מאמר שיטה

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55177

⸱

27 במרץ 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

תקציר

הדמית תא חי משמשת ללכידה זמנית זמן לשגות תמונות של קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין (AT R 1a) ותאים תאיים בכליה-293 עובריים אנושיים טרנספקציה (HEK) תאים בעקבות גירוי עם אנגיוטנסין II (אנג שנייה). תאי HEK הם transfected זמני עם ה- DNA פלסמיד המכיל AT R 1a מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP). ליזוזומים מזוהים עם פלורסנט לצבוע אדום. תמונות Live- תא נלכדות על מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר לאחר גירוי אנג השני ונותחו על ידי תוכנה בשלושה ממדים (3D, ווקסלים) לאורך זמן. Live- תא הדמיה מאפשרת חקירות סחר הקולט ונמנעה בלבול הקשורים קיבעון, ובפרט, האובדן או עקירת artefactual של קולטני קרום מתויג EGFP. לפיכך, כתאים בודדים מתבצעים מעקב לאורך זמן, לוקליזציה subcellular של קולטנים ניתן הדמיה ומדודה. התמונות חייבות להירכש sufficiently במהירות ללכוד תנועת שלפוחית ​​מהירה. עם זאת, במהירויות הדמיה מהר, מספר הפוטונים שנאספו מצטמצם. הפשרות חייבות להתבצע גם בבחירת פרמטרי הדמיה כמו גודל voxel כדי לצבור מהירות הדמיה. יישומים משמעותיים של דימות תאים חיים הם ללמוד סחר חלבון, הגירה, שגשוג, מחזור התא, אפופטוזיס, autophagy ואינטראקציה בין חלבונים ודינמיקה, אם למנות רק כמה.

מבוא

המטרה הכללית היא להשיג ראיות כמותית בזמן ובמרחב של colocalization קולטן עם אברונים subcellular ספציפיים לאחר הטיפול עם אגוניסט לקולטן. לפיכך, המטרה המיידית כאן היא ללכוד תמונות confocal זמן לשגות של lysosomes ו הטרנסממברני פורש קולטן בתאי כליה עובריים אנושיים (HEK) בעקבות transfection וכדי מכן להרכיב ולנתח את הנתונים הדמיה 3D למדוד את המסירה של קולטן כמותית כדי lysosomes. חקירת הסחר סימולטני של קולטן הטרנסממברני עם lysosomes או אברונים אחרים בזמן אנדוציטוזה כאשר מופעל על ידי ליגנד רצפטור יכול לעזור לקבוע כיצד קולטן הטרנסממברני מוסדר בתנאים פיזיולוגיים pathophysiological.

R AT 1a המשוער הוא מושפל lysosomes לאחר טיפול עם אנג II במערכות תאים מודל, בעיקר HEK293 1 למרות שרוב receptors הם נקודות בעיקר endosomes מחזור multivesicular למחזור מאוחר קרום הפלזמה בעוד חלק הארי של ליגנד, אנג השנייה, נפגע ליזוזום 2, 3, 4, 5. לאחרונה, Li et al. הפגינו באמצעות תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מיקרוסקופיה הדמיה החיים הקרינה (FLIM) טכניקות 1a AT colocalizes R (על סולם ~ 10 ננומטר) עם LAMP1, חלבון הממברנה ליזוזומלית מכאן שלפחות חלק הקולטן מיועד והשפילו על ידי lysosomes 6. מחברים אלו ציינו כי chloroquine ליזוזומלית מעכב חסומה העמותה R-LAMP1 1a אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים טוען כי השפעה של chloroquine היא לחסום היתוך של endosomes מאוחר או autophagosomes עם lysosomes. גישות עקיפות אחרות כדי לקבוע AT l 1a Rocalization ב lysosomes ניצלו bafilomycin, מעכב ליזוזומלית להסיק הימצאות R 1a ב lysosomes 3, 4, 5, 6, 7, 8.

Live- תא הדמיה תמנע השפעות אפשריות של קיבעון על נפח תא, ואובדן / עמעום / חלוק מחדש של קולטן ה- GFP-chimeric. מחקרים קודמים יש לסמוך על תאים קבוע כדי לקבוע colocalization או שיתוף התרחשות של הקולטן עם lysosomes או באמצעות תאים חיים שכותרתו עם פונדקאיות מחייב לקולטן כגון 1 β-arrestin, 2, 3, 4, 5, 6. הדמיה של תא חי GPCRs האחר באמצעות confocal ספינינג דיסק או conf סריקת נקודת ליזרמיקרוסקופי ocal מצוידים גלאי Gaasp או HYD אפשרו לחוקרים לבחון את ההפנמה וסחר של קולטנים בתאים בודדים צלמו ערימות z ב 30 שניות במרווחים 9, 10. עם זאת, גם כאשר Z- ערימות תא חיים נאספות במהירות, ניתוח עלול להתרחש רק לאחר הבחירה של מטוס בודד בתוך כל ערימה, כלומר ב 2D 10. אמנם זה עשוי להיות מספיק ללימוד קולטן קינאז GPCR או טירוזין הפנים נדון, Rs 1a AT מצטבר שלפוחית משני גודל ומיקום לאורך זמן וכך הם מטבעם יותר קשים לדגום כראוי באמצעות פרוסה אחת נציג בכל נקודת זמן. כדי לקבוע את התוואי באופן יסודי של שכותרתו AT R 1a דרך התא וכדי לזהות כל תת-אוכלוסייה של השלפוחית השונה בהיקפו, עמדה, אנו פתחנו שיטת הדמית 3D וניתוח 3D כדי לעקוב אחר שינויים אלה להיות הפועל בשיתוף עם תיוג של תאים שונים תאיים כגון lysosomes.

חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה עבור דימות תאי חיים כדי להמחיש את התנועה ישירות של R 1a AT לתוך התא והעברתו תאי subcellular בעקבות גירוי אנג השני. תאי subcellular מתויגים עם מפלצות חלבון פלואורסצנטי או סמני ניאון אחרים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם גישה ראשונה למקם קולטנים אברונים subcellular עם רזולוציה מינימאלית של 200 ננומטר על מנת להשוות מוטציה לעומת קולטנים wild-type או כדי לזהות שינויים בעקבות טיפוליים תרופתי. הטכניקה נגישה שכן הוא יכול להתבצע על כל מיקרוסקופ confocal מצויד הדמית תא חי. הקלות היחסית של גישה זו עומדת בניגוד מומחיות מוגברת הציוד הדרוש כדי לבצע סריג / FLIM / טכניקות ברט אשר לזהות אינטראקציות מולקולריות 6,"Xref"> 11. מדידות אלה מגדירים אינטראקציות בין חלבונים ברזולוציה גבוהה (~ 10 ננומטר) ולוקליזציה בתוך אברונים subcellular הוא להסיק. טכניקות מתקדמות יותר אלה משמשות כדי לבצע מעקב להגדיר טוב יותר אינטראקציות מולקולריות של עניין, במקום חלוף קולטנים באמצעות תאי subcellular, והם ישירות להפגין אינטראקציות חלבון-חלבון בזמנים מסוימים ומקומות בתוך התא 11. FLIM, טכניקת סריג עצמאית של ריכוז acceptor, מתבצע לרוב על מדגמים קבועים מאז רכישת תמונה היא איטית יותר. לעומת זאת, סריג יחס מספק הדמיה מהירה colocalization ברזולוציה גבוהה של חלבונים אינטראקציה. החסרון של סריג יחס הוא הדמיה אשר מנצלת קרינת EPI widefield כדי לצבור מהירות הדמיה לכלול את התא כולו, וכתוצאה מכך ברזולוציה מופחתת וחדות של אברונים 12. העברת אנרגית תהודת פליטת אור (ברט) היא עודטכניקה מתקדמת כי יושם GPCRs למדוד את רכישת הקרבה מולקולרית לאורך זמן 11. בטכניקה זו fluorophore חלבון מחולקת מולקולרית וכל חצי צמוד לאחד שני חלבונים מדוברים. כאשר שני החלבונים מלווים במסר עניין אחד את השני, את החלקים של התג כימרי להרכיב מחדש לרכוש קרינה ואת הקרינה גדלה לכמת לאורך זמן.

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה עבור דימות תאי חיים יחד עם כימות תמונה ללמוד סחר R 1a AT בתא על גירוי אנג שני והשינוי פוטנציאל במסיירת הפנים AT R 1a כדי lysosomes בעקבות גירוי אנג שני. השימוש האולטימטיבי עבור טכניקה זו היא לאפיין הבדלים בסחר קרום השוואת סוג בר קולטנים מוטציה. הבדלים אלה יסייעו לזהות את המנגנון (ים) שפעת שפעילויות פיסיולוגיות של R 1a AT leading כדי ויסות לחץ הדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

יום אחד

1. זריעת תאים

  1. כן המלא בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM). הוסף 50 מ"ל של סרום שור העובר, 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ל של L- גלוטמין 450 מ"ל של DMEM לעשות 500 מ"ל של DMEM מלאה בתוספת סרום שור העובר (10%), פניצילין / סטרפטומיצין (1%) ו L- גלוטמין (1%).
  2. זרע כליה עובריים אנושיים (HEK) תאים, מספר מעבר 6-11 ב 50,000 / היטב במערכת coverglass 8 תאיים היטב שלם DMEM.
  3. שמור את השקופית תאיים על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 למשך 24 שעות.

יום שני

2. Liposome Transfection

  1. טרי להפוך AT פתרונות פלסמיד ליפוזום 1a R-GFP באמצעות בתנאים סטריליים עם ארון בטיחות ביולוגית ברמה 2.
  2. לדלל 2 μL של DNA פלסמיד ב 900 ng / μL פתרון המניות ב 178 μL של תקשורת סרום המופחת להשיג תרכיזיםיון של פלסמיד דנ"א של כ 10 ng / μL.
  3. לדלל 4.5 μL של פתרון מניות ליפוזום ב 175.5 μL של תקשורת סרום המופחת ליצור 01:40 דילול של המניות.
  4. מוסיפים את פתרון liposome לפתרון פלסמיד ומערבבים באמצעות פיפטור מ"ל 1 פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לערבב הפתרון transfection.
  5. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (C ° 25-27).
  6. בעוד תערובת זו היא דוגרת, להסיר את המדיה לאט עם pipettor 1 מ"ל ולאט לאט להוסיף 400 μL של בופר פוספט 1x (PBS) כי הוא מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
  7. בעדינות להסיר את PBS ולהחליף עם 200 μL / גם של התקשורת סרום מופחת מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס.
    הערה: היזהר בכלל הצעדים בעת שטיפת התאים כדי למנוע ניתוק של תאים מן coverslip בשל הלחץ העצום הנגרם על ידי pipetting.
  8. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 למשך 30 דקות.
  9. פעם התקופת הדגירה נגמרה, להוסיף 80 μL של תערובת transfection זה טוב דגירה התאים עבור 4.0-4.5 שעות אך לא יותר מ -5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2.
  10. לאחר תקופת דגירת transfection תושלם, להסיר את המדיה לאט מהתאים באמצעות pipettor מיליליטר 1 ולהחליף בעדינות עם 300 μL / טובה של DMEM מלא דגירת תאים עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 .

יום שלוש

3. סרום רעב

  1. הסר את המדיה בעדינות בעזרת פיפטור 1 מ"ל ולהחליף לאט עם 300 μL של סרום ללא DMEM ללא פנול אדום.
  2. שמירה על תא ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 עבור 10-12 שעות.

היום הרביעי

4. הדמיה של תא חי

  1. תאים תאיים כתם (lysosomes במקרה זה).
    1. אה בוut 30 דקות לפני הדמית lysosomes בתאים, להוסיף 22.5 μL מתוך 1 מיקרומטר פתרון פלורסנט לצבוע מניות (0.5 μL של 1 מ"מ צבע פלואורסצנטי מדולל 499.5 μL של הסרום ללא DMEM ללא פנול אדום) זה טוב עבור ריכוז לצבוע סופי של 75 ננומטר.
    2. דגירה של 25-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 ולאחר מכן להסיר את צבען בעדינות ובאיטיות להוסיף 300 μL של סרום ללא DMEM טריים ללא פנול אדום.
  2. הכן את המיקרוסקופ הדמיה.
    1. התאם את השלב למטה כדי למנוע ניזק לעדשה במהלך האתחול של מיקרוסקופ אוטומטית.
    2. הפעילו את המחשב מיקרוסקופ, כוח סורק, כוח לייזר ולאחר מכן פליטת לייזר, ולבסוף את המנורה הליד מתכת עבור תצפית ויזואלית (ראו הוראות היצרן מיקרוסקופ confocal).
    3. פתח את תוכנת הדמיה בתורו התוכנה על הארגון (488 ננומטר) עד הליזר וכוח 30-50%. הערת הכח תלויגיל לייזר. בתוך ניסויים חשוב לשמור הגדרות קבועות.
    4. הפעל לייזר אדום פולטות (למשל 568 ננומטר או 594 ננומטר).
    5. פורמט הדמיה הגדר לעומק 12-bit.
    6. הגדר את חריר עבור ננומטר לייזר ארגון קו 488 ועבור לייזר 568 ננומטר או 594 ננומטר עד 1 יחידת הדיסק אוורירי. אם GFP הוא מאוד עמום, להשתמש בהגדרה של 2 יחידות דיסק Airy, אבל להתאים את הערוצים כראוי.
    7. בעת שימוש סינונים dichroic, בחר את אורכי גל הפליטה המתאים GFP ואת צבע פלואורסצנטי. או, להגדיר את אורך גל הפליטה (Em) ב 499-580 ננומטר עבור GFP וא"מ 599 - 680 ננומטר עבור צבע פלואורסצנטי אדום פולטות.
    8. בדוק כי לדמם דרך מוצלב אינו מתרחש. כבו כל ליזר בתור ולבדוק בשני ערוצי הפליטה לכל. כאשר ליזר הארגון כבוי, פליטת הירוק צריכה להיות אפס. כאשר הליזר הפולט הירוק כבוי, ערוץ פליטת אדום צריך להיות אפס.
      הערה: השיטה הבטוחה ביותר היא דמות שכל אחד מהם במסלולים נפרדים (sequential).
    9. כלול ערוץ brightfield אם תרצה בכך. הימנע הדמיה בניגוד ההפרש (DIC), כי זה יכול להטות מדידות colocalization.
    10. הדמיה חיה, רציפי קו בוחרים ולא רציפי מסגרת.
  3. בחרו את תאי הדמיה.
    1. לנצל מספרי צמצם 1.4 (NA) אובייקטיבי כמו מטרת שמן 63X / 1.4 NA תאי תמונה (או 40X / 1.4 NA). מרכז את המטרה ולהוסיף טיפה של צמיגות גבוהה, שמן טבילת autofluorescence נמוך על המטרה.
    2. מעביר את התא עם תאי transfected מן החממה עד לשלב של המיקרוסקופ. הקפד לשמור את השקופיות שטוחות ולהבטיח כי החדר הוא יושב היטב ומאופק מתנועתו.
    3. הזז את המטרה עד טיפת שמן רק נוגעת בתחתית המגלשה; המטוס התקין המוקדים הוא ליד עמדה זו. בשנת מיקרוסקופים אוטומטית, לשמור את המיקום הזה, כמו גם את העמדה הורידה להשתמש עבור remainder של ניסוי הדמיה כדי להקל שינוי דגימות.
    4. בחר תאים עמומים. תאים overexpressing AT 1a R-GFP יהיה misdirect הקולטן בתא ולשבש תפקוד תקין.
    5. אשר נקבעו המתווה של התא, שהוגדרה על ידי קרום התא, גלויה ועדיף לא חופף עם תאים אחרים.
    6. פוקוס ומרכז את תא שדה הראייה.
    7. עבור למצב confocal.
    8. בחר מצב הדמיה מהר. עם יד אחת על מוקד השליטה והשנייה בשלט במת XY, להתמקד ומרכז את תא העניין דמיין בצג.
    9. ודא תא העניין משתרע היטב בצד התחתון או גחון שלו ומצמיד אותן באופן הדוק עם coverslip על ידי התמקדות מעלה ומטה דרך התא.
  4. הגדר את הפרמטרים z-הבמה לתמונה תא 3D.
    1. בחר את לחצן ההפעלה עבור לראש מחסנית Z שיח תחתון (או שווה ערך) ולהתמקד לתחתית של גell מכן הקש "להתחיל". לאחר מכן, להתמקד לחלק העליון של התא ולחץ על "סוף". בדוק שוב כי התא כולו כלול Z- מחסנית.
    2. הגדר את גודל צעד Z ל -1.0 מיקרומטר.
  5. הגדרות הדמית גדר.
    1. בחר 2 זום, בהתאם העדשה, כך שגודל פיקסל הסופי עומד 0.279 מיקרומטר x 0.279 מיקרומטר 0.14 מיקרומטר x 0.14 מיקרומטר בממד XY.
    2. עבור תאים HEK בניסוי הזה, להגדיר מהירות סריקה של כ 1 מיקרו-שניות לכל voxel ובחר 2 מיצוע או 2 הצטברויות אחר שורה, בהתאם בהירות של תאים.
    3. התאם עוצמת הלייזר ולהשיג הדמיה GFP ואת צבע פלואורסצנטי. באופן כללי, counterstains יהיה הרבה יותר בהיר ולכן גלאי המכפיל (PMT) ואת זרח גליום ארסניד לא (Gaasp) או גלאי היברידי (HYD) צריך להיות מנוצל עבור ערוץ צבע שני ואילו גלאי תנשמות HYD נחוצים בערוץ ה- GFP. אם HYD או Gaasp לזהותORS משמשים צבע פלואורסצנטי, להפעיל זהירות ולהתחיל עם לייזר לעבר כוח נמוך מאוד.
    4. משך הסריקה הגדר ותדירות סריקה, למשל, כל 30-60 של מעל 25 דקות או יותר כדי לראות המיקוד של 1a AT R-GFP כדי lysosomes.
    5. הגדר את הפוקוס האוטומטי כדי לשמור על יציבות במישור מוקד לאורך זמן.
  6. בגין ניסוי ההדמיה.
    1. הכינו אנג מראש 100x השנייה המניה ב 5 מיקרוגרם / μL (4.7793 מ"מ) ולהוסיף 2.1 μL של זה 998 בינוני μL (10 מיקרומטר).
    2. בגין גירוי ליגנד על ידי תוספת של 3 μL של פתרון המניות 100x של ליגנד (אנג II) ל -300 היטב המכיל μL מיד לפני הדמיה (ריכוז סופי 100 ננומטר).
    3. לחץ על התחל ותמונה ב 3D בפעם ואת התדר הרצוי.
    4. לפני מסיימת לעבוד על המיקרוסקופ, לאסוף Z- מחסנית לשימוש עתידי רקע חיסור במהלך ניתוח. במצב ספירת פוטון, זה לאדרוש משום ברקע הוא בעצם 0. עם תאורה מופעלת וכל תנאי ההדמיה האחרים זהה, אך ללא מדגם לקחת תמונה לדוגמא. ראה רקע חיסור (בהמשך) מתוך ניתוח.

היום החמישי

ניתוח תמונה 5.

  1. ייצוא תמונות לפורמט TIFF.
    1. קליק ימני על שם קובץ התמונה כדי לראות תפריטים ובחר ייצוא או לחץ על קובץ | יצוא | יְבוּא.
    2. ייצוא ל TIFF עבור ניתוחים שלאחר מכן מוודא לייצא את RAW, נתונים 12 סיביות [לא 'ירוק כחול אדום' (RGB) המרה משמש תמונות באיכות פרסום]. אין לייצא לפורמט JPEG.
    3. הערת X, Y, מידות voxel Z ואת גודל z-צעד לשימוש מאוחר יותר במהלך ניתוח תמונה. לדוגמה, באמצעות 40X / 1.4. NA מטרת עדשת ערכים אלה עשויים להיות 0.138 מיקרומטר x 0.138 מיקרומטר עם 1 מיקרומטר z-צעד גודל (ראה נתונים בקטע תוצאות הנציג).
  2. צור ערימת תמונה לניתוח.
    1. תוכנת כימות פתחה תמונה (איור 2)
    2. השתמש "פעולה | צור חדש | תמונות מתוך רצף נבחר" כדי ליצור קובץ תמונה בודדת מתוך סדרות יחידות מיובאות (איור 2, חץ # 1).
    3. הזן את מספר הערוצים, מספר סעיפי z, ואת מספר נקודות זמן.
    4. בהתאם למבנה קבצי .tiff *, בחרו, לדוגמה, ערוצים, Z- מטוס, מועד לפי שעון כסדר של מטוסי התמונה. ודאו שערמת התמונה הסופית מייצגת ערוצי הצבע בצורה נכונה, Z- מחסנית, ונקודות זמן של התמונה המקורית.
    5. בחר את שם התמונה (איור 2, הדגיש שם הקובץ בצד שמאל, חץ # 2). קליק ימני על התמונה ו / או שדה התמונה, ומבין האפשרויות בתחתית הרשימה ובחר "מאפיינים". ב פיקסל מיקרומטר עבור (X) (Y) ו- (Z) גודל, הזן את מאפייני תמונה הנכונים שצוינו לעיל.
  3. רקע פחת לפני ניתוח תמונה. תיקון רקע ניתן להשיג בכל תוכנת ניתוח תמונה. רקע פחת באמצעות אחת משתי אפשרויות.
    1. אפשרות 1: בחר "פעולה | צור חדש | חיסור רקע" (איור 2, חץ # 1). השתמש תמונת רקע רכשה שהושגה בסוף פגישת ההדמיה שתוארה לעיל כתמונת "הפנייה האפלה" תחת "כלים | הפחת רקע".
    2. אפשרות 2: בדוק את האזורים האפלים של תמונות שבו אין מדגם, למצוא את שביל או בהירות מקסימלית של פיקסלים באזור זה, התעלמות מכל פיקסלים בהיר בצורה יוצאת דופן שיכול להיות fluorophore מזויף, פיקסל בהיר באופן אקראי, או כמה תופעה אחרת. בחר "פעולות | צור חדש | חיסור רקע". השתמש בהירות פיקסל זה (עשה שלילי) כפי הקיזוז.
  4. בדקו רישום צבע נכון אם יש צורך.
    1. שימוש כביקורת חיובית כגון microbeads צילמו, או, colocalized GFP המכילים שלפוחיות צבע פלואורסצנטי (איור 3) להעריך את הצורך תיקון על ידי מעבר בין ערוץ צבע אדום או ירוק לסירוגין. מבחינה ויזואלית, אם הרישום כבוי גם על ידי 1 פיקסל, ברור לעין.
    2. צור תיקון הרישום על ידי בחירת "פעולות | צור חדש | תיקון רישום" (איור 2, חץ # 1) ולהשתמש בתיבת הדו-שיח כדי לבצע התאמות. עם השלמת פריט תיקיה חדשה תופיע תחת הכותרת "תיקון רישום".
    3. החל את רישום לאחד או יותר מתמונות של הריבית על ידי לחיצה על שם התמונה (איור 2, הדגיש שם הקובץ בצד שמאל, חץ # 2) ולאחר מכן בחירת "כלים | רישום נכון" (כפתור כלי סמוך פעולות).
  5. צור רצף מדידה לנתח AT שלפוחית R-GFP 1a ועוצמת התא כולו הבאהטיפול עם אנג שני.
    1. בחר תמונה (איור 2, הדגיש שם הקובץ בצד שמאל, חץ # 2) ולצייר באזור (ROI) עניין סביב תא בודד שימוש באפשרות באזור פריסטייל (איור 2, # החץ 3). השתמש במצב הפוקוס המורחב (2D, תפריט נפתח בצד שמאל למעלה) כדי לבחון את התא ככלי החיתוך עובדים רק להדמית 2D.
    2. קליק ימני על התמונה ובחר "חתוך לפי בחירה" ופריט תמונה חדש נוצר.
    3. בחר את התא קצוץ על ידי לחיצה על שמו ולאחר מכן בחר בכרטיסייה "מדידה" לעיל (איור 2, חץ מס '4).
    4. כדי להגדיר ולמדוד שלפוחית הפנימה עבור GFP, לגרור "מצא אובייקטים" תחת "מציאה" (איור 2, חץ # 5) לתוך תיבת רצף (איור 2, חץ # 6).
    5. הגדר "מצא אובייקטים" ערוץ לערוץ GFP.
    6. פתח את ההגדרות (סמל גלגל בתיבת דו-שיח, חץ # 6) ולהגדיר4; סף באמצעות: "אל SD ו" גבול תחתון "עד 6. גדר" גודל אובייקט מזערי "ל -0 מיקרומטר 3.
      הערה: גבול תחתון הס"ד יהיה תלוי ניסויים בודדים. אישור חזותי שהאובייקטים הנכונים thresholded נעשית על ידי בחינת בנקודות זמן שונות (איור 2, חץ # 7). "המדידה | אפשרויות משוב" תיבת הדו-שיח משמש לבחור את הדרך שבחרה חפצים thresholded הם דמיינו (איור 2, חץ # 8).
    7. לחץ על "מדוד" ב "אובייקטים מצאו" תיבת הדו-שיח (# חץ איור 2 6) ובחר את הערוצים וסוג המדידות. בדרך כלל, לבחור "כל הערוצים" ו "מדידות עוצמות ונפח".
    8. כדי להגדיר את thresholding ומתקנים לטיהור זיהוי של התא כולו וכדי למדוד עוצמת GFP הכולל, לחזור הפעולות הנ"ל (5.5.4 - 5.5.8) באמצעות הפרמטרים הבאים: SD 0 ו "גודל אובייקט מזערי" 2 μ; מ 3 בתיבה "מצא אובייקטים" הדו-שיח השני כדי לזהות תאים באמצעות GFP (איור 2, # חץ 9)
    9. גרור "אוכלוסייה מסננת" תחת "סינון" לתיבת הרצף תחת אוכלוסיית 2 (בתיבת "מצא אובייקטים" השנייה, איור 2, חץ # 9). "בחר Volume (מיקרומטר 3> 100).
    10. ראייה להבטיח כי רק אובייקט אחד מזוהה. התא כולו צריך להיות thresholded ובכל חפץ אחר מסוננים משם. פרמטר "המסנן" (ים) עשוי להזדקק התאמה אם התא הוא קטן, למשל.
    11. לאחר המדידה כבר טופלה, להציל את הפרוטוקול על ידי לחיצה ימנית על התמונה ובחר "שמור פרוטוקול" כדי לעשות שימוש חוזר ( "שחזור פרוטוקול"). הפרוטוקול ניתן גם לייצא על מנת ליצור רשום באותה בתיקייה כתמונה.
    12. המשך אל "הפוך ומדידה" על ידי בחירת "מדידות | הפוך פריט ומדידה" (איור 2 , חץ # 8) או לחיצה ימנית על התמונה ובחר "הפוך ומדידה" ו "כל timepoints".
    13. הזן את שם המדידה הנכון (להעתיק ולהדביק מהתמונה נוחה) וקוד ניתוח או תאריך (תוספת מועילה עבור רישומים) ובוחרים "כל timepoints". פריט גיליון חדש ייוצר מתחת לתמונה. שמור שמות קבצים תמציתיים.
  6. לנתח ולייצא את הנתונים.
    1. לחץ על שם הקובץ גליון העבודה ובחר בכרטיסייה "לנתח". קבע אם ווקסלים רוויים נוכחים ידי הבחירה הראשונה "הגבל ניתוח ל:" לבחור 2 אוכלוסין (התא).
    2. קליק ימני על השדה תחת "הכרטיסייה נתח" בתיבת הדו-שיח תחת "לנתח נתונים אלה:" לבחור "מקס ([ערוץ צבע GFP])"; תחת "סיכם:" לבחור "Mean ([ערוץ צבע GFP]"; ותחת "ארגן את הנתונים על ידי:" ו "שורה" לבחור "timepoint" ו CLIck "אישור".
      הערה: אם נתונים מכילים פיקסלים רוויים (למשל 65,536 עבור 16 סיבי או 4,096 עבור 12-bit), הניתוח לא יהיה מדויק (זה יהיה לזלזל תוכן שלפוחית). להתעלם תא לניתוח. אם לא רווי, המשך לשלב הבא.
    3. לאחר מכן, תחת הלשונית "Raw" ולאחר מכן תחת לשונית "הניתוח" ו לחיצה ימנית על הנתונים למצוא "הגבל ניתוח ל:" ולאחר מכן בחר אוכלוסין 1 עבור שלפוחית ​​או אוכלוסין 2 עבור התא כולו.
    4. תחת "לנתח נתונים אלה:" לבחור "סאם" (ערוץ צבע GFP); "סיכם:" תחת בחר "סכום"; ו, תחת "ארגן את הנתונים על ידי:" ו "שורה" לבחור "timepoint" או "זמן יחסית" ולאחר מכן לחץ "אישור". בחירות ניתוח ניתן לשמור ולעשות בהם שימוש חוזר.
    5. לבחור ולהעתיק / להדביק ישירות מהתוכנה quantitation התמונה גיליון אלקטרוני ריק או לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על datובחירה באפשרות שמור כקובץ csv. מדידת עוצמת תא כולו תיכלל עם מדידות של כל שלפוחית ​​באוכלוסייה כדי להיות בטוח כדי לזהות ולהפריד בינו לבין השלפוחית.
      הערה: לאחר התוויית הנתונים, עליית GFP קרינה הכוללת מצויה בתוך שלפוחית ​​עולה במהירות. Photobleaching, אם היא מתרחשת, הוא זוהה כמו אובדן עוצמת GFP תא הכולל לאורך זמן.
  7. צור רצף מדידת לנתח נוכחי GFP ב lysosomes.
    1. ב האובייקטים מצאו (אוכלוסין 1), להגדיר "מצא אובייקטים" ערוץ לערוץ האדום סמל גלגל בתוך התיבה דו-השיח שמציינת חץ # 6 (איור 2) סט "סף באמצעות:" אל SD ו "גבול תחתון" כדי 6. הגדר "גודל האובייקט מזערי" כדי 0.017 מיקרומטר 3.
      הערה: גבול תחתון הס"ד יהיה תלוי ניסויים בודדים. אישור חזותי שהאובייקטים הנכונים שמתבצעים thresholded צריך להיעשות על ידי בחינהנקודות ining זמן שונות. "המדידה | אפשרויות משוב" תיבת הדו-שיח משמש לבחור את הדרך שבחרה חפצים thresholded הם דמיינו (איור 2, חץ # 8).
    2. לחצו על "מדוד" ב "מצא" אובייקטים "שיח (# חץ איור 2 6) ובחר את הערוצים וסוגי מדידות. בדרך כלל," כל הערוצים "ו" מדידות עוצמות ונפח "נבחרים.
    3. עבור אוכלוסייה 2, הגדרות שימוש זהה לזה המשמש לזיהוי תאים transfected כולה להביע AT R-GFP 1a (5.5.9).
    4. אם מספר תאים (כולל תאים untransfected עם שלפוחית ​​צבען חיובית ניאון) נוכחים, חיתוך התא בשלב הניתוח הראשון הוא קריטי. לחלופין, את השימוש של "למדר" צריך לשמש כדי להגביל זיהוי של lysosomes בתוך התא transfected להביע AT 1a R-GFP. ליזוזומים חייב להיות מזוהה רק בתוך התא GFP ולא ממקום סמוך, תאי untransfected.
    5. לנתח ולייצא נתונים כנ"ל.
      הערה: דוגמא של תאי שלפוחית thresholded מוצגת באיור 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בשנת סט נציג זה של ניסויים, תאים HEK היו transfected עם הקולטן 1a סוג אנגיוטנסין (AT 1a R-GFP) לבנות (R 1a E1,2,3-AT) משובטים לתוך פלסמיד pEGFP-N2 13. זמן לשגות תמונות של HEK נרכשו ושיחק כסרט (ראה הדמיה תא חי 1 והדמיה תא חי -2 סרטים). הסרטים וסטילס מראים כי לאחר גירוי ליגנד, AT 1a R-EGFPs הם נקודות בעיקר בקרום הפלזמה, אבל עם התוספת של אנג השנייה קולטנים אלה ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניסויים ראשוניים שהוצגו כאן להמחיש כי על קורס זמן קצר למדי של 24 דקות, שום שינוי ניכר במסירת 1a AT R-GFP אל lysosomes התרחש. באופן כללי, משלוח של קולטנים הפנימו כדי lysosomes יכול להתרחש מוקדם ככל 15-20 דקות. ניסוי זה עולה בקנה אחד עם ההשערה כי חלק הארי של הפנים AT R 1a מיועד endosomes הגדול, perinuclear. עדויות שלפחות חלק AT 1a R מגיע lysosomes הודגם על ידי Li et al. , שהשווה תאים ב 5 דקות ו 30 דקות לאחר טיפול אנג השני ומצא colocali...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודת המחקר שהוצגה בכתב היד הזה נתמכה על ידי מענק R01 HL121456-01A1 קתרין זנדברג. עבודה זו נתמכה בנוסף לפי הזמינות של לייקה SP8 AOBS ב מיקרוסקופית והדמיה משותף משאבים (מצר) במרכז הרפואי של אוניברסיטת ג'ורג'טאון הממומן חלקית על ידי P30-CA051008 מן המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית של אמריקה. אנו בתודה להכיר סיוע הדמיה Leica SP8 ידי פיטר ג'ונסון, והשימוש של Zeiss LSM880 במעבדה של תומס Coate, החוג לביולוגיה באוניברסיטת ג'ורג'טאון עם סיוע הדמיה מסופק על ידי אלמה ארנולד של Carl Zeiss מיקרוסקופית LLC. התוכן בכתב היד הזה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנגיוטנסין II (אנג II)סיגמא-אולדריץ'A9525 
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש 
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichF2442חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
פניצילין סטרפטומיצין (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)Gibco (טכנולוגיות חיים)25030-081חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
כליה עוברית אנושית (HEK)-293 תאיםאוסף תרבית מסוג אמריקאי (ATCC) CRL-1573מעבר מספר 5 - 12
Nunc Lab-Tek II תא 1.5 מערכת כיסוי גרמניתSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific11668019 Store ב-4 מעלות; C 
Opti-MEM, סרום מופחת בינוניGibco- ThermoFisher Scientific31985-070חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
PBS 10x פישר ביו-ריאגנטיםBP3994חמים ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
LysoTracker Red DND-99-ThermoFisher ScientificL7528אחסן ציטוטים בחושך ב-20 מעלות; ג. 
Volocity Ver. 6.3 תוכנת ניתוח תמונהPerkinElmerמודולי הדמיה וכימותלניתוח תמונה תלת מימדית של ערימות תמונות
Leica SP8 AOBSLeica Microsystemsמיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזרלאיסוף תמונות
Zeiss LSM 880Carl Zeissמיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזרלאיסוף תמונות
בדיקות מולקולריות

מקורות

  1. Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
  2. Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
  3. Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
  4. Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
  5. Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206(2008).
  6. Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003(2010).
  7. Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
  8. Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
  9. Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
  10. Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
  11. Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26(2014).
  12. Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613(2016).
  13. Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
  14. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  15. Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
  16. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  17. Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
  18. Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HEK 293GFPTime Lapse

מאמרים קשורים