הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה

9.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55162

⸱

11 בינואר 2017

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

תקציר

קרינה מייננת (IR) גורמת למספר רב של סטיות כרומוזומליות יציבות ולא יציבות. ניתן לזהות בקלות סטיות לא יציבות, שבהן המורפולוגיה של הכרומוזומים נפגעת באופן משמעותי, על ידי טכניקות צביעת כרומוזומים קונבנציונליות. עם זאת, איתור סטיות יציבות, הכרוכות בהחלפה או טרנסלוקציה של חומרים גנטיים ללא שינוי ניכר במורפולוגיה של הכרומוזומים, דורש טכניקות צביעת כרומוזומים מתוחכמות המסתמכות על הכלאה באתרה של בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית, טכניקת צביעת כרומוזומים הידועה בכינויה פלואורסצנטיות באתרה הכלאה (FISH). בדיקות FISH יכולות להיות ספציפיות לכרומוזום שלם או תת-אזור מדויק בכרומוזום. השיטה לא רק מאפשרת הדמיה של סטיות יציבות, אלא היא יכולה גם לאפשר זיהוי של הכרומוזום או רצף ה-DNA הספציפי המעורב בהיווצרות סטייה מסוימת. מגוון טכניקות צביעת כרומוזומים זמינות בציטוגנטיקה; כאן נדונות שתי שיטות רגישות ביותר, הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY), לזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות הנוצרות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף. למרות ששתי הטכניקות מסתמכות על בדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית, שיטת הזיהוי ותהליך רכישת התמונה של האותות הפלואורסצנטיים שונים. שתי טכניקות אלו שימשו בתחומי מחקר שונים, כגון ביולוגיה של קרינה, ציטוגנטיקה של סרטן, ביודוסימטריה רטרוספקטיבית של קרינה, ציטוגנטיקה קלינית, ציטוגנטיקה אבולוציונית וציטוגנטיקה השוואתית.

מבוא

שתי השיטות האמינות ביותר לזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות הנגרמות על ידי קרינה הן הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH), המאפשרת צביעה של שני כרומוזומים או יותר בו זמנית, וקריוטיפ ספקטרלי (SKY), המקנה צבע מובהק לכל זוג כרומוזומים הומולוגי בגנום. בניגוד לאברציות לא יציבות, סטיות יציבות הן מתמשכות בטבען ועשויות להתפשט במשך מספר דורות באוכלוסיות מוקרנות1, ונחשבות ל"חתימות" מולקולריות קריטיות של נגעים ציטוגנטיים המושרים על ידי קרינה2. מחקרים שנערכו על ידי קבוצות שונות הראו כי סטיות יציבות קשורות לפתוגנזה ולהתפתחות של מספר מחלות, כולל סרטן3. לפני עידן צביעת הכרומוזומים (המכונה גם ציטוגנטיקה מולקולרית), טכניקת G-banding הקונבנציונלית הייתה השיטה היחידה לאיתור סטיות כרומוזומליות יציבות. עם זאת, רצועות כרומוזומים מהוות אתגר לציטוגנטיקאים מכיוון שהרזולוציה מוגבלת, יכולת השחזור אינה ודאית, זהו הליך עתיר עבודה, והוא דורש ציטוגנטיקאים מיומנים ומנוסים ביותר לפירוש נתונים אמין4. יתר על כן, טכניקת הרצועות הקלאסית אינה מאפשרת זיהוי של סידורים מחדש כרומוזומליים מורכבים, הכוללים אינטראקציה של שלושה או יותר הפסקות המופצות בין שני כרומוזומים או יותר, תוצאה שכיחה של נזקי קרינה. סטיות מורכבות עשויות להימשך אצל אנשים שנים רבות לאחר החשיפה לקרינה, מה שהופך אותן לשימושיות עבור ביודוסימטריה רטרוספקטיבית5. לכן, נדרשה גישה חלופית כדי להתגבר על המגבלות של טכניקות רצועות קונבנציונליות לאיתור סידורים מחדש כרומוזומליים יציבים.

בסוף שנות ה-60 של המאה ה-20, עבודתם החלוצית של גל ופרדו (1969) על הכלאה מולקולרית באמצעות בדיקות חומצות גרעין המסומנות בחומר רדיואקטיבי החלה עידן חדש בתחום הציטוגנטיקה, שאיפשר זיהוי של רצף DNA ספציפי בכרומוזומים6. עם זאת, לשימוש בבדיקות רדיואקטיביות להכלאה מולקולרית היו מספר חסרונות: בדיקות רדיואקטיביות אינן יציבות יחסית, פעילות הבדיקה תלויה בדעיכה רדיואקטיבית של האיזוטופ המשמש, הכלאה אורכת זמן רב יותר, הרזולוציה מוגבלת, הבדיקות יקרות יחסית והחומרים הרדיואקטיביים מסוכנים בריאותית. לפיכך, היה צורך לפתח ולתכנן בדיקות לא רדיואקטיביות. הכנסת בדיקות חומצות גרעין מתויגות פלואורסצנטיות בשנות ה-80 וה-90 התגברה על המגבלות של בדיקות רדיואקטיביות ושיפרה מאוד את הבטיחות, הרגישות והספציפיות של טכניקת ההכלאה7-10. בדיקות פלואורסצנטיות מולידים אותות בהירים במיוחד כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופים פלואורסצנטיים המצוידים במסנני עירור ופליטה מתאימים. כל אובדן, רווח או סידור מחדש של כרומוזום/ים פלואורסצנטיים או חלק מהכרומוזום ניתנים לזיהוי בקלות בטכניקת FISH זו.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות על ידי ציור FISH הוביל להתקדמות ניכרת במחקר הציטוגנטי לאורך השנים. תכנון בדיקות עם תוויות פלואורסצנטיות ליישומים ספציפיים החל מבדיקות ספציפיות ללוקוס ועד בדיקות צביעה של כרומוזום שלם קידם את התחום באופן משמעותי; זה גם הקל על זיהוי סידור מחדש תת-מיקרוסקופי ("קריפטיק"), שלא היה אפשרי על ידי רצועות כרומוזומים קונבנציונליות. ציור כרומוזומים על ידי mFISH ו-SKY הוכיח את עצמו ככלים רבי ערך לזיהוי סידורים בין-כרומוזומליים פשוטים ומורכבים. העקרונות הבסיסיים של שתי הטכניקות דומים, אך שיטת הזיהוי וההבחנה של אות פלואורסצנטי לאחר הכלאה באתרו ותהליך רכישת התמונה שונים. ב-mFISH, תמונות נפרדות של כל אחד מארבעת הפלואורוכרומים נלכדות באמצעות מסנני מיקרוסקופ פס צרים; לאחר מכן משתמשים בתוכנה ייעודית לשילוב התמונות. בעוד ב-SKY, רכישת התמונה מבוססת על שילוב של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, הדמיית מכשיר מצמד מטען וספקטרוסקופיה פורייה, המאפשרת מדידה של כל ספקטרום הפליטה בחשיפה אחת בכל נקודות התמונה. גם ב-mFISH וגם ב-SKY, תמונות מונוכרום נלכדות באופן עצמאי, ואז מתמזגות, ולבסוף, פסאודו-צבעים ייחודיים מוקצים לכרומוזומים בתמונות מונוכרומטיות על סמך הצבע הספציפי המחובר לכל בדיקה פלואורוכרום.

התרומה של ניתוח mFISH ו-SKY בתחום הביולוגיה של הקרינה היא יוצאת דופן, במיוחד להערכת מינון רטרוספקטיבית של חשיפה אנושית ל-IR (ביודוזימטריית קרינה)11-14, הערכת סיכון לסרטן קרינה15, כמו גם איתור והערכת סיכון של סרטן משני הקשור לרדיותרפיה16. מחקר שנערך לאחרונה על עכברים הראה כי טכניקת צביעת כרומוזומים מבוססת FISH היא גם כלי חשוב להערכת היעילות של אמצעי נגד קרינה17. במחקר הנוכחי הודגמה ההשפעה של חשיפה כוללת לקרינה בגוף על השראת סטיות כרומוזומליות יציבות בתאי מח העצם של עכברים באמצעות טכניקות mFISH ו-SKY.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם קפדנית עם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. פרוטוקול בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה. כל החיות שוכנו תחת מתקן חיה ממוזגת סטנדרטית 20 ± 2 ° C עם 10 - 15 מחזורים של שעות של אוויר צח גישה חופשית למזון מכרסם רגיל ומים. עם ההגעה, העכברים הוחזקו בבידוד במשך שבוע 1 ובתנאי צ'או מכרסם מוסמך.

חשיפת 1.Radiation ו במעצר Vivo של תאי Metaphase

  1. לחשוף בלתי מורדם עכברים 2 קרינת הגוף כולו Gy בתא הקרנה. במהלך הקרנה, עכברי מקום בתא חזק מאוורר היטב כדי לוודא שהם לא לנוע בחופשיות ולקבל מנה אחידה.
  2. להזריק 100 μL של פתרון קולכיצין 0.05% (גאבקת olchicine מומס סידן ומגנזיום חינם PBS) intraperitoneally באמצעות מחט 25 G מצורף עם 1 מ"ל מזרק חד פעמי. הימנע הזרקה ישירות לתוך כל איבר.
  3. השאר את החיה בכלוב עבור 2 שעות לפני קציר תאים במח העצם. שים החיה בחיפוש אחר סימנים של כאב או מצוקה.

קציר ובידוד 2. תא מח העצם של תאי mononuclear מח העצם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות

  1. להרדים את העכבר על ידי מחנק 2 CO.
  2. תרסיס אתנול 70% על הגב ועל הצד הגחוני.
  3. ביצוע חתך 2 ס"מ על עור הבטן במספריים חדים. אחוז העור משני צדי החתך עם פינצטה בוטה משוך בעדינות לפתוח את שרירי הבטן.
  4. חותכים שתי הרגליים האחוריות במספריים ומיד למקם אותם PBS מראש צונן עם 4% FBS.
  5. בזהירות לנקות את כל השרירים מחוברים הגפיים האחוריים עם תחבושת סכיני גילוח וכותנת גזה חדה.
  6. הפרד את השוקה מן הירך. חתוך את שני קצותיו של כל עצם עם סכיני גילוח.
  7. לרוקן את התוכן של מח העצם עם 3 מ"ל PBS (עם 4% FBS) באמצעות מחט 23 G מצורף מזרק 3 מ"ל ולאסוף התוכן צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לעבור את ההשעיה תא לפחות 10 פעמים באמצעות מחט כדי לעשות השעיה תא בודד.
  8. בזהירות כיסוי השעית התא על נפח שווה של מדיום הפרדה לימפוציטים (3 מיליליטר) מבלי להפריע את הממשק בין השעית התא ובינוני הפרדה לימפוציטים. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. אסוף את המעיל באפי בזהירות מבלי להפריע את השכבות האחרות והעברת צינור צנטריפוגות 15 מ"ל חדש.

3. הכנת ממרחים Cell Metaphase

  1. הוסף 10 מ"ל PBS על הצינור המכיל את המעיל באפי.
  2. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מוציאים בזהירות את supernatant. ואז להתפרק tהוא התא גלולה עם הקשה עדינה ולהוסיף 10 מ"ל PBS.
  4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולת התא, לשבור את הגלולה, ולהוסיף 4 מיליליטר של 0.075 M פתרון אשלגן כלורי hypotonic מחומם מראש. הוסף טיפת פתרון hypotonic אחר טיפה עם רעד קבוע עדין.
  6. דגירת תאים עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  7. לאחר טיפול hypotonic, להוסיף נפח שווה (4 מ"ל) של מקבע (מתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3: 1 v / v) בצינור 15 מ"ל ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך.
  8. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant.
  9. לשבור את התא גלולה עם הקשה ואחריו מערבולת עדינה במשך כמה שניות ולהוסיף 3 מ"ל של ירידה פתרון מקבע אחר טיפה עם רעד קבוע.
  10. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות.
  11. הסר את supernatant, לשבור את התא גלול עם גנטle קשה, ולהוסיף 3 מקבעים מיליליטר טרי.
  12. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. לשבור את התא גלול עם הקשה עדינה, ולהוסיף מקבע 3 מיליליטר טרי.
  13. חזור על שלב 3.12 עוד פעמיים.
  14. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר supernatant מבלי להפריע גלולה התא. לאחר מכן להוסיף 400 עד 600 μL מקבע ומערבבים היטב עם pipetting.
  15. ירידה של 30 μL תאים קבועים על גבי שקופיות מראש לנקות ורטובות המוטות בזווית של 45 מעלות ולאפשר שקופיות לייבוש באוויר לחלוטין למשך לילה.

4. ציור כרומוזום עכבר ידי mFISH

  1. Denaturation כרומוזום
    1. מניחים את השקף המכיל ממרחים תא metaphase ב 2x SSC למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. מייבש את השקופית על ידי שטיפת אתנול סדרה עבור 2 דקות כל אחד ב 70%, 80% ו -100%. דגירה של 60 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
    3. מחממים 40 פתרון denaturation מ"ל (70% לפוראמיד / 2x SSC; pH 7.0) עד 70 ° C (± 2 ° C) בצנצנת Coplin זכוכית למשך 30 דקות. לפגל כרומוזומים על ידי דוגרים את השקופית בתמיסה denaturation מחומם מראש עבור 1 - דק 1.5.
    4. להרוות להחליק מיד באתנול 70% קר כקרח במשך 2 דקות כדי לעצור את תהליך denaturation וכן למנוע את הכרומוזומים מפוגל מ-חישול מחדש. ואז מייבשים על ידי שטיפה עם 80% אתנול למשך 2 דקות. חזור על לשטוף אתנול עם אתנול 100% למשך 2 דקות. לגמרי לייבש את השקופיות בטמפרטורת החדר.
  2. Denaturation ו הכלאה של תערובת Probe
    1. צנטריפוגות בקצרה את תערובת הבדיקה שסופקה על ידי היצרן, להעביר 10 μL של תערובת בדיקה לתוך צינור צנטריפוגות 500 μL צמד כובע, ו לפגל על ​​ידי דגירה על 80 מעלות צלזיוס (± 2 ° C) באמבט מים במשך 7 דקות.
    2. מניחים את הצינור צנטריפוגות עם תערובת בדיקה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    3. החלת את תערובת הבדיקה המפוגלת לשקופית עם chromoso המפוגלmes.
    4. בזהירות לכסות את האזור עם תלוש כיסוי זכוכית 18 מ"מ x 18 מ"מ ולחסל כל בועות אוויר גלויות על ידי בעדינות רבה הלחיצה להחליק את המכסה להחליק. חותם את כל ארבעת הצדדים של להחליק את המכסה במלט גומי דגירה במשך 12 שעות עד 16 שעות בחושך ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified הכלאה.
  3. כביסה וזיהוי הכלאת ההודעה
    1. מוציאים בזהירות את המלט גומי להחליק את המכסה.
    2. שקופית מקום ב SSC 0.4x מראש התחמם ב 74 ° C (± 2 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
    3. שקופית לשטוף בתמיסה לשטיפת השנייה (4x SSC / 0.1% Tween-20) למשך 2 דקות.
    4. מקום 20 μL של המדיום גובר אנטי לדעוך עם counterstain DAPI (1.5 מיקרוגרם / מ"ל) ומכסים coverslip זכוכית. לחצו בעדינות על coverslip עם רקמות במעבדה כדי להסיר בועות אוויר פתרון הרכבה עודף. חותם את הקצוות של coverslip עם לק.
    5. שקופיות צפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים מתאימים.

5. ספקטרלית Karyotyping (SKY) של עכבר כרומוזומים

  1. כרומוזום ו Probe Denaturation
    1. לאזן שקופית 2x SSC בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, בלי לרעוד.
    2. מייבשי שקופיות בסדרת אתנול (70%, 80%, ו -100% אתנול) למשך 2 דקות כל בטמפרטורת חדר. אוויר יבש השקופית להסיר את אתנול לחלוטין.
    3. פתרון denaturation 40 מ"ל חם (70% לפוראמיד / 2x SSC; pH 7.0) בצנצנת Coplin זכוכית למשך 30 דקות.
    4. דגירה שקופיות בתמיסה denaturation מחומם מראש ל -1 עד 1.5 דקות.
    5. מיד לטבול את השקופית לתוך אתנול קר כקרח 70% למשך 2 דקות כדי לעצור את תהליך denaturation וכן למנוע את הכרומוזומים מפוגל מן מחדש חישול.
    6. מייבשים את השקופית על ידי הצבת אותו לתוך אתנול 80% עבור 2 דקות ולאחר מכן לתוך אתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לפגל בדיקה SKY (בקבוקון # 1 המסופק על ידי היצרן) באמבט מים מוגדר 80 ° C (± 2 ° C)במשך 7 דקות, ולאחר מכן מייד למקם לתוך אמבט מים שונה להגדיר עד 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. כלת Probe
    1. הוסף 10 μL של חללית SKY המפוגלת על הכרומוזומים המפוגל.
    2. בזהירות במקום coverslip זכוכית 18 מ"מ x 18 מ"מ על גבי חללית SKY כך שאין בועות אוויר לכודות מתחת coverslip.
    3. חותם את הקצוות של coverslip עם מלט גומי.
    4. מניחים את השקף בתא lightproof humidified דגירה בחושך על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד 36 שעות.
  3. כביסת פוסט כלת גילוי הקרינה
    1. הסר מלט גומי מאוד בזהירות מבלי להפריע coverslip.
    2. מניחים את השקופית לתוך פתרון הכביסה המהירה מחומם מראש (SSC 0.4x) בשעה 72 ° C (± 2 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות עם רעד קבוע. לטבול להחליק לתוך כביסה פתרון III (4x SSC / 0.1% Tween 20) ו דגירה של 1 דק 'תוך רעד.
    3. אופציונלי: להוסיף 80 μL של מגיב חסימת(בקבוקון # 2 המסופק על ידי היצרן) על שטח של הכלאה, במקום coverslip פלסטיק 24 מ"מ x 60 מ"מ, ו דגירה בחושך על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתא humidified.
    4. הוצא בעדינות את coverslip פלסטיק לשטוף את השקופית עם מחומם מראש (45 ºC) פתרון הכביסה III למשך 5 דקות.
    5. החל 80 μL של Cy5 מגיב מכתים (בקבוקון # 3 שסופקו על ידי היצרן), במקום coverslip פלסטיק 24 מ"מ x 60 מ"מ, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 40 דקות בתא humidified.
    6. טובלים את השקופית לתוך צנצנת זכוכית Coplin המכיל מחומם מראש (45 ºC) כביסה פתרון III (4x SSC / 0.1% Tween 20) ו לדגור על 45 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 2 דקות עם רעד. חזור על שלב זה כביסה 3 פעמים.
    7. החל 80 μL של Cy5.5 מגיב מכתים (בקבוקון # 4 המסופק על ידי היצרן), במקום coverslip פלסטיק 24 מ"מ x 60 מ"מ, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 40 דקות בתא humidified.
    8. לשטוף את השקופית 3 פעמים עם טרום חימם (III פתרון כביסה 45 ºC).
    9. החזק את השקופית בעמדה מוטה נגד מגבת נייר לניקוז נוזלים עודפים. הוסף 20 μL מגיב DAPI אנטי לדעוך (בקבוקון # 5 שסופקו על ידי היצרן) ובזהירות במקום coverslip זכוכית 24 מ"מ x 60 מ"מ ללא החדרת בועות אוויר. חותם את הקצוות של coverslip עם לק ולבחון עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד עבור לכידת תמונות SKY.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקרנת גוף סה"כ גורמת סטיות כרומוזומליות רבות של תאי מח עצם של עכברים מוקרנים. הפרוטוקול הנוכחי הוא מותאם במיוחד in vivo מעצר mitotic של תאי מח עצם לאחר חשיפה לקרינה, קציר של תאי מח עצם של הרגליים האחוריות של עכברים מוקרנים, בידוד של תאי mononuclear מח עצם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, הכנת ממרחי תא metaphase, ובעקבות זיהוי של סטיות כרומוזומליות יציבות מושרה קרינה על ידי טכניקות mFISH ושמים. ציור כרומוזום באמצעות טכניקות אלה יכולים לש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים כמה לקבוע את ההצלחה של mFISH ושמים. השלב הראשון והקריטי ביותר הוא כדי לייעל את הטיפול קולכיצין מעצר mitotic in vivo של תאים mononuclear מח עצם. שעת הריכוז וטיפול קולכיצין בנפרד או בתיאום לקבוע את מדד mitotic וכן כרומוזום עיבוי ושתיים תנאים המוקדמים חשובים לציור כרומוזום יעיל. זמן טיפול גבוה קולכיצין ריכוז או יותר מוביל הכרומוזומים מרוכז מאוד, עולה בקנה אחד עבור denaturation ואת ההכלאה נכונה. יתר על כן, זיהוי מדויק של rearrangements המורכבת בתא metaphase להתפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי ארקנסו שטח גרנט Consortium ונשיונל שטח Biomedical Research Institute דרך לאומי ומסוכנות החלל, מעניק NNX15AK32A (RP) ואת RE03701 (MH-J), ו P20 GM109005 (MH-J), ואת ותיקי המינהל ארה"ב ( MH-J). אנו מודים כריסטופר Fettes, רכזת תוכנית עבור משרד סביבתיים בעיסוק הבריאות באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה, לסיוע העריכה ב הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פורממידסיגמא-אולדריץ'221198-100 מ"ל
SSC מאגר 20 ופעמים; תרכיזSigma-AldrichS6639-1L
SKY מגיב מעבדהלהדמיה ספקטרלית יישומיתFPRPR0030/M40
CAD - ערכת זיהוי נוגדנים מרוכזתהדמיה ספקטרלית יישומיתFPRPR0033
צבעים בודדים מותאמים אישית - 3 צבעים; כרומוזום עכבר 1: אדום, כרומוזום עכבר 2: ירוק, כרומוזום עכבר 3: AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
כיסויי זכוכיתFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
חומצה הידרוכלורית, 37%, Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
פישרברנד כלי צביעת זכוכית  עם מכסה בורגפישר סיינטיפיק08-816
KaryoMAX תמיסת אשלגן כלורי Life Technologies10575-090
פישרברנד Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
אבקת קולצמידפישר סיינטיפיק50-464-757 
Histopaque-1083 Sigma-Aldrich10831
Shepherd Mark I, דגם 25 137Cs irradiatorJ. L. Shepherd & Associatesדגם 484B
מזרק 1 מ"לBD Biosciences647911
אלכוהול אתילי, 200 הוכחהפישר סיינטיפיקMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), עם סידן ומגנזיוםפישר סיינטיפיקICN1860454
סרום בקר עובריפישר סיינטיפיק10-437-010
מתנולפישר סיינטיפיקA454SK-4
חומצה אצטית קרחוניתפישר AC295320010
מיקרוסקופ ZeissZeissAXIO Imager.Z2
של עכבר

מקורות

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. , (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.