מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Matthew McKenzie; Sze C. Lim; Michael R. Duchen

doi:10.3791/55166

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

18.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55166

⸱

24 בינואר 2017

Matthew McKenzie¹^,² , Sze C. Lim¹ , Michael R. Duchen³

¹Centre for Genetic Diseases, Hudson Institute of Medical Research, ²The Department of Molecular and Translational Sciences, Monash University, ³Department of Physiology, University College London

במאמר זה

סיכום

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ _Ψm) כדי לעקל סידן (Ca ^{2 +),} המאפשר להם לעצב Ca cytosolic ²⁺ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

תקציר

מלבד התפקיד החיוני שלהם ביצירת ATP, המיטוכונדריה גם לשמש סידן מקומי (Ca ^{2 +)} מאגרים להסדיר בחוזקה ריכוז תאיים Ca ^{2 +.} לשם כך, המיטוכונדריה לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (ΔΨ _{מ ')} כדי לעקל Ca ^2+. זרם של Ca ^{2 +} לתוך המיטוכונדריה מגרה שלושה דהידרוגנאז שער הגבלת של מעגל החומצה הציטרית, הגדלת העברת אלקטרונים דרך זרחון חמצוני (OXPHOS) תסביכים. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ _{מ ',} אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה.

אנו מתארים כאן שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. על ידי permeabilizing התאים, Ca המיטוכונדריה ²⁺ יכוללהימדד באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטור Fluo-4, בבוקר, עם מדידת ΔΨ _מ באמצעות אסתר tetramethylrhodamine, מתיל צבע פלואורסצנטי ניאון, פרכלורט (TMRM). היתרון של מערכת זו הוא כי יש חפיפה ספקטרלית מעט מאוד בין צבעי ניאון, המאפשר מדידה מדויקת של המיטוכונדריה Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ זמנית. באמצעות תוספת הרציפים של aliquots Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +} המיטוכונדריה ספיגה ניתן לנטר, ואת הריכוז שבו Ca ^{2 +} גורם מעבר חדירות קרום המיטוכונדריה ואובדן ΔΨ _אני נחוש.

מבוא

המיטוכונדריה לשחק תפקיד חשוב בוויסות ריכוז תאיים Ca ^{2 +} על ידי מתנהג כמו מאגרים מקומיים Ca ^{2 +} ^1. Ca ^{2 +} מזין את המיטוכונדריה דרך uniporter Ca ^2+, תהליך מונע על ידי שיפוע אלקטרוכימיים שקיים על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה _(מ ΔΨ) ^2. פעם בתוך מטריקס המיטוכונדריה, Ca ^{2 +} יכול להפעיל זרחון חמצוני ידי גירוי שלושה דהידרוגנאז ומגביל הקצב של מחזור חומצת לימון ^3. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ _{מ ',} אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה ....