Method Article

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה באתרו הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

DOI:

10.3791/55162

⸱

January 11th, 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה מייננת (IR) גורמת למספר רב של סטיות כרומוזומליות יציבות ולא יציבות. ניתן לזהות בקלות סטיות לא יציבות, שבהן המורפולוגיה של הכרומוזומים נפגעת באופן משמעותי, על ידי טכניקות צביעת כרומוזומים קונבנציונליות. עם זאת, איתור סטיות יציבות, הכרוכות בהחלפה או טרנסלוקציה של חומרים גנטיים ללא שינוי ניכר במורפולוגיה של הכרומוזומים, דורש טכניקות צביעת כרומוזומים מתוחכמות המסתמכות על הכלאה באתרה של בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית, טכניקת צביעת כרומוזומים הידועה בכינויה פלואורסצנטיות באתרה הכלאה (FISH). בדיקות FISH יכולות להיות ספציפיות לכרומוזום שלם או תת-אזור מדויק בכרומוזום. השיטה לא רק מאפשרת הדמיה של סטיות יציבות, אלא היא יכולה גם לאפשר זיהוי של הכרומוזום או רצף ה-DNA הספציפי המעורב בהיווצרות סטייה מסוימת. מגוון טכניקות צביעת כרומוזומים זמינות בציטוגנטיקה; כאן נדונות שתי שיטות רגישות ביותר, הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY), לזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות הנוצרות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף. למרות ששתי הטכניקות מסתמכות על בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית, שיטת הזיהוי ותהליך רכישת התמונה של האותות הפלואורסצנטיים שונים. שתי טכניקות אלו שימשו בתחומי מחקר שונים, כגון ביולוגיה של קרינה, ציטוגנטיקה של סרטן, ביודוסימטריה רטרוספקטיבית של קרינה, ציטוגנטיקה קלינית, ציטוגנטיקה אבולוציונית וציטוגנטיקה השוואתית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתי השיטות האמינות ביותר לזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות הנגרמות על ידי קרינה הן הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH), המאפשרת צביעה של שני כרומוזומים או יותר בו זמנית, וקריוטיפ ספקטרלי (SKY), המקנה צבע מובהק לכל זוג כרומוזומים הומולוגי בגנום. בניגוד לאברציות לא יציבות, סטיות יציבות הן מתמשכות בטבען ועשויות להתפשט במשך מספר דורות באוכלוסיות מוקרנות1, ונחשבות ל"חתימות" מולקולריות קריטיות של נגעים ציטוגנטיים המושרים על ידי קרינה2. מחקרים שנערכו על ידי קבוצות שונות הראו כי סטיות יציבות קשורות לפתוגנזה ולהתפתחות של מספר מחלות, כולל סרטן3. לפני עידן צביעת הכרומוזומים (המכונה גם ציטוגנטיקה מולקולרית), טכניקת G-banding הקונבנצ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם קפדנית עם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. פרוטוקול בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה. כל החיות שוכנו תחת מתקן חיה ממוזגת סטנדרטית 20 ± 2 ° C עם 10 - 15 מחזורים של שעות של אוויר צח גישה חופשית למזון מכרסם רגיל ומים. עם ההגעה, העכברים הוחזקו בבידוד במשך שבוע 1 ובתנאי צ'או מכרסם מוסמך.

חשיפת 1.Radiation ו במעצר Vivo של תאי Metaphase

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    הקרנת גוף סה"כ גורמת סטיות כרומוזומליות רבות של תאי מח עצם של עכברים מוקרנים. הפרוטוקול הנוכחי הוא מותאם במיוחד in vivo מעצר mitotic של תאי מח עצם לאחר חשיפה לקרינה, קציר של תאי מח עצם של הרגליים האחוריות של עכברים מוקרנים, בידוד של תאי mononuclear מח עצם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, הכנת ממרחי תא metaphase, ובעקבות זיהוי של סטיות כרומוזומליות יציבות מושרה קרינה על ידי טכניקות mFISH ושמים. ציור כרומוזום באמצעות טכניקות אלה יכולים לשמש כד.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    שלבים קריטיים כמה לקבוע את ההצלחה של mFISH ושמים. השלב הראשון והקריטי ביותר הוא כדי לייעל את הטיפול קולכיצין מעצר mitotic in vivo של תאים mononuclear מח עצם. שעת הריכוז וטיפול קולכיצין בנפרד או בתיאום לקבוע את מדד mitotic וכן כרומוזום עיבוי ושתיים תנאים המוקדמים חשובים לציור כרומוזום יעיל. זמן טיפול גבוה קולכיצין ריכוז או יותר מוביל הכרומוזומים מרוכז מאוד, עולה בקנה אחד עבור denaturation ואת ההכלאה נכונה. יתר על כן, זיהוי מדויק של rearrangements המורכבת בתא metaphase להתפ.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    מחקר זה מומן על ידי ארקנסו שטח גרנט Consortium ונשיונל שטח Biomedical Research Institute דרך לאומי ומסוכנות החלל, מעניק NNX15AK32A (RP) ואת RE03701 (MH-J), ו P20 GM109005 (MH-J), ואת ותיקי המינהל ארה"ב ( MH-J). אנו מודים כריסטופר Fettes, רכזת תוכנית עבור משרד סביבתיים בעיסוק הבריאות באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה, לסיוע העריכה ב הכנת כתב היד.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    פורממידסיגמא-אולדריץ'221198-100 מ"ל
    SSC מאגר 20 ופעמים; תרכיזSigma-AldrichS6639-1L
    SKY מגיב מעבדהלהדמיה ספקטרלית יישומיתFPRPR0030/M40
    CAD - ערכת זיהוי נוגדנים מרוכזתהדמיה ספקטרלית יישומיתFPRPR0033
    צבעים בודדים מותאמים אישית - 3 צבעים; כרומוזום עכבר 1: אדום, כרומוזום עכבר 2: ירוק, כרומוזום עכבר 3: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
    כיסויי זכוכיתFisher Scientific12-545B
    Tween 20Fisher ScientificBP337-100
    חומצה הידרוכלורית, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
    פישרברנד כלי צביעת זכוכית  עם מכסה בורגפישר סיינטיפיק08-816
    KaryoMAX תמיסת אשלגן כלורי Life Technologies10575-090
    פישרברנד Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
    אבקת קולצמידפישר סיינטיפיק50-464-757 
    Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
    Shepherd Mark I, דגם 25 137Cs irradiatorJ. L. Shepherd & Associatesדגם 484B
    מזרק 1 מ"לBD Biosciences647911
    אלכוהול אתילי, 200 הוכחהפישר סיינטיפיקMEX02761
    PBS, (1x PBS Liq.), עם סידן ומגנזיוםפישר סיינטיפיקICN1860454
    סרום בקר עובריפישר סיינטיפיק10-437-010
    מתנולפישר סיינטיפיקA454SK-4
    חומצה אצטית קרחוניתפישר AC295320010
    מיקרוסקופ ZeissZeissAXIO Imager.Z2
    של עכבר

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
    2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Inter chromosomal Stable AberrationsMultiple Fluorescence In Situ HybridizationSpectral KaryotypingBone Marrow CellsTotal Body IrradiationMetaphase Cell SpreadsFluorescence MicroscopyChromosome PaintingCytogenetic AnalysisRadiation Biology

    Related Articles