הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55160

⸱

6 בינואר 2017

 , 
1Department of Cell and Development Biology, Vanderbilt University Medical School

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

תקציר

זלוף מבוסס פרוטוקולי איון-במנותק pancreata היונק הגדול מבוססים היטב. פרוטוקולים כאלה נערכים בקלות במעבדות רבות בשל גודלו של צינור הלבלב המאפשר להזרקת collagenase מוכנה זלוף רקמות שלאחר מכן. לעומת זאת, בידוד איון מ pancreata הקטן, כמו זה של עכברים בילוד, הוא מאתגר בגלל זלוף הוא לא בר השגה בקלות את pancreata הקטן. כאן אנו מתארים הליך פשוט מפורט משחזרים מספרים משמעותיים של איים מעכברים שזה עתה נולדו עם סיוע חזותי. pancreata כולו גזור טרי היו מתעכל עם 0.5 מ"ג / מ"ל ​​collagenase IV מומס תמיסת מלח מאוזן "הנקס (HBSS) על 37 מעלות צלזיוס, צינורות microcentrifuge. צינורות היו טפח באופן קבוע כדי לסייע בפיזור רקמות. כאשר רוב הרקמה פוזרה לאשכולות קטנים סביב 1 מ"מ, lysates נשטף שלושה עד ארבעה פעמים עם תקשורת ותרבות עם 10% בסרום שור עוברי (FBS). אשכולות איילט,נטול רקמות acinar לזיהוי, ניתן לשחזר אז תחת לנתח סטריאוסקופ. שיטה זו משחזרת 20 - 80 קטנה עד איים גדולים בגודל לכל לבלב של עכבר שזה עתה נולד. איים אלה מתאימים מבחנים במורד זרם על הדעת ביותר, כולל הפרשת אינסולין, ביטוי גנים, ותרבות. דוגמא assay הפרשת אינסולין מוצגת כדי לאמת את תהליך הבידוד. הרקע הגנטי ומידת העיכול הם הגורמים הגדולים בקביעת התשואה. טרי פתרון collagenase עשה עם פעילות גבוהה הוא מועדף, כפי שהוא מסייע בבידוד אנדוקריני אקסוקרינית. הנוכחות של קטיונים [סידן (Ca 2 +) ומגנזיום (Mg 2+)] בכל פתרונות בסרום שור העובר בכביסה / מדיה לקטוף נחוצים תשואה טובה של איים ביושר ראוי. היקף ניתוחים עם ניגודיות והגדלה טובות יעזור גם.

מבוא

בידוד איי לבלב טהורים חיוני לבדיקת הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) של תאי בטא ולהשתלת איים מתורמי גופות 1-3. כמו כן, יש צורך לבסס ביטוי גנים אנדוקריני בתאי איים 4, 5. לשם כך נקבעו פרוטוקולים מפורטים המאפשרים בידוד של איי הלבלב מהלבלב הגדול (6 והפניות שם). שיטות אלו מבוססות על זלוף אנזימטי כדי לנתק את האצינר מרקמות האי, יחד עם הפרדת שיפוע וקטיף ידני. לפיכך, בידוד איים מלבלב גדול יכול להתבצע בקלות ברוב המעבדות. מצד שני, לא קיים פרוטוקול מפורט צעד-אחר-צעד המאפשר בידוד של איים מהלבלב שהם קטנים מכדי לחלחל.

חשוב לחקור את ביטוי הגנים והתפקוד של איים יילודים. לאיי יילודים יש תכונות שונות ממבוגרים בהפרשת אינסולין ויכולת התפשטות 7, 8. עם זאת, בידוד איים מבעלי חיים שזה עתה נולדו, במיוחד עכברים, הוא מאתגר בשל גודלו הקטן של הלבלב שזה עתה נולד. הגודל מונע את תהליך הזלוף הרגיל כאשר קולגנאז מוזרק דרך צינור הלבלב. ואכן, מספר מאמרים הציגו מחקרים בקווים אלה, עם הליכי בידוד בעזרת אנזימים או לא אנזימים 7, 9, 10. עם זאת, תיאור מפורט של תהליך בידוד האיים עם עזר חזותי חסר 7, 9, מה שהופך את זה לאתגר עבור רוב החוקרים לבצע מחקרים דומים.

חקרנו כמה תנאים שונים שמניבים איים באיכות גבוהה מעכברים שזה עתה נולדו. כאן אנו מציגים פרוטוקול שצפוי לעזור לחוקרים ללמוד את הפרטים העיקריים בתהליך בידוד האיים. פרוטוקול זה חל על לבלב עכבר עד גיל שבועיים, ולאחר מכן ניתן לבצע זלוף לבידוד שגרתי של איים. ניתן להשתמש באיים ישירות להפרשת אינסולין ולמבחני ביטוי גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שימוש בבעלי החיים כדלקמן הנהלים המפורטים בפרוטוקול M / 11/181 אושרה על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת שימוש עבור גו. עכברי CD1 או CBA / BL6 נרכשו מיצרנים מסחריים וחצו במתקן החיה ונדרבילט להשיג עכברים בילוד.

1. הכנת עכברים, פתרונות מניות, וציוד

  1. עבור צלב העכבר: להגדיר צלב עכבר ולהקליט את תאריכי חיבור על מנת לסייע בתכנון ניסוי. עכברי CD1 בדרך כלל ללדת סביב יום 19 לאחר ההזדווגות. השתמש CD1 או CBA / BL6 חוצה להשיג CD1 או CBA / BL6 בילודים, בהתאמה. Intercrosses בין שני הקווים לנצל נקבות CD1 ו CBA / זכרי BL6.
  2. עבור מניות collagenase: לשקול IV סוג collagenase 200 מ"ג עם מאזן דיוק גבוה. מעבירים צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. ממיסים ב 40 מ"ל HBSS עם Ca 2 + / 2 + Mg (1.26 ו -0.5 מ"מ, בהתאמה) כדי להפוך פתרון מניות 5 מ"ג / מ"ל.
    1. אפשר collagenase כדילפזר עבור ~ 30 דקות עם רעד עדין. Aliquot ולשמור הפתרון קפוא -20 ° C כמניות, אשר נשאר פעיל במשך לפחות שנה אחת.
  3. החיטוי לעקר כמה זוגות של פינצטה, מספריים, וטיפים P20 לנתיחה קטיף איון.
  4. עבור המניות גלוקוז 1 M: לשקול גלוקוז 9 גרם צינור צנטריפוגות 50 מ"ל, להוסיף 50 מ"ל RPMI 1640 מדיה לפזר את הסוכר. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, אך לא יותר מ -6 חודשים.

2. פתרונות עבודה

הערה: היום של בידוד איון, להכין את ריאגנטים הבאים.

  1. לקבלת הפתרון עובד מסוג IV collagenase: הפשרה לדלל מניות collagenase על קרח. לוותר 0.15 מ"ל המניות לתוך כל צינור 1.7 מ"ל microfuge. להוסיף 1.35 מ"ל HBSS עם Ca 2 + / Mg 2+. להפוך את הצינור 5 פעמים. השאר על קרח למשך 15 דקות.
    1. ספין במהירות גבוהה במשך 3 דקות ב microcentrifuge. העברת supernatant לצינור חדש. השאר על קרח עד לשימוש. מחק את הצינור עם פסולת מסיסה.
  2. עבור מדיה מלאה RPMI 1640: להוסיף גלוקוז M 2.5 מ"ל 1, 50 מ"ל חום מומת FBS, ו -5 המניות מ"ל 100x עט סטרפטוקוקוס לתוך 500 מ"ל התקשורת RPMI 1640. השאר על קרח עד לשימוש.

בידוד לבלב 3. עיכול

  1. להרדים בילודים עם isoflurane, ואחריו עריפת ראש פי הפרוטוקולים שאושרו.
  2. הנח את העכבר עם הבטן שלה פונה כלפי מעלה. תרסיס עם אתנול 70% עבור עיקור.
  3. הרם את העור בבטן עם פינצטה לחתוך את שכבות העור והשרירים longitudinally לאורך קו האמצע עם זוג מספריים, מאזור איברי המין אל כלוב הצלעות. פעולה זו פותחת את חלל הבטן לחשוף את כל האיברים הפנימיים.
  4. להעביר את כל האיברים הפנימיים לצלחת 100 ס"מ עם פינצטה. אתר את הלבלב, אשר הוא איבר-מפוזר עם חלק הגבה שדבק הקיבה והטחול וחלק גחון נאחז אל התריסריון 11.
  5. הוספת HBSS לתוך הצלחת כדי להטביע את האיברים. בתמיסה, רקמות הלבלב כבר לא נאחזות תריסריון, קיבה, או הטחול. זה לזיהוי בקלות תחת בהיקף לנתח בגלל צבע לבן האופיינים. השתמש פינצטה לקלף רקמות הלבלב הרחק הרקמה שמסביב ולהעביר לצלחת 60 מ"מ חדש עם HBSS.
  6. חותכים כל הלבלב עם מספריים לחתיכות קטנות יותר מ -5 מ"מ על פני כל מימד. מעבירים צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. עד חמישה pancreata (מתחת לגיל P7) ניתן לעכל בצינור אחד. עבור עכברי P8-P16, להשתמש בצינור אחד לכל לבלב.
  7. הוסף 0.5 - 1 מ"ל collagenase פתרון עובד על צינור אחד (0.2 מ"ל לכל הלבלב P1-P7 השתמש 0.5 מ"ל לכל הלבלב P8-P16.). השאירו את הצינור 37 ° C חממה עד 15 דקות. להפוך את הצינור שתי פעמים בכל דקה.
  8. אחרי ~ 5 דק ', לחץ על צינור לפקח על מצב מערכת העיכול של רקמת לבלב. המשך תהליך העיכול עד שרוב הלבלברקמה מופיעה צבירי תאים מפוצלים כמו, עם קוטר <2 מ"מ. את lysate יופיע מעונן, אשר נובע autolysis תא acinar הנורמלי.

4. כביסה Lysate

  1. ספין lysate ב XG 500 עבור 10 שניות ב microcentrifuge. הסר את שכבת supernatant עם pipetman P1,000. את supernatant אמור להופיע עכורים אבל נטול צבירי תאים. אין להשתמש שאיפה, אשר עשוי במהירות לשאוב משם שברי הרקמה בתחתית בשל נוכחותם של כמה DNA דביק.
  2. הוסף 1 מ"ל RPMI 1640 מדיה מלאה. קש הצינור בעדינות resuspend lysate המקוטעת. היפוך למעלה ולמטה 10 פעמים. חזור על שלב 4.1.
  3. חזור על שלב 4.2 פעמים נוספות או עד supernatant נראה ברור ומובן. Re- להשעות שברי הלבלב לרחוץ 1 מ"ל להשלים התקשורת RPMI 1640.

5. בידוד איילט

הערה: נתונים נמוכים pancreata, בחירה ידנית ישיר להלן (5.1) יכול לשמש איון Isolation. עבור מספר גדול של pancreata (> 6), השיטה המפורטת 5.2 עדיפה.

  1. יד חיטוט ישיר:
    1. העבר lysate משלב 4.3 כדי בצלחת 60 מ"מ. הוסף 5 מ"ל להשלים התקשורת RPMI 1640. תביא תחת מיקרוסקופ לנתח.
    2. הגדרת התאורה בשדה הבהירה על המיקרוסקופ. התאם את עוצמת האור ל ~ 50% של הכוח המרבי. תחת תנאי זה, איים להופיע אשכולות ורודים כמו מעט, בעוד אשכולות סדירים בצורה כהות תאי acinar כמו (איור 1 א). בהגדלה של ~ 50X (שילוב העוצמה של המטרה לבין עֵינִית) מומלץ להציע את הדרך הטובה ביותר של איים חזותי ופתיחת טיפ pipet זמנית לקטיף.
    3. ירים איים עם קצה פיפטה P20 תוך הימנעות אשכולות acinar. לוותר איים מועשר שברים לצלחת 60 מ"מ חדש עם התקשורת להשלים RPMI (איור 1B).
    4. חזור על תהליך הקטיף-יד עוד פעמים. השאר איים טהורים בתוך 60 חדשיםצלחת מ"מ עם 4 מ"ל להשלים RPMI התקשורת (תרשים 1C).
  2. צנטריפוגה Gradient:
    1. הכן צינור צנטריפוגות 15 מ"ל כי הוא מראש עם 2 מ"ל polysucrose ונתרן diatrizoate בצפיפות של 1.077 גרם / מ"ל. השאירו את הצינור על הקרח עד לשימוש.
    2. מעבירים את ההשעיה משלב 4.3 על גבי החלק העליון של הפתרון diatrizoate polysucrose ונתרן עם פיפטה פסטר. נא לא להפריע את השכבה התחתונה. רקמות ממרחק של עד 10 שזה עתה נולד או 2 P17 pancreata ניתן לטעון לתוך צינור אחד 15 מ"ל.
    3. לסובב את הצינור ב ~ 600 XG ב רוטור נדנדה במשך 15 דקות ב 4 ° C. השתמש בהגדרות בלם פעמי.
    4. לאחר צנטריפוגה, להעביר את התקשורת ואת שכבות ביניים (לציין כי בתנאי פעולה אידיאליים, האי ימוקם שלבי ביניים בין תקשורת polysucrose והתרבות לאחר צנטריפוגה) לתוך צינור 15 מיליליטר חדש. הוסף 10 מ"ל התקשורת, ומערבבים בעדינות אך ביסודיות.
    5. ספין למטה השבר מועשר איוןב XG 300 במשך 5 דקות. הסר את המדיה לשטוף. חזור על לשטוף עוד פעם אחת עם התקשורת RPMI להשלים. כדורי Resuspend ב 4 מ"ל התקשורת, אשר מכיל בעיקר איים ותעלות (1D איור).
    6. לבחור ידנית איים כמתואר בסעיף 5.1.

6. מבחני GSIS ב איים מבודדים

  1. דגירה איים משלב 5.1.4 התקשורת RPMI להשלים עבור 2 שעות באינקובטור בתרבית רקמה 37 ° C.
  2. השתמש פיפטה להסיר RPMI תחת מיקרוסקופ לנתח. הוסף 3 מ"ל פתרון KRB עם 2.8 מ"מ גלוקוז לצלחת 3. מערבולת 10 פעמים כדי לשטוף את האיונים. הסר פתרונות KRB.
    1. חזור על תהליך הכביסה פעם. דגירה איים עם 3 מ"ל פתרון KRB על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באינקובטור.
  3. Aliquot 1 מ"ל KRB לבאר כל צלחת 12-היטב. טרום לחמם את מניות צלחת KRB עד 37 ° C באינקובטור.
  4. שטוף את האיים פעמים עם KRB מחומם מראש כמו 6.2. עָבָרfer 10 איים היטב בכל הלוחות מחומם מראש. מדגירים 37 ° C חממה.
  5. לאחר 45 דקות, למשוך 50 μL של supernatant. זו כוללת את פתרון האינסולין המופרש תחת גלוקוז הבזליים.
  6. להוסיף 32 גלוקוז μL 500 מ"מ. מערבולת את הצלחת 20 פעמים כדי לערבב את הפתרון. מדגירים 37 ° C חממה. מערבולת הצלחת 5 פעמים אחת ל -5 דקות.
  7. לאחר 45 דקות, לסגת supernatant 50 μL. זהו האינסולין המופרש תחת גלוקוז גבוה.
  8. להעביר את כל האיונים לצינור מ"ל 1.5. להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להפשיר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. חזור על תהליך ההקפאה להפשרה.
  9. הוסף 0.5 מ"ל 70% אתנול עם 20 מ"מ HCl. ולהשאיר למשך הלילה. זהו האינסולין נותרו איים.
  10. השתמש קונבנציונאלי ELISA כדי assay רמות אינסולין, שתואר לעיל 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתנאים אופטימליים, השיטה המוצגת יכולה להניב 20 - 80 איים מכל לבלב עכבר קטן. מספר זה תלוי ברקע הגנטי, גיל של עכברים, ואת הגודל של איים להיות התאושש. בין נפוץ, CD1 מחוץ התרבו C57BL / 6J טהורי גזע מייצרים פחות איים עם גודל קטן יותר מאשר מכוניות היברידיות בין CD1 ו C57BL / 6 או B6CBAF1 מסחרי / עכברים J לעשות. יד ישירה לקטוף בדרך כלל נתנה מספר קטן יותר של אי, כנראה עקב הדרת האיים קטנים שעלולה להיות קשה מוכרים כאשר מעורבבים עם רקמות אקסוקרינית (א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול על בידוד איון מ pancreata כי הם קטנים מדי עבור זלוף קונבנציונלי. זה צפוי להניב אי מוכן לכל מחקרים מבוססי האיון כגון טיהור בטא תאים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות בטא תאי איון, התפשטות, תגובות דחק תא, הישרדות תא, מטבוליזם, ותחזוקת GSIS פונקציונלית, וכו. זה יהיה, למיטב ידיעתנו, הפרוטוקול החזותי המפורט הראשון שמנחה חוקרים חדשים לבצע בידוד איון מעכברים בילוד. בלי עוזרים חזותי אלה, ניסוי וטעייה נרחב צפוי עבור רוב החוקרים להשיג בידוד איון מוצלח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים לעבודה המתוארת.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ-NIDDK (DK065949 עבור GG). אנו מודים לד"ר ברנדה מ. ג'רוויס ולג'ף דוריאה ג'וניור על קריאת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז סוג IVסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MOC5138
1x HBSS עם Ca2+/Mg2+Mediatech/Cellgro, Manassas, VAMT21020CVאם מתקבל HBSS ללא Ca2+/Mg2+, ניתן להוסיף CaCl2 ו-MgSO4 1.26 ו-0.5 מ"מ, בהתאמה. 
RPMI 1640 w/o גלוקוזThermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA11879-020יש להוסיף גלוקוז לרמות ספציפיות כדי לא להפריע לשימוש הבא באיים. 
גלוקוזסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזוריG-7021 
תמיסת פוליסוכרוז ונתרן דיאטריזואטסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, מיזוריHistopaque-10771
סטריאוסקופCarl-Zeiss , אוברקוכן, גרמניהStemi2000
StereoscopeLeica , וצלר, גרמניהLeica M165
מיקרוצנטריפוגהEppendorf , Hauppauge , ניו יורקצנטריפוגה 5417C
צנטריפוגהEppendorfHauppauge, NYצנטריפוגה 5810R
צינורות צנטרפוגה 15 מ"לVWR, Radnor, PA89039-666
צינורות צנטרפוגה 50 מ"לVWR, Radnor, PA89039-658
איזון דיוקVWR, Radnor, PAVWR-225AC
צינורות מיקרופוגהVWR, Radnor, PA87003-294
Pipetman P1000Fisher Scientific,  וולת'אם, מסצ'וסטסF123602
פיפטמן P20פישר סיינטיפיק,  Waltham, MAF123600
צלחת 100 x 15 מ"מVWR, Radnor, PA25384-088
צלחת 60 x 15 מ"מVWR, Radnor, PA25384-168
צלחות 12 בארותVWR, Radnor, PA665-180
כליםמדעיים עדינים מספריים, פוסטר סיטי, CA14080-11
פינצטהכלים מדעיים משובחים, פוסטר סיטי, CA5708-5
עכברי CD1מעבדות צ'ארלס ריבר, וילמינטון, MA CD-1
C57BL/6Jמעבדת ג'קסון, פרמינגטון, קונטיקט C57BL/6J
B6CBAF1/Jמעבדת ג'קסון, פרמינגטון, קונטיקט B6CBAF1/J

מקורות

  1. Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
  2. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
  3. Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
  4. Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
  5. Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
  6. London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
  7. Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
  8. Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
  9. Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  10. Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
  11. Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445(2015).
  12. White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
  13. Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
  14. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HBSS
בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.