בחינת פנוטיפים מארח ב<em&gt; Affinis Gambusia</em&gt; בעקבות טיפול אנטיביוטי

סיכום

מחקר זה כלל שיטות לחשוף תופעות על שורת דגי המודל הבאה שינוי בהרכב קהילות Microbiome עור בטן באמצעות אנטיביוטיקה.

תקציר

השכיחות של שימוש באנטיביוטיקה ברפואה פירושה שהבנת ההשלכות הנובעות מכך על המארח היא חיונית. אנטיביוטיקה לעיתים קרובות מפחיתה את מגוון קהילת המיקרוביום המארח ומשפיעה על הרכב הקהילה המיקרוביאלית. מחלות רבות כגון דלקת מעיים הקשורה לאנטיביוטיקה, מחלות מעי דלקתיות והפרעות מטבוליות נקשרו למיקרוביוטה משובשת. יחסי הגומלין המורכבים בין מארח, מיקרוביום ואנטיביוטיקה זקוקים למודל ניתן לחקר אינטראקציות מארח-מיקרוביום. דגי החולייתנים שלנו במים מתוקים משמשים כמודל שימושי לחקירת ההיבטים האוניברסליים של מבנה ותפקוד המיקרוביום הרירי, כמו גם ניתוח השפעות מארח תוצאתיות משינוי הקהילה המיקרוביאלית. השיטות כוללות אתגרי מארח כגון זיהום על ידי פתוגן דגים ידוע, חשיפה לחיידקי צואה או אדמה, לחץ אוסמוטי, רעילות חנקה, ניתוח גדילה ומדידת תנועתיות המעיים. טכניקות אלו מדגימות מערכת מודל גמישה ושימושית לקביעה מהירה של פנוטיפים מארחים.

מבוא

זה כבר נקבע כי אנטיביוטיקה יכולה לשבש את Microbiome האדם שמוביל dysbiosis, כלומר חוסר איזון קהילת חיידקים. שינוי ההלחנה של החיידקים לאחר טיפול אנטיביוטי הוכח להפחית את המגוון של הקהילה, להפחית אנשי מפתח, וכן לשנות את חילוף חומרי קהילה, במיוחד במעיים ^{1, 2.} הפרעה אנטיביוטיה של Microbiome הבטן יכולה להפחית התנגדות קולוניזציה כדי Clostridium difficile ^{3, 4} ו סלמונלה ^5.

בנוסף, השיבוש של החיידקים נקשר להתפתחות רבות תסמונות ומחלות בבני אדם (למשל, אנטיביוטיקה הקשורים enterocolitis, מחלות מעי דלקתיות, מחלות מטבוליות, וכו.). אנטיביוטיקה גם מיושמת נרחבת בחקלאות כמו מקדמי צמיחה בייצור בעלי חיים ועופות ^6. השימוש של כלים רבי עוצמה אלה אינו נטול תופעות בטחונות, אשר בא לידי ביטוי בעלייה מהירה של עמידות לאנטיביוטיקה, כמו גם את ההשפעות של Microbiome שיבשו יש עם המארח מאוכלס שלה. מחקרים רבים הראו כי שימוש באנטיביוטיקה רחב טווח יש ארוכת השלכות קיימא המבנה והתפקוד של החיידקים, אך תופעות הלוואי מן הפיסיולוגיה מארח להשפיע לאנטיביוטיקה שבשה Microbiome הם ספקולציות בלבד שטרם להיתמך.

משחק הגומלין בין מארחת, חיידקים, ואנטיביוטיקה הוא רחוק מלהיות מובן בצורה תמציתית. לכן, מודל פשוט יותר צייתן יתרון שפיכת אור על מערכת יונקים המורכבת ביותר. משטחים ריריים בבני אדם, כולל הבטן, נמל הצפיפות והמגוון ביותר של חיידקים, וגם אינטראקציות חיידק המארח האינטימיות ביותר. Microbiome העור הרירי של ים הצעות דגיםיתרונות everal כמערכת מודל. כליל הגרמי (הדגים גרמיים) הוא אחת השושלות המוקדמות לסטות כמשמעותו החוליות שיש teleosts הוא המולד רכשה מערכת חיסונית כי יש שיתוף התפתח יחסים עם קהילות חיידקי commensal ^7. מניות עור דגי מאפיינים רבים עם משטחים ריריים סוג 1 של יונקים, כגון תפקודים גופניים, רכיבים חסינים ועל ארגונו של תאים מייצרי ליחה ^8. המיקום החיצוני של משטח עור דג הרירי מציע Microbiome קל לתפעל מדגם הניסיון.

גמבוזיה מצויה המערבי, affinis Gambusia (ג affinis), הוא דג מודל, שבו נעשה שימוש בעבר ללימוד ההזדווגות ואת הרעלים ^{9, 10, 11.} בהתחשב בגודל הקטן, שפע אוכלוסייה בטבע כמו מין פולש, מ ' טיפול עלות inimal, והטבע הארדי, פתחנו ג affinis כמודל Microbiome רירי. יתר על כן, Gambusia לשתף הפיזיולוגיה של הלידה לחיות צעירים עם יונקים היולדת צאצאים חיים, שהוא נדיר ב מיני דגים. אנחנו השלמנו את המחקר המקיף ביותר בעת חיידקים נורמלים עור דג באמצעות 16S פרופיל עם Gambusia ^12. עבודה נוספת הפגינו שלוש השפעות שליליות על למארח הבא שיבוש של החיידקים בעור הבטן באמצעות ¹³ אנטיביוטיקה רחבת טווח.

חמישה אפקטים שונים נבחנו הדג לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה. היתרון המארח ביותר שהוקם היטב של Microbiome הוא הרחקה תחרותית של פתוגנים. Ictaluri דגים הפתוגן Edwardsiella ידוע כגורם התפרצויות של הרעלת דם מעיים בחוות שפמנון מסחרי ^14. גם א ictaluri הוכח קטלני להדביק דג זברהclass = "Xref"> ^{15, 16} ו Gambusia ^17. אתגר עם הפתוגן מעמודת המים יכול לשמש כאמצעי של דרה. לשם השוואה כדי רגישות פתוגן פרט, ההישרדות במהלך חשיפת צפיפות גבוהה של אורגניזמים מעורבים גם בוצעה. צואה ואדמה אורגני עשיר שימשו כמקורות-בדרך נתקל של קהילות מיקרוביאלי.

תפקיד נוסף נוסד קהילת בטן חיידקי המבצעת הנו קציר עיבוד אנרגיה מזין, ובכך להשפיע על הספיגה תזונתית הכוללת עבור המארחת. כתוצאת מדידת ברוטו של תזונה, משקל גוף דגים הושווה לפני ואחרי חודש אחד של שהאכיל תזונה סטנדרטית. אנטיביוטי שטופל דגים כממוצעים ירד במשקל בעוד דגים מלאים בממוצע עלו במשקל במהלך החודש. המנגנון זה חוסר העלייה במשקל אינו ברור. אחת גורם תורם אפשרי הוא זמן המעבר של המזון במעי. מוטי GIשיטת lity הותאם מתוך דג הזברה (אדם עשיר, SUNY Brockport, תקשורת אישית) כדי לקבוע את זמן המעבר. זה טרם נקבע אם דגים שטופל באנטיביוטיקה יש זמן מעבר שינה.

אתגר משותף חווה בסביבה הטבעית על ידי כל היצורים, במיוחד הדגים, הוא מתח האוסמוטי. Gambusia הוכחו לאמץ במהירות בחריפות הדגיש בריכוזים גבוהים של מליחות ^18. באופן מפתיע, דגים עם Microbiome לאנטיביוטיקה שינתה הציג וריד הישרדות על מתח מלח גבוה. מנגנון פנוטיפ הרומן הזה נמצא תחת חקירה. עוד מתח משותף על בעלי חיים ימיים, במיוחד באקווריומים, הוא צורות רעילות של חנקן (אמוניה, ניטראט, ו ניטריט). הישרדות נגד חנקתי לא היה שונה משמעותית בין דגים אנטיביוטי שטופלו ושליטה. השיטות שהוצגו בכתב היד הזה יכול לשמש עם אורגניזמים Gambusia או מודל דגים דומים, כגון זברהדגים medaka, למדוד פנוטיפים בדגים הבאים מניפולציה ניסויית.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת אישור פרוטוקולים IACUC, ממוספרים 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, ו 14-04-17-1018-3-01.

1. איסוף בעלי החיים, טיפול וטיפול אתי

1. אסוף Gambusia affinis מאתר שדה (מדריך זיהוי ב http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) באמצעות רשת מטבל קטנה ומניחים ל -19 דליים L. השתמש בדיקה ויזואלית לזהות מינים.
2. דגים ופנאי 1 - 2 ד בתוך דלי עם מים בבריכה. לאחר מכן, להעביר דגים לתוך טנקי אקווריום L 76 או 189 מלאי מי ברכה חצי / חצי מים ברז של 25 מעלות צלזיוס, סודה עם מבעבעת airstone. השתמש נטו בגומחה קטנה בעת טיפול דג באשר מינימלית להפריע Microbiome עורם.
   הערה: צפיפות דגים צריכה להיות לא יותר מ -20 דגים / 38 ליטר של מים באקווריום. דגים הם יתרגלו לאקווריום לפחות 5 ד לפני ניסויים.
3. להאכיל את הדגים על משטר יומי עם 5 מ"ג של מזון פתית לכל דגים. הודגי ld עם מחזור ח אור / 12 שעות כהה 12.

חשיפה 2. אנטיביוטי ראשוני עבור כל הניסויים

1. ציור כל הדגים כל ניסוי מאותו אקווריום, למקם לשתי קבוצות נפרדות (מטופלים: נחשף אנטיביוטי ובקרה: שלא נחשפו) ב 19 דליים L. נתונים קודמים שנאספו עולה כי הדגים באותו אקווריום יש הומוגני microbiomes העור שיש וריאציה מעט בהרכב הקהילה. ¹²
2. במהלך הניסויים, לשמור על הדגים ב 2 ליטר מים אגם מלאכותי (APW; 0.33 g / L CaCl _2, 0.33 גר '/ ל MgSO _4, 0.19 גר' / ל NaHCO ₃₎ כי מעוקר על ידי מעוקר לפני השימוש.
3. הכן פתרון המניות אנטיביוטי ריפמפיצין ידי הוספת 50 מ"ג / מ"ל ​​לתוך sulfoxide דימתיל (DMSO). ריפמפיצין הוא אנטיביוטי רחב ספקטרום נציג כי אינו רעיל לדגים. אצל בני אדם ועכברים, היא מפיצה גם ברקמות.
4. מתוך מניות ריפמפיצין לנהל סופיריכוז של 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 2 ליטר של APW לחשיפה אנטיביוטיקה מקבוצת דגים שטופלו במשך 3 ימים. שים לב שלאחר 3 ד, מספרי חיידקי עור culturable לחזור דומים לזו של עור דגי pretreated.
5. במקביל, לשמור קבוצה של דגים שלא טופלו ב APW ולתת כמות שווה של DMSO (0.5 מ"ל לכל ליטר של APW) לתוך עמודת המים לפעול כקבוצת ביקורת.
6. ככל שניסויים נועדו למדוד תופעות של Microbiome לאנטיביוטיקה שינתה על פנוטיפים דגים, כדי למנוע תופעות ישירות האנטיביוטיקה עוצמה, בעקבות החשיפה האנטיביוטיה של שלושה ימים (או שליטה) תקופה, העברת הדגים לדלי עם 2 ליטר APW הטרי.
   1. השתמש תקופת מנוחה של 10 שעות ולכן האנטיביוטיקה הוסרה על ידי הגופים של הדג. מאגר זמן חיסול זה על ניסויים בהם דגים נחשפו 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטיביוטיקה למשך שלושה ימים. להרדים את הדגים על ידי לגזום את חוט השדרה ואחריו pithing, אז homogenize הגוף כולו באמצעות מטחנת רקמות.
   2. לקבוע נוכחות אנטיביוטי על ידי הצבת 50 μL של השעיה זו לאחר 0.2 מיקרומטר סינון למרכז צלחת פטרי אגר. עושים חור להשעיה זאת על ידי לחיצה הפוכה קצה פיפטה סטרילית 200 μL לתוך אגר, אשר מסיר תקע קטן.
   3. השתמש צלחות אגר עם 20 נפח נמדד מ"ל של אגר מזין, להתפשט באופן שווה באמצעות מקלון צמר גפן עם אורגניזם מחוון, subtilis Bacillus, שהוא רגיש ריפמפיצין. השג את 'subtilis מתוך אגר מזין וטופחו על 25 ° CO / N ושימוש המקלון להשיג מושבה. התבוננות אזור של עיכוב לאחר דגירה לילה בשעה 25 ° C מציין נוכחות של אנטיביוטיקה ברקמות הדגים.

3. הפקת Microbiome

1. חלץ מדגם העור Microbiome מן האפידרמיס הרירית החיצונית על ידי הנחת דגים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי מלאים 2 מ"ל סטרילי PBST (137 מ"מ NaCl, 10 פוספט מ"מ, 0.1% Tween-20, pH 7.4) פתרון vortexing בכל הגדרה של 10 דקות 1 עם במרווחים שהשהיה של 10. דטרגנט ומלח למאגר מקדם אפילו פיזור של חיידקים בתמיסה. תוצאות דומות נמצאו עם מי מלח 0.85% אך גרמו לספירות חיידקים עם מים טהורים.
2. מעביר את הדג מצינור החרוטים כדי דלי התאוששות. הקטלניות של מיצוי העור הוא בדרך כלל נמוך מ -10%. כך או, לנתח את ההשעיה חיידקי בצינור מיד עם למיצוי או גלולה חיידקים על ידי ספין 2 דקות בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 15,000 XG ולאחסן ב -80 ° C לצורך ניתוח עתידי.
   הערה: כל תרבות ניתוחי ביוכימיים הן מיידיות; DNA או מיצוי חלבון יכול להיות ממדגמים קפוא.
3. כדי להשיג מדגם Microbiome בטן, מקום ראשון הדג בצלחת פטרי סטרילית. להרדים את הדגים על ידי ניתוק חוט השדרה הצווארי ישירות מאחורי הראש עם מספריים כירורגיות, ואחריו pithing, ולאחר מכן חיצוני לטהר את הגוף עם מגבונים אתנול 70%.
4. לאחר דיסקציה, להסיר את הבטן כולה על ידי חיתוך לאחר הוושט ולפני פי הטבעת.
5. חותכים את המעיים למקטעים קטנים 1 - 2 מ"מ אורך ולמקם את כל החלקים לשתי פתרון מ"ל PBST צינור חרוטי. לאחר vortexing דקות 1, להסיר supernatant לתוך צינור נקי אחר (לנקוט זהירות כדי לא למשוך את חלקי מעי).
   הערה: Supernatant מכיל חילוץ חיידקי מעיים שיכולים לשמש גם עבור ניתוחים ישירים או pelleted ידי השיטה הקודמת ציינה עבור דגימות עור.

זיהום 4. הכנת מודל אמבט של פתוגן ספציפי

1. השג זן זיהומיות של Edwardsiella ictaluri (א ictaluri) ולשמור את התרבות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. הזנים 93 - 146 השתמשו במחקר זה, מבודד מן שפמנון נגועים, התקבל מארק לורנס, המכללה לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת מיסיסיפי סטייט.
2. streak א במלאי ictaluri על גבי מדיה סלקטיבית & ההפרש נקרא התקשורת ictaluri א (EIM) אגר ¹⁹ לתרבת את החיידקים דגירה במשך 2 ד ב 27 מעלות צלזיוס.
3. העבר מושבה מבודדת טהור מן התרבות לחסן בבקבוק 150 מ"ל המכיל 40 מ"ל של מרק מזין (NB; 5 גר '/ ל peptone, 4 גר' / ל תמצית בשר בקר). בקבוק מקום שייקר להגדיר ב 150 סל"ד במשך 2 ד ב 27 מעלות צלזיוס.
4. לאחר דגירה, לדלל מדגם של התרבות PBST לקריאה ספקטרומטר של 0.2 OD ב 650 ננומטר לכייל E. תרבות ictaluri עבור כרכי מנת זיהומיות רצויות.
5. ההעברה הבאה מטופלים הן (אחרי 3 ד חשיפה לאנטיביוטיקה) וקבוצות דגי מטופל לכוסות פלסטיק בודדות המכילות 130 מיליליטר של מי אגם מלאכותיים טריים, או APW במשך כ -10 שעות לקבלת אישור תרופה מרקמות דג.
6. ואז משתי הקבוצות, להעביר שוב כל הדגים לתוך 8-אונקיה כוסות פלסטיק המכיל 130 מ"ל של APW נקי.
7. תן לכל דגי מנה קטלנית המכילה 2.8 x 10 ⁶ CFU / מיליליטר של תרבות ictaluri E. לתוך APW (מודל זיהום אמבטיה) ולשמור C חממת 27 מעלות במשך 24 שעות.
8. לאחר אמבטית א ictaluri, להעביר דג בנפרד לתוך כוסות חדשות עם 130 מיליליטר של APW.
9. בעקבות החלפת מים, תמותת דגים שיא על משך שבוע. דגים הם לא נמאסו על פני תקופה זו. בניגוד שפמנון, Gambusia להראות שום סימנים חיצוניים של זיהום, ולכן חיוני להשתמש קטלני נקודת סיום ניסיונית.

5. אתגר polymicrobial עם צואה & קרקע

1. טיפול צואה
   1. השג צואת אדם טרי מנושא מתנדבים בריאים אשר לא קיבלו טיפול אנטיביוטי בשבועיים הקודמים, באמצעות כפפות סטריליות צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.
   2. עם הגבייה, לאסוף צואה בשקית פלסטיק סטרילית ולאחר מכן להעביר לתוך ג 15 מיליליטר סטריליצינור onical. צור ריכוז המניות על ידי השעיית צואה ב PBST לתת פתרון המניות של 500 - 800 מ"ג / מ"ל. תערובת עבה זה עדיף להעביר באמצעות 1 מ"ל או קצה פיפטה פלסטיק גדול שנחתך בתחתית במספריים סטריליות כך פתח גדול.
   3. לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה ראשונית של מטופלים ולשלוט קבוצות דגי מטופל, להפריד לתוך כוסות פלסטיק בודדות המכילות השעיה צואתי בריכוזים סופיים של כל אחד 15 מ"ג / מיליליטר או 10 מ"ג / מיליליטר לתוך APW בהיקף כולל של 130 מיליליטר. החזק כוסות באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס.
   4. שיא תמותה דגה במהלך חשיפת צואה על ידי השגחה צמודה מעל 2 ד.
2. טיפול קרקע
   1. אסוף 1 - 2 קילו של שכבת קרקע עליונה עשירה אורגנית (אמור להכיל את הצפיפות והמגוון ביותר של חיידקים) כ 7 - 15 סנטימטר למטה לעומק ומקום לתוך מיכל פלסטיק נקי. ראוי לציין, כי האדמה צריכה לשמש בתוך יומיים לאחר איסוף.
   2. נוֹרָאctly לאחר תקופת החשיפה הראשונית, להפריד בשתי הקבוצות של אנטיביוטיקה שטופלו ודגים מטופל לכוסות פלסטיק בודדים המכיל 18.2 גרם של אדמה ב -130 מ"ל של APW. מערבבים את הקרקע בבאר מים ביד לפני הוספת הדגים. רוב החלקיקים לא להשעות ולהישאר בתחתית הכוס.
   3. לחשוף דגים למשך תקופה של 3 ד של 25 מעלות צלזיוס ולהקליט כל תמותה.

6. אתגר מתח אוסמוטי

1. לאחר הטיפול ואחריו תקופה של 10 שעות מנוחה כמתואר לעיל, לייחד דגים לתוך כוסות נפרד המכיל NaCl ב 17.5 מ"ג / מ"ל ​​(300 מ"מ) ב 150 מ"ל של APW. זוהי מחצית המליחות הטיפוסית של מי ים, אשר אינה קטלנית מלא (<50%) כדי לשלוט דגים אבל הוא מלחיץ מאוד, מחייב ויסות האוסמוטי יעילה.
2. שים לב לתמותת דגים במשך זמן של 36 שעות.

אתגר 7. ניטרט רעילים

1. דגים ויתרה לתקופת 10 שעות לאחר יישום רעיון אנטיביוטייור, ולאחר מכן דגים נפרד לתוך מנות אישיות המכיל ריכוז נתרן חנקתי של או 10 מ"ג / מ"ל ​​(118 מ"מ) או 17.5 מ"ג / מ"ל ​​(206 מ"מ) ב 130 מ"ל של APW.
2. שיא לתמותה מעל 4 ד עבור במינון נמוך ו 1 ד עבור במינון גבוה.

8. ניתוח צמיחה של דגים פרטניים או בקבוצות

1. 3 ד אנטיביוטי חשיפה או שליטה מלאה לתקופה כקבוצות בדליים.
2. לאדם, למלא כוסות קלקר 8-עוז עם 150 מ"ל APW כל, להעביר דגים בודדים לתוך כוס ולהקליט משקל הגוף הכולל הערכה ראשונית.
   1. חזור על הפעולה עבור כל הדגים בשתי הקבוצות שטופלו ומטופלים כראוי. השתמש בכוסות קלקר לבנות במקום כוסות פלסטיק שקופים כי דגים לא לאכול כאשר בספלים הברורים.
3. להאכיל את הדגים יומיים עם התזונה הסטנדרטית של שני כדורים לכל דגים. פלטות שמשו ולא פתיתי כי יש כדורים שונות נמוכות במסת בודדים (3.53 ± 0.42 מ"ג כל אחד, או 8 וריאצית%), resulting בדגי קבלת כמויות דומות של מזון. באפשרותך לפקח על צריכה ידי הקלטה כדורית שלא נאכל חזותי. שיעורי הצריכה היו בדרך כלל מעל 80%.
4. בסוף כל שבוע במשך 4 שבועות, לקבוע משקל דגים. הכין כוס חדשה עם APW הטרי, למקם על איזון, ולאחר מכן לרשום את המשקל. לאחר מכן, לשפוך דג לתוך נטו מטבל מהגביע המקורי ולהעביר לתוך הכוס החדשה, אשר לאחר מכן נשקלה שוב. דגים אינם מטופלים, כדי למנוע לחץ.
5. עבור קבוצות, מקום 2 ליטר של APW לדלי 19 L טרה הסקאלה. יש לשמור את הדגים יחד בשני הקבוצות בעת ההעברה לסלי APW חדשים ואז להקליט משקל קבוצה כולל. קבוצת דגי שיא משקל בכל שבוע במהלך פרק זמן חודש באמצעות העברה דלי חדש.

9. גוט Transit זמן

1. השתמש 70 kDa dextran anionic שכותרתו והעמסה. Dextran אינו מתעכל באופן משמעותי, והוא גדול מכדי להיקלט על פני שכבת המעיים, ובכך מעבר ימדוד את זמן המעבר במעי.dextran שכותרתו שולב מזון לדגים.
2. לתוך צינור 1.7 מ"ל סטרילי, להוסיף 360 μL של מים סטריליים deionized ו -52 מ"ג של ג'לטין (פתרון 13%), ובמקום הצינור על גוש חום 60 מעלות צלזיוס עד נמס ג'לטין נמס לגמרי.
   1. פתיתי מזון דגי זהב טוחנות לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי, ולהוסיף 40 מ"ג של אבקה זו אל הצינור, יחד עם 20 μL של שמן דגים. לאחר ערבוב, להוסיף 1.6 מ"ג-dextran FITC.
3. מחלקים את תערובת נוזל חם לתוך 20 μL טיפות על Parafilm על הספסל המעבדה, ולתת להם מגניב במהירות לחזק. טיפות ניתן לאחסן עד 4 ד לפני שהן הופכות קשות מדי לדגים לאכול. חנות טיפות במקרר ידי הצבת Parafilm על מחצית בצלחת פטרי, אשר צף אז על מים סטריליים בתוך במיכל פלסטיק אטום, אשר שומר את טיפות humidified.
4. רגע לפני ההאכלה, ברבעון טיפות למקטעים באמצעות סכין גילוח. לאקלם את הדג בכוס הקפהכוסות קצף בנפרד עבור 2 ימים ללא האכלה (הערה: דגים מלאים שלא נחשפו רק שמשו). מניחים ארבעה רבעונים של מזון לתוך כוס עם הדגים, ולבחון את הדג במשך 30 דקות עבור חתיכות כמה האוכל שהם כל לאכול.
5. כדי להתחיל בתקופת המעקב, להעביר דג בנפרד לתוך כוסות עם 80 מ"ל של APW באמצעות רשת לטבול. כל 2 שעות, בעדינות מערבולת APW ביד, ולאחר מכן לקחת דגימה מ"ל 1 ולאחסן צינור שכותרתו 1.7 מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס. קח דגימות במשך 36 שעות.
6. קרינת שיא, עם ספקטרופוטומטר קרינה, של כל הדגימות בעת ובעונה אחת לאחר השלמת assay. מניחים את המדגם 1 מ"ל כולו לתוך קובט, ולהקליט את הקרינה נמדדת באמצעות עירור ב 495 ננומטר פליטה ב 520 ננומטר.

תוצאות

דיאגרמה סכמטית הכוללת של המערכת הניסיונית בשימוש ללמוד תופעות מארח דגים מחשיפה אנטיביוטיה ¹³ מיוצגת באיור 1A וכוללת את הטכניקה לחילוץ העור (האיור 1B) ובמעיים (תרשים 1C) microbiomes מהדג. שלושה ימים נבחרה כתקופת אנטיביוטי החשיפה כי הנתונים הקודמים מגלה כי בעוד המספר הכולל העור culturable טיפות מוקדם בטיפול, זה חזר לטיפול מקדים רמות אחרי 3 ד. בינתיים, רכב הקהילה, כפי שנקבע על ...

דיון

אתגרים מסוימים דורשים תקופת מנוחה ב APW הנקי לאחר טיפול אנטיביוטי עבור התרופה להיות מדולדלת ברקמות דגים. אם תקופת המנוחה הוא דילג אז הנוכחות אנטיביוטי יכול לבלבל את התוצאות, במיוחד כאשר assay כרוכה בחשיפה חיידקים. על מנת לבחון את ההשפעות מתוך רכב Microbiome שינה ללא שינויים גדולים המספר הכולל של חיידקים על המארח, רכב Microbiome ראשונים ניסויי ניטור (פרופיל 16S או רצף הגנום כולו) וצפיפות אוכלוסייה (16S quantitation באמצעות qPCR) במהלך חשיפה לאנטיביוטיקה יהיה נדרש. בעוד 3 ד הוא אופט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
נתרן חנקתי	סיגמא אולדריץ'	S5506
פלואורסצאין עם תווית 70 kDa דקסטרן אניוני	ThermoFisher Scientific	D1823
טבליות מלח עם חוצץ פוספט (PBS)	Calbiochem	6500-OP	מתמוססות במים לייצור PBS

טבליות