול בהעדר ואייד שלו.

בהתאם הפיתיון, מסך Y2H יכול להרוויח שיבוטים שמרים רבים גדל על צלחות סלקטיבית. כל הם צריכים להיות הבנים מנותחים ונבדקים לעובדים בפרישה אפשרית. גם אם ספריית cDNA מנורמלת נוצלה בעבר, סביר מאוד כי interactor מיוצגת שיבוטים שונים. בהתאם טכניקת שכפול הספרייה, אפשר גם כי רק שברי הגן המלא מוכנס כמה וקטורים טרפים. לפיכך רצוי דה נובו להגביר (מ cDNA) ו subclone הגן באורך מלא של interactor וכדי לבחון את האינטראקציה בניתוח Y2H אחד-על-אחד (איור 2).

figure-results-2
איור 2: דוגמה של אינטראקציה בין הפיתיון טרף בניסוי Y2H. שמרי השני היברידי (Y2H) מסך בוצע פלסמידים של שיבוטי interactor חיוביים היו מטוהרים. וקטור הטרף היה רצף לבין שותפי אינטראקצית מארח Malus domestica x MdTCP24 ו MdTCP25 זוהו. כתוצאת MdTCP34 בקרה שלילית (בגינם לא interactor זוהה מסך ספריית Y2H) היה subcloned במקביל. הגנים באורך המלאים היו מוגברים מ cDNA התפוח, subcloned לתוך וקטור הטרף (שיתוף cistronically להביע לספירת תחום ההפעלה) ואת דה נובו-טרנספורמציה שיתוף עם וקטור הפיתיון המבטא את ATP_00189 מפעיל החיידקים מצמיד את תחום ה- DNA המחייבת (BD). נתון זה נלקח מתוך 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.

דיון

במסך Y2H, החלבון מפעיל הפוטנציאל הוא שיתוף הביע עם חלבונים אינטראקציה היפותטי שונים (שלב 7). כל כפיל שמרים גדל מכיל את הפיתיון אלא interactor שונה (בפוטנציה). חלבוני האינטראקציה מקודדים בתוך ספריית cDNA כי הוא משובט לתוך פלסמידים טרף. הפיתיון ואת טרף פלסמידים כל קוד שיתוף cistronically עבור חלק גורם שעתוק שמרים. במקרה של אינטראקציה פיזית בין הפיתיון (מפעיל) וכן interactor פלסמיד מקודד טרף, חלקים גורמים שני שעתוק (התחום מחייב DNA ואת תחום ההפעלה) מאוחדים, וביטוי גן הכתב מושרה. השמרים הם מסוגלים לגדול על צלחות מבחר histidine- ו אדנין המדולדל SD. הסוג של ספריית cDNA טרף תלוי המפעיל הוקרן צריך להיבחר בהתאם. וקטור טרף פיתיון, כמו גם זן השמרים, חייב להיות תואם. במסך זה, ה- DNA LexA מחייב מושלם ואת domai ההפעלה Gal4n שמש יחידות גורמות שעתוק שמרים התואמות. ספריית cDNA ניתן לבנות בנפרד, בהתאמה אישית, או שהושג באופן מסחרי. הכנת ספריית טרף cDNA אינה חלק של פרוטוקול זה. בפרוטוקול זה, ספריית cDNA בהקמה עצמית, מנורמלת מן RNA של עלי domestica x Malus שמשה ו משובטת לתוך pGAD-HA 41. המפעיל (פיתיון) -expressing זן שמרים הפך עם הספרייה הטרפה, ומשכפל נבחר על צלחות מבחר histidine- ו אדנין המדולדל SD. כדי לחלץ DNA פלסמיד מן המושבות שמרים, ערכת מיני פלסמיד דנ"א טור לחיידקים מומלץ בשילוב עם צעד הפרעה מכנית באמצעות חרוזי זכוכית לשפר תמוגה שמרים (שלב 8). בשנת טיהור פלסמיד זה, את הפיתיון וקטור טרף יהיה מטוהרים במקביל בריכוזים נמוכים יחסית. עם זאת, כמות ה- DNA פלסמיד הוא מספיק כדי לזהות את השותף אינטראקציה באמצעות שנינות רצףHout לפני התפשטות פלסמיד (שלב 8.4). כחלופה, ה- DNA מטוהר בשלב 8.4 ניתן להפוך חיידק מוכשר שנבחר עם עמידות לאנטיביוטיקה בתיווך וקטור טרף (למשל, אמפיצילין במקרה של pGAD-HA). .ה שנבחרה coli מושב לשאת רק את הפלסמיד ספריית pGAD-HA, וטיהור פלסמיד תשואה גבוהה יכולה להתבצע עם שיבוטים אלה.

השינוי המוצלח של pLexA-N ו- pGAD-HA בונה משלים את טריפטופן לאוצין auxotrophy של NMY51. אינטראקציה בין המפעיל לבין חלבון (מקודד על pGAD-HA) מוביל ההפעלה של מערכת כתב NMY51 זנים. במקרה של הפעלה עצמית, NMY51 טרנספורמציה עם המפעיל להביע pLexA-N בשילוב עם וקטור הספרייה הריק pGAD-HA גדל על צלחות סלקטיבית חסרות TRP-Leu-שלו-ADE, בשל ההפעלה הרצויה של מערכת כתב NMY51 40. The-ההפעלה העצמית יכולה להיות weak ויכול להתרחש בהיעדר TRP-Leu-שלו, או את ההפעלה יכולה להיות חזקה התאפיינה בגידול על TRP-Leu-שלו-ADE צלחות 41. עצמית הפעלה יכולה לגרום רקע מסיבי של שיבוטים חיוביים שגויים מסך Y2H בפועל. כדי למנוע זאת, מבחן עצמי ההפעלה עם הפיתיון חייב להתנהל, שבו וקטור להביע מפעיל הוא טרנספורמציה שיתוף עם וקטור הספרייה הריקה. בהגדרה זו ניסיוני, ביטוי גני כתב אסור להיגרם. אם הפעלה עצמית (כלומר, צמיחה על צלחות סלקטיבית) גלויה את הבדיקה, המדיום יכול להיות השלים עם ריכוזים שונים של 3-אמינו-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT הוא מעכב של dehydratase imidazoleglycerol-פוספט (HIS3), אנזים חשוב במהלך ביוסינתזה היסטידין 46. תוספת של 3-AT יכולה להפחית את ההשפעות החלשות של הפעלה עצמית במהלך מסכי Y2H 47,48. ריכוזים שונים של 3-AT צריכים להיבדק. בפרוטוקול זה, 1 - 40 מ"מ 3-AT שמש. הריכוז הנמוך ביותר שמוביל לדיכוי של הפעלה עצמית צריך לאחר מכן לשמש מסך Y2H. הצלחות סלקטיבית של assay עצמית ההפעלה ניתן יהיה להעריך רק אם צלחות SD-TRP-Leu של שיתוף טרנספורמציה לכלול מספר מספיק של שיבוטים. בתור ≥ אינדיקציה 500 מושבות בכל 90 מ"מ (קוטר) בצלחת פטרי מספיקות. כדי לקבוע את יעילות transfection המדויקת, מומלץ להכין דילולים סידוריים של שמרי שיתוף טרנספורמציה להפיץ אותם על צלחות SD-TRP-Leu.

כדי לצמצם את תופעת הפעלה עצמית, המפעיל ניתן לשכפל לתוך pLexA-C, וקטור ביטוי פיתיון, המשלב את תג LexA אל C- הסופי של החלבון. האוריינטציה של תג לקס-A יכול להחליש הפעלה עצמית 24. עם זאת, אין זה אפשרי בכל מקרה להפחית או לבטל הפעלה עצמית. היווצרותמושבות אדומות או אדמדמות מצביעות על אינטראקציה חלשה או חיובית-כוזבת. גן כתב ade2 של NMY51 מופעל רק כאשר מדובר על אינטראקציה בין חלבונים, אשר בבלוקים בתורו ההצטברות של צבע אדום זן שמרים זה 40. בהעדר אינטראקציה, NMY51 הם אדמדם, ואילו מושבות נושאת interactors החזק לבנות. התצפית של צבע המושבה על צלחות בחירה ובכך מספקת רמז חשוב נוסף לשפוט אם מושבות בהתאמה הם interactors true- או חיוביות שגויות.

זה בסופו של דבר צורך להתאים או לשנות את גדרות assay מסוימות ביחס לאופי הפיתיון ואת מאפייני האינטראקציה. בשלב זה, מספר השיפורים וטכניקות הנגזרות של Y2H המשותף הוקם כדי לאפשר הניתוח של אינטראקציות חלבון קשות למדי במערכות מארחת שונות. סקירה על ידי ואח Stynen. 49 מטפלnd מתאר היבטים שונים של Y2H, השיפורים שלה, ועיבודים, ובכך מספק מידע שימושי על איך לבחור את assay לאינטראקציה הנאות.

מסכי Y2H וטכניקות נגזרות הפכו בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים, בכל המקום בו זיהוי של אינטראקציות חלבון בינארי נדרש. גם אם מבוצעים בקרות קריטיות, כגון בדיקות עצמי הפעלה של פיתיון אחד-על-אחד מחדש טרנספורמציות של חלבוני אינטראקציה המזוהה, Y2H נוטה לייצר תוצאות שווא 26, 50, 51. השמרים כמודל הוא לא מתאים לכל מחקרי האינטראקציה. שמרים אינם מהווים בהכרח בסביבת הסלולר שתומכת שינוי שלאחר translational המתאים וקיפול של כל חלבון 24. יתר על כן, בקביעת Y2H, החלבונים הם ביטוי יתר, והבעית שאינם שליטהבראשות האמרגן הטבעי שלהם. Y2H מאלץ שותפי האינטראקציה חלבוניים לגרעין, אשר אינו בהכרח יעד subcellular הטבעי שלהם. הנסיבות הסלולר יליד האינטראקציה ובכך לא יבואו לידי ביטוי על ידי שמרים עשוי להוביל לתוצאות false-negative או חיוביות שגויות. רוב Y2H מבוססים על השלמה שמרים auxotrophy כעיקרון סלקטיבית. מבחר תזונתי זה מאופיין רגישות גבוהה, אך במחיר של הסלקטיביות ירד לעומת אחרים (למשל, כתב chromogenic) מבחנים 49. אם הפעלה עצמית unreducible (ראה לעיל) או מגבלות אחרות להתרחש עבור מפעיל מסוים, Y2H אינו assay מתאים 25. בלוח 1 ואיור 1, התוצאות הצפויות של מבחן ההפעלה העצמית מקבלות. היעדרם של אינטראקציות ריאליות (כלומר, שליליים שגוי) יכול להיגרם על ידי רעילות חלבון, חלבון translational שגוי עיבוד, הפרעה סטרית של אינטראקציה, שותפים אינטראקציה מיוצגות כראוי בספרייה טרף, לוקליזציה קרום של הפיתיון, או חסר כל המרכיבים הדרושים על האינטראקציה 24.

מומלץ דה נובו להגביר את הגן באורך מלא של חלבון אינטראקציה זיהה מן cDNA, subclone אותו pGAD-HA, ולבצע assay אינטראקציה אחד-על-אחד על ידי הפיכת pGAD-HA שנוצר לבנות לתוך הפיתיון להביע זן NMY51. זה הכרחי מאז נצפה interactor הנוכחי בספריית הטרף יכול רק להיות שבר של חלבון גדול. עם זאת, המידע עבור הגן באורך מלא בהתאמה נגיש רק אם נתוני רצף גנומי transcriptomic ניכרים זמינים. פרוטוקול טרנספורמציה עבור assay העצמית ההפעלה המתוארת כאן יכול להיות מיושם על כזה assay אחד-על-אחד, ואת האינטראקציה בין הפיתיון ואת interactor חייבת להיות לשחזור.

תחת = "jove_content"> אינטראקציות מזוהות מסך Y2H חייב תמיד להיות מאושרים על ידי טכניקה נוספת עצמאית. טכניקה עצמאית זה חייבת להיות קרובה יותר בסביבה הטבעית של האינטראקציה בין החלבונים בפועל. במקרה של ATP_00189 מפעיל phytoplasmal, האינטראקציה עם גורמי שעתוק TCP של domestica x Malus אומתה planta עם השלמה פלורסנט bimolecular (BiFC) ב ניקוטיאנה benthamiana פרוטופלאסט 28 (לא חלק של פרוטוקול זה). ATP_00189 חלבון מפעיל נגזרה מאלי פ הפתוגן צמח. ב Planta BiFC ובכך נבחר כדי לאמת אינטראקציות ATP_00189 עם גורמי שעתוק domestica x Malus בעבר שזוהו Y2H 28. BiFC הוא assay אינטראקציה בין חלבונים שאינו דורש טרנסלוקציה subcellular של חלבוני אינטראקציה לגרעין כדי להפעיל את מערכת הכתב 52. יתר על כן, ב Planta הביטוי ומכונה שינוי מחק את הסביבה של האינטראקציה הטבעית בין מפעיל חיידקי הצמח ב מארח מפעלה. עם זאת, מסך גלובלי באמצעות BiFC הוא לא ריאלי.

ישנם מספר צעדים בפרוטוקול כי יש להתייחס בזהירות. כאשר הם מגבירים את הגן של עניין (שלב 4), חשוב לשלול כי פריימרים נקשרים ל- DNA הצמח. לפיכך, DNA מצמחים שאינם נגועים חייב להיכלל כביקורת שלילית. הרצף של הגן של עניין לא חייב להכיל את אתרי הגבלת EcoRI ו סאלי המשמשים השיבוט כיוונית של הכנס. אם הרצף אכן מכיל את האתרים הללו, אנזימי הגבלה שונים עבור שיבוט חייבים להיבחר. שינוי שמרים הוא שיטה מרכזית במהלך בפרוטוקול זה. יעילות Transfection תלויה המיומן של תאי שמרים, הכדאיות שלהם, מדינת הצמיחה, ואת איכות transfection reagאף אוזן גרון 53, 54. בשביל הפרוטוקול המוצע, מומלץ מאוד להשתמש שמרים מצלחות טריות לא מבוגרים שבועות (כל זמן ב 4 ° C) בעת ביצוע טרנספורמציות. לעתים קרובות, את הצמיחה של שמרי טרנספורמציה מתעכבת כאשר תרבויות נוזלות סלקטיבית הם מחוסנים עם מושבות צלחות אגרו ישנות. כמו כן הוא מועיל להשתמש תרבות המתנע נוזלית כמו בידוד עבור הניסויים בפועל ולא להשתמש השמרים ישירות מהצלחת. יעילות נמוכה כאשר transfecting טרף לתוך השמרים להביע פיתיון יכול להוביל underrepresentation של חלבוני טרף מסוימים (interactors פוטנציאל) ולכן יכול להטות את המסך כולו. בפרוטוקול זה, יעילות transfection שמרים של ~ 150,000 CFU / DNA transfected מיקרוגרם ב Y2H עבד היטב.

לדעת את הפגמים וחסרונות של טכניקת Y2H ו לפרש את התוצאות בצורה ביקורתית וראויה הוא הכרחי כדי לצייר את הקורect מסקנות. מבחני Y2H ואת הנגזרים שמשו במשך שנים רבות עברו שיפורים רבים והתאמות ביחס למאפייני הפיתיון השונים, לוקליזציה subcellular של האינטראקציה, השותפים המחייבים הצפויים, וגורמים אחרים שעשויים להידרש האינטראקציה (ראו 55 Y3H, 56, 57). לאחרונה, מסך Y2H מבוסס מערך הפותחים המאפשרים אוטומטית, ניתוח תפוקה גבוהה של פיתיונות רבים נגד מ'פושט 58. העתיד ביותר טמון סיכוי בגישות אוטומציה תפוקה גבוהה כדי assay זה כדי לאפשר להבהרת מסלולי איתות מורכבות interactomes בתחומי מחקר שונים.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים כריסטין Kerschbamer, תומאס Letschka, סבין Oettl, מרגוט Raffeiner, ופלוריאן Senoner ממרכז המחקר Laimburg ו Mirelle בורחס Dias Schnetzer מ Dualsystems ביוטק AG לתמיכה טכנית ג'וליה סטרובל להגהה את כתב היד. עבודה זו בוצעה כחלק הפרויקט APPL2.0 ו מומנה בחלקה על ידי המחוז האוטונומי של בוזן / Bolzano, איטליה ואת Consortium אפל דרום-טירולי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)ApplichemA6284להכנת DNA
Trishydroxymethylaminomethane (Tris)ApplichemA2264למדיה וחוצץ
נתרן כלורי (NaCl)ApplichemA2942למדיה וחוצץ
Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום (NaEDTA)ApplichemA2937למדיה ומאגר
N-Lauroylsarcosin מלח נתרןApplichemA7402להכנת DNA
אמוניום אצטט סיגמא-אולדריץ' (פלוקה)9688להכנת DNA
2-מרקפטואתנולApplichemA1108להכנת DNA
איזופרופנול (2-פרופנול)ApplichemA3928להכנת DNA
אתנולסיגמא-אולדריץ' (פלוקה)51976להכנת DNA
RNAseApplichemA2760להכנת DNA
כלורופורם: איזואמיל 24: 1ApplichemA1935להכנת DNA
הגהה פולימראז (למשל < / em> iProof)Bio-Rad203433ל- PCR
EcoRIThermo ScientificER0271לשיבוט
SalIThermo ScientificER0641לשיבוט
ערכת טיהור DNA מבוססת עמודות (למשל < / em> QIAquick)Qiagen28104לשיבוט
קנמיצין סולפטApplichemA1493לברירה מיקרוביולוגית
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)Sigma-AldrichA8056לבדיקת הפעלה עצמית
L-ארגינין מונוהידרוכלוריד ApplichemA3680לתרבית שמרים
L-איזולאוצין ApplichemA3642לתרבית שמרים
L-ליזין מונוהידרט אפליקציהA3448לתרבית שמרים
L-מתיונין ApplichemA3897לתרבית שמרים
L-פנילאלנין אפליקציהA3464לתרבית שמרים
L-Threonine ApplichemA3946לתרבית שמרים
L-טירוזין ApplichemA3401לתרבית שמרים
L-UracileApplichemA0667לתרבית שמרים
L-Valine ApplichemA3406לתרבית שמרים
מלח L-אדנין המיסולפט ApplichemA1596לתרבית שמרים
0.22 ומיקרו; m מסנן נקבוביותSartorius16541לסינון סטרילי
L-Histidine MonohydrochlorideApplichemA3719לתרבית שמרים
L-Leucine אפליקציהA3496לתרבית שמרים
L-טריפטופן ApplichemA3410לתרבית שמרים
בסיס חנקן שמרים סיגמא-אולדריץ'51483לתרבית שמרים
D-גלוקוז מונוהידרט ApplichemA1349לתרבית שמרים
AgarFisher ScientificBP2641-1לתרבית שמרים וחיידקים
PeptoneApplichemA2208לתרבית שמרים
פוליאתילן גליקול 4000 (PEG)ApplichemA1249לטרנספורמציה של שמרים
ליתיום אצטט דיהידרט (LiOAc)ApplichemA3478לטרנספורמציה של שמרים
DNA זרע סלמון ApplichemA2159לטרנספורמציה של שמרים
נוגדן נגד תג Lex-A (למשל אזור קשירת DNA Anti-LexA)Millipore06-719עבור כתם מערבי
ערכת Plasmid Miniprep (למשל ערכת Miniprep של GenElute Plasmid)Sigma-AldrichPLN350לטיהור פלסמיד משמרים וחיידקים
חרוזי זכוכית שטופים בחומצהSigma-AldrichG8772לטיהור פלסמיד משמרים
Ampicillin נתרן מלחApplichemA0839לבחירה מיקרוביולוגית
תמצית שמריםApplichemA1552לתרבית שמרים
צנטריפוגת רכז ואקום (למשל רכז 5301)EppendorfZ368245 (Sigma)להכנת DNA
וקטור פיתיון (למשל pLexA-N)DualsystemsP01004עבור
וקטור טרף Y2H (למשל pGAD-HA)DualsystemsP01004עבור Y2H
וקטור טרף בקרה (למשל pLexA-p53)DualsystemsP01004עבור Y2H
וקטור פיתיון בקרה (למשל pACT-largeT)DualsystemsP01004עבור Y2H
Electrocompetence E. coli (למשל MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)InvitrogenC640003לשיבוט
זן מדווח שמרים (NMY51:MATahis3Δ 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, למשל NMY51)DualsystemsP01004מפלסטיק Y2H
(למשל Parafilm M)Sigma-AldrichP7793-1EAלתרבית שמרים וחיידקים
(למשל BREATHseal)Greiner676 051לתרבית שמרים
PCR Cycler (למשל T100 Thermal Cycler)Bio-Rad1861096ל-PCR
כמותי PCR Cycler (למשל CFX96 Touch Real-Time Detection System)Bio-Rad1855195
למיקרו-צנטריפוגה PCR כמותית (למשל צנטריפוגה 5417 R)Eppendorf5417 Rציוד
מעבדה כלליצנטריפוגה (למשל צנטריפוגה 5804 R)Eppendorf5804 Rציוד מעבדה כללי
מים נטולי נוקלאז (ללא DNAse, ללא RNAse, ללא פרוטאז)5Prime2500010לעבודות PCR ו-DNA
אזמלSwann-Morton0301להכנת DNA
מסנן סטרילי (0.22 ומיקרו; m; Polyethersulfone)VWR-International514-0073 (מספר קטלוגי אירופי)לתרבית שמרים וחיידקים
צלחות פטרי ואוסלאש; 90 מ"מ גריינר ביו-וואן633180לתרבית שמרים וחיידקים
צלחות פטרי ואוסלאש; 150 מ"מ 639161 גריינר ביו-וואןלפוטומטר תרבית שמרים
(למשל ביופוטומטר)550507804אפנדורףלתרבית שמרים
פוטומטר קובטותמותג 759015לגידול שמרים
אמבט מים (למשל אמבט מים Memmert WB7)MemmertWB7לטרנספורמציה של שמרים
ציוד כתם מערביBio-Radמגווןלזיהוי חלבונים
dNTPs5Prime2201210לשיבוט
צלוחיות שייקר (Erlenmeyer) (100 מ"ל; 1,000 מ"ל; 2,000 מ"ל) ופקקי כותנה נושמים (למשל צלוחיות צרות צוואר של Duran Erlenmeyer)Sigma AldrichZ232793, Z232858, Z232866לאינקובטור תרבית שמרים וחיידקים
(למשל GFL 3031)GFL3031לתרבית שמרים וחיידקים
קלסרKB 53 (E3.1)לתרבית שמרים וחיידקים
מכונת קרח (למשל מכונת קרח IF 825)OmniwashIF 825ציוד מעבדה כללי
0.2 מ"ל, 1.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל בקבוקוני תגובה (פוליפרופילן)Eppendorf0030.124.332 (0.2 מ"ל); 0030.123.328 (1.5 מ"ל); 0030.123.344 (2.0 מ"ל)ציוד מעבדה כללי
פיפטות וקצות פיפטה חד פעמיות (וולומינה שונה: 10 - 1,000 ומיקרו; L)Eppendorfמגווןציוד מעבדה כללי
מפזרSigma-AldrichSPR-L-S01לתרבית שמרים וחיידקים
שייקר מערבולת (למשל < / em> MS 3 Minishaker)IKA3617000ציוד מעבדה כללי
T4-LigaseThermo FisherEL0011לשיבוט
מקרר (4 & deg; C) (למשל Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr81.767.580.4ציוד מעבדה כללי
מקפיא (-20 ° C) (למשל Liebherr Comfort Professional G5216)LiebherrG5216ציוד מעבדה כללי
צילינדר בוגר (למשל מותג)Sigma AldrichZ327352; Z327417; Z327441   ציוד מעבדה כללי
פיפטות סרולוגיות (למשל Fisherbrand)Thermo FisherS55701לתרבית שמרים וחיידקים
פיפטור מכני (למשל Pipetboy acu 2)Integra-Biosciences155000ציוד מעבדה כללי
קובטות לאלקטרופורציה (1 מ"מ)מוצרים ביולוגיים מולקולריים5510-11לטרנספורמציה
של חיידקיםאלקטרופורטור (למשל Eporator)4309000019 Eppendorfלטרנספורמציה של חיידקים
מערכת הדמיה ג'ל וכתם (למשל מערכת ChemiDoc MP)Bio-Rad1708280ציוד מעבדה כללי
צינורות צנטריפוגה חרוטיים (פוליפרופילן) (50 מ"ל)VWR-International 525-0403 (מספר קטלוגי אירופאי)ציוד מעבדה כללי
צינורות צנטריפוגה חרוטיים (פוליפרופילן) (13 מ"ל)BD Falcon352096ציוד מעבדה כללי
Dithiothreitol (DTT; 1 M)Thermo ScientificP2325לקשירת
אדנוזין טריפוספט (ATP, למשל תמיסת ATP (10 מ"מ))אמביון AM8110G (מופץ על ידי Thermo Scientific)לתערובת נשירה של קשירה
ללא היסטידין, לאוצין, טריפטופן ואדנין (DO, למשל תוספי תזונה בינוניים לנשירה סינתטית של שמרים)Sigma-AldrichY2021 Sigma לתרבות שמרים (תערובת מוכנה)
לסרט פרפין

מקורות

  1. Fields, S., Song, O. -K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -M., Corey, S. -J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -W., Gates, P. -B., Garza-Garcia, A. -A., Brockes, J. -P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22(2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -J. -M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835(2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423(2002).
  33. Applichem. N-Lauroylsarcosine sodium salt. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A7402_en_GB.pdf (2015).
  34. Applichem. 2-Mercaptoethanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1108_en_GB.pdf (2015).
  35. Applichem. 2-Propanol. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  36. Applichem. Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A3928_en_GB.pdf (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. Kanamycin sulfate. , https://www.applichem.com/fileadmin/datenblaetter/A1493_en_GB.pdf (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , Wiley Interscience. 1917-1952 (2008).
  41. Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -T., Scofield, R. -H. Protein Blotting and Detection. , Humana Press. (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. Yeast Transformation and Cloning. , JoVE Science Education Database. Cambridge, MA (USA). (2016).
  45. Sigma-Aldrich. 3-Amino-1,2,4-triazole. , http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=IT&language=EN-generic&productNumber=A8056&brand=SIGMA&PageToGoToURL=http%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcatalog%2Fproduct%2Fsigma%2Fa8056%3Flang%3Dit (2016).
  46. Ames, B. -N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -K., Ramm, E. -I., Pabo, C. -O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -R., Yuan, L. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. Yuan, L., Perry, E. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים