מאמר שיטה

בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים

DOI:

10.3791/55202

⸱

8 במרץ 2017

 ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, University of California, Merced, 2Centro de Investigaciones Cardiovasculares, Universidad de la Plata and Conicet, 3Facultad de Ingenieria, Universidad Nacional de Entre Rios, 4Department of Physiology, Midwestern University, 5School of Engineering, University of California, Merced

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של ​​משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלב, מחקרי איתות מולקולריים בדרך כלל מבוצעים מיוציטים מבודדים. עם זאת, במצבים פתולוגיים רבים כגון איסכמיה והפרעות קצב ניתן רק מובנים לחלוטין ברמת האיבר השלמה. כאן, אנו מציגים טכניקה ספקטרוסקופיות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי (LFFM) המאפשר מדידת אותות סלולריים בלב שלם. הטכניקה מבוססת על שילוב של לב perfused Langendorff וסיבים אופטיים להקליט אותות ניאון. יש LFFM יישומים שונים בתחום הפיזיולוגיה הלב וכלי הדם ללמוד את הלב בתנאים נורמליים ופתולוגיים. משתנה לב מרובה ניתן לנטר באמצעות אינדיקטורים ניאון שונים. אלה כוללים cytosolic [Ca 2 +], הרטיקולום תוך sarcoplasmic [Ca 2 +] ופוטנציאלים הממברנה. בדיקות ניאון אקסוגניים נרגשות הקרינה הנפלטת מזוהית עם שלושה הסדרים שונים של טכניקת LFFM epifluorescenceהם מובאים במאמר זה. ההבדלים המרכזיים בין הטכניקות האלה הם הסוג של מקור אור המשמש עירור ובדרך אור העירור היא מווסתת. LFFM פעם (PLFFM) משתמש פעימות ליזר אור בעוד LFFM גל מתמשך (CLFFM) משתמש באור הליזר רציף עבור עירור. לבסוף, דיודות פולטות אור (LEDs) שימשו כמקור האור השלישי. סדר אי-קוהרנטי זה נקרא מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED פעם (PLEDFM).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הלב הוא האיבר המרכזי של מערכת הלב וכלי הדם. ההתכווצות של הלב היא שיזמה גידול תאי [Ca 2 +]. הקשר בין רגישויות חשמל שינויים במהדורה תאית Ca 2 + נחקרת הסטורית בתאים ניתקים enzymatically 1, 2. עם זאת, תאי לב הם חשמליים, מבחינת מטבולית מכאנית מצמידים 3, 4. כאשר מבודד, myocytes הם לא רק פיזי זוגיים, אבל מיוציטים משכבות שונות מעורבבים במהלך דיסוציאציה 5. יתר על כן, למרות היתרונות העצומים שהתפתחו מהמחקר של תאים מבודדים בתנאים מהדקים מתח, 6, 7, 8 ערך מהותו של הלב בתור alwa syncytium חשמלys מציב את השאלה: כיצד מבחינה תפקודית שונים תאים ניתקו מן הנוכחים בתוך הרקמה 3.

בכתב היד הזה, אנו מתארים את ההתקדמות שהושגה ידיעת הפיסיולוגיה של לב על ידי השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי (LFFM) טכניקות בלב השלם. LFFM משתמשת אינדיקטורים ניאון כדי למדוד משתנים פיזיולוגיים רבים כגון Ca cytosolic 2+, הרטיקולום sarcoplasmic התוך (SR) Ca 2 + פוטנציאל הממברנה. מדידות אלו ניתן לקבל בו זמנית בשיתוף עם חדרית לחץ 9, 10, אק"ג 9, פוטנציאל פעולת חשמל (APS), קלטות זרם יוניות ו photolysis פלאש של תרכובות בכלוב 4, 11. בנוסף, מדידות אלה ניתן להשיג על ידי צעדה בלב שלם בתדרים גבוהים יותר קרובr ל פיזיולוגיים. למרות כמה מאמרים 9, 11, 12, 13, 14 פורסמו על ידי הקבוצה שלנו באמצעות טכניקות LFFM, חזק מורכבות טכנית הקשורים הטכניקה הזו מנעה השימוש המסיבי שלה לחקר תופעות פיסיולוגיות vivo לשעבר בלב ובאיברים אחרים.

טכניקת LFFM (איור 1) מבוססת על מדידות epifluorescence שהושגו באמצעות סיב אופטי multimode במגע עם הרקמות. כמו כל טכניקת דימות פלואורסצנטי קשר, ברזולוציה האופטית תלויה בקוטר ואת הצמצם המספרי (NA) של הסיבים. 'גבוה NA וקטנה בקוטר של הסיבים יגדיל את הרזולוציה המרחבית של המדידות. NAS ובקטרי סיבים יכולים לנוע בין 0.22 ל 0.66 מ 50 מיקרומטר 1 מ"מ, בהתאמה. במקמט את NA ישפר את יחס האות לרעש (S / N) על ידי קבלת פוטונים המגיעים מזווית מוצקה גדולה. כדי לפעול כהתקן epifluorescence, קרן האור ממוקדת לתוך הסיב האופטי עם עדשה אספריים או אובייקטיבי epifluorescence שבו NA של העדשה ואת משחק הסיבים. התאמה זה ממקסם את העברת האנרגיה עבור עירור לאיסוף חזרה הפוטונים הנפלטים על ידי fluorophore.

כדי להלהיב את האינדיקטורים פלורסנט אקסוגניים טעונים בתוך הרקמה, מקורות אור שונים מצבי תאורה יכולים להיות מנוצלים. המחקרים החלוציים שלנו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה המקומי פעם 3, 12 (PLFFM) העסיקו ליזר picosecond בעלות נמוכה (איור 1 א, PLFFM). סוג זה של מקור אור יש יתרון ענק של מרגש חלק גדול של מולקולות fluorophore מתחת לאזור תאורה ללא משמעותית הלבנת לצבוע בשללדופק קצר משכי 12. בנוסף, השימוש של פולסים אולטרה אפשר ההערכה של חי הקרינה של הצבע 12. אורך חיי הקרינה הוא נכס שיכול לשמש כדי לכמת את החלק היחסי של מולקולות צבע חייבות Ca 2 +. למרבה הצער, jittering הזמני של פולסים ווריאציות משרעת מן הדופק אל הדופק להגביל את היישום של האסטרטגיה ניסיוני זה אך ורק למקרים בהם שינוי הקרינה המיוצר על ידי ליגנד מחייב לצבוע גדול.

לייזרי גל מתמשכים (CW) משמשים בדרך כלל כמקור התאורה העיקרי LFFM (1b, CLFFM). קרן הלייזר יכול להאיר את רקמת ברציפות או יכול להיות מווסתת ferroelectrically. אפנון ferroelectric של הקרנות מאפשר הדור של פולסים המיקרו של אור. ניתן לשלוט אפנון זה על ידי חומרה חיצונית. נוהל זה לא רק מפחיתה באופן דרמטי tהוא jittering הזמני של להבזקי האור אלא גם מאפשר ערבוב קורות באורכי גל שונים. הערבוב של קורות נעשה על ידי ריבוב קרני לייזרים שונים. כתוצאה מכך, צבעים מרובים בעלי תכונות ספקטרליות שונות יכול להיות נרגש לבצע מדידות של מגוון משתנים פיזיולוגיים, למשל, רוד-2 עבור cytosolic Ca 2 +, MagFluo4 עבור Ca התוך-SR 2 + ו di-8-ANEPPS עבור פוטנציאל הממברנה.

למרות לייזרים הנוכחי יתרונות שונים כמקור אור LFFM, סוגים אחרים של מקורות אור ניתן להשתמש כולל דיודות פולטות אור (LEDs). במקרה זה, מקור אור עירור כלל LED InGaN (איור 1 ג ', PLEDFM). נוריות, פוטונים נפלטים באופן ספונטני כאשר אלקטרונים בפס ההולכה להשתלב מחדש עם חורים פס הערכיות. ההבדל עם לייזרים של מצב מוצק הוא כי הפליטה אינה מגורה על ידי פוטונים אחרים. התוצאה היא קרן בלתי קוהרנטיתפליטת ספקטרליים רחבה יותר עבור נוריות.

ניתן להשתמש בסוגים שונים של נוריות חשמל גבוהות. עבור הקלטות AP באמצעות Di-8-ANEPPS ועבור Ca 2 + הארעיים להקליט באמצעות Fluo-4 או מג-Fluo-4, השתמשנו LED בעל פליטת שיא טיפוסי בבית 485 ננומטר (כחול) ברוחב חצי של 20 ננומטר (איור 1D). עבור 2 + ארעי Ca מוקלט עם רוד-2, הנורית הייתה פליטת שיא אופיינית ב 540 ננומטר (ירוק) ברוחב חצי 35 ננומטר (איור 1 ד). נוריות פולטות באורך גל להקה ולכן דורשות במסננים כדי לצמצם פליטת ספקטרליים שלהם. בנוסף, אור פעמו יכול להיווצר בשיעור של 1.6 kHz עם משך 20 מיקרו-שניות. נוריות היו פעמו עם טרנזיסטור אפקט שדה MOSFET כוח מהר. ניתן לבצע הקלטות סימולטני עם אינדיקטורים שונים על ידי ריבוב זמן הנוריות. למרבה הצער, האור הנפלט על ידי נוריות הוא יותר קשה להתמקד על גבי סיבים אופטיים לעומת קרן לייזר. לפיכך, החיסרון העיקרי מאיתנוing נוריות הוא כי פרופילי הפליטה שלהם יש התקות זוויתי (± 15 °) מהציר הראשי, וכן אופטי עזרו חייב לשמש כדי לתקן את זה.

בכל התצורות האופטיות שתוארו לעיל, אור העירור משתקף בעזרת מראה dichroic. אלומת האור ממוקד בהמשך על ידי עדשה אספריים לבין מטרה מיקרוסקופ על גבי סיבים אופטיים multimode כי היא ממוצבת על הרקמה. כמו בכל הסדר epifluorescence, המראה dichroic משמש גם כדי להפריד בין עירור מן האור הנפלט. ספקטרום האור הנפלט נוסע בחזרה דרך פילטר מחסום כדי להסיר כל עירור משתקף. לבסוף, האור הנפלט מתמקד עם מטרה על גבי photodetector (איור 1).

התמר מאור הזרם חשמלי מבוצעת על ידי פוטודיודות מפולת סיליקון. יש דיודות אלה תגובה מהירה ורגישות גבוהה המאפשרת זיהוי באור נמוך. הפוטונים המיוצרים על ידי פוטודיודות המפולת יכולים להיות מוגברים בשתי דרכים: מגבר transimpedance שיש אלמנט משוב resistive (1e איור) או על ידי אינטגרטור להמיר זרם אל (1F איור) מתח. השימוש בגישה הראשונה, מתח המוצא הוא יחסי הפוטונים ואת נגד המשוב. דוגמה טיפוסית של זיהוי התנגדות של פעימות לייזר picosecond מוצג דמויות 2a, 2b ו 2c. 2a הלוח ממחיש את הפלט של מגבר transimpedance ו -2 לוח מציג התרחבות זמן של המרווח המסומנים בכוכבית (*). אלגוריתם מעקב שיא יושם כדי לזהות את השיא (אדום) ובסיס (ירוק) עבור התגובות פלורסנט 12. מדידת קרינת הבסיס מספקת מידע הן של הזרם האפל של photodiode המפולת ואת הפרעות שהנהיג lig הסביבהht צימוד אלקטרומגנטי. ייצוג של פסגות ובסיסים מוצג איור 2 ג. נתון זה ממחיש את הקרינה הנפלטת לצבוע (Rhod-2) כבול Ca 2+ במהלך מחזור הלב של לב תוכי מכות.

בשיטה השנייה, מתח המוצא של האינטגרטור היא פונקציה של המשוב הנוכחי קיבולי (איורים 2, 2e, ו 2f). איור 2f מציג שני מחזורי אינטגרציה רצופים: ראשון ללא וחיצונית שנייה עם להבזקי אור שימושיים מתוך LED פעם. תיאור מפורט מוצג 2G דמויות 2h. גישה זו, אם כי מייגע יותר, מספקת S גדול / N בשל היעדר רעש תרמי קבל המשוב. המכשיר כולל שלב עיתוי שיוצר כל המלאה ריבוב של אור העירור ופקודות שילוב headstage מילet תקופות. זה מבוצע בדרך כלל עם מעגל עיבוד אות דיגיטלי כי גם מבצע בידול דיגיטלי של אות המוצא המשולבת באמצעות חישוב רגרסיה on-line של הנתונים. במקרה של שימוש משוב resistive, בכל ועדת רכישת A / D ניתן להשתמש.

לבסוף, טכניקת LFFM שלנו היא תכליתיות מאוד יכולה להיות מותאמת כדי להקליט יותר באזור אחד. הוספת מפצל אלומת נתיב האור מאפשרת לנו לפצל את האור לשתי סיבים אופטיים. כל סיב אופטי ניתן למקם ואילך באזורים שונים של רקמות, באופן עצמאי, לרגש פליטת שיא מן בדיקות ניאון אקסוגניים. שינוי זה מאפשר לנו להעריך כיצד הבדלים אזוריים אנטומיים להשפיע משתנים פיזיולוגיים. איור 3 מראה ספליטר הקורה להיות מועסק לפצל את אור עירור CW כך שני סיבים אופטיים משמשים למדידה או תאיים חשמל transmural [Ca 2 +] שנינות רמותh-הפולשנות קטין. אותות transmural ניתן להקליט על ידי הנחת סיב אחד על endocardium והשני על השכבה epicardium של קיר החדר. לכן, טכניקת LFFM יש את היכולת למדוד את מהלך הזמן של אותות סלולריים באזורים שונים וניתן להשתמש בו כדי לבדוק אם שינויים אזוריים להתרחש תחת מצבים פתולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה וכל הטיפול בעכברים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי UC מרסד ועדת שימוש (מס '2008-201). ניסויים עם תוכים נערכו בשנת 1999 בהתאם למדיניות כללית לשימוש בעלי חיים שהוקם על ידי הוועדה המדעית של מכון ונצואלה למחקר מדעי (Ivic).

1. Langendorff הגדרת הכנה

  1. הכן פתרון Tyrode המכיל ריכוזי המומס הבאים מ"מ: 140 NaCl, KCl 5.4, 2 2 CaCl, 1 2 MgCl, 0.33 Na 2 4 HPO, 10 גלוקוז, 10 HEPES. התאם את ה- pH של התמיסה Tyrode 7.4 עם NaOH ולסנן הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
  2. טען את פתרון Tyrode לתוך 60 מזרקי המ"ל וכל הצינורות של Langendorff האופק הגדרת 11, 12 באיור 4. ודא לחסל את כל בועות האוויר.
  3. פתרון לאזן Tyrode עם 100% O 2 באמצעות "אבן אוויר" פלסטיק שקוע כפי שמודגם באיור 4.
    1. חיבור צינורות פלסטיק טנק O 2.
    2. הוספת מתאם טי פלסטיק להנמיך צינור 5 "לתוך התמיסה Tyrode בתוך המזרק 60 מ"ל.
    3. צרף אבן אוויר פלסטיק עד הסוף של הצינור 5 "כך O 2 בועת רצון אל פתרון Tyrode.
  4. מניח תפר כירורגים לא נספג סביב מחט משמש צינורית. המחט היא מצמידה את הסעפת (ראה איור 4) המאפשרת זלוף רטרו עם פתרונות שונים. לבסוף, אבי העורקים של הלב יהיה cannulated לתוך המחט.

2. הכנת בעלי חיים ולב Dissection

  1. לשקול ולהזריק את העכבר עם הפרין (לשעבר. עכבר של g 20 משקל, להזריק עם 20 יחידות או 200 μL) 15 דקות לפני והרדמת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם. להרדים תוכים פי to המדריכים השימוש בבעלי חיים של פרוטוקול IACUC שלך ולאחר מכן להמשיך עם נקע בצוואר הרחם.
    הערה: השתמש עכברים בן 8 שבועות או 20 תוכים גרם.
  2. הסר את הלב מחלל בית החזה לאחר euthanization. חלץ לבבות תוכיים בדיוק באותו אופן כפי שתואר עבור עכברים.
    1. נקה את חזה העכבר עם אתנול.
    2. בעזרת מספריים לנתיחה, עושים חתך בבטן התחתונה ולאחר מכן לחתוך את הצדדים לכיוון הצוואר.
    3. משוך לאחור את הרקמה לגזור בזיהוי מדויק.
    4. חותכים את הסרעפת. היזהר בעת חיתוך הסרעפת כדי למנוע נזק ללב.
    5. הסר את הריאות ואת הרקמה שמסביב.
    6. להשתמש בפינצטה כדי לגרוף את הלב בלי ללחוץ אותה. חותכים את אבי העורקים זמן רב ככל האפשר.
  3. הובלת הלב על סירה לשקול קטנה עם כ 1 מ"ל פתרון Tyrode.
  4. באמצעות תפר כירורגים שאינם נספג, לקשור את אב העורקים על מנגנון Langendorff האופקי באמצעותמַחַט. לקשור את אבי העורקים בלב בעזרת שני פינצטה בסדר. בגין-זלוף רטרו על ידי פתיחת שסתום הממוקם בסדרה עם 60 מזרקים מ"ל המכיל פתרון Tyrode.
  5. אפשר בלב לייצב במשך 10 דקות. השתמש הפעם לנקות דם ורקמת שומן סביב הלב לפני טעינת לצבוע. משוך את רקמת השומן סמוך לבסיס של הלב עם פינצטה לחתוך באמצעות מספריים לנתיחה קטנים. הקפד לעשות זאת תחת לאור מיקרוסקופ לנתח.

3. Cytosolic Ca 2 + מידות: הכנת דיי Rhod-02:00

  1. הוסף 20 μL של 20% pluronic (פעיל שטח בלתי יוני) ב DMSO בקבוקון פלסטיק ארוזים מיוחד שספק יצרן לצבוע המכיל 50 מיקרוגרם של הצבע.
  2. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
  3. מעבירים את DMSO מעורבת עם פעילי שטח בלתי יוניים לצבוע מבקבוקון פלסטיק ארוזים מיוחד לתוך בקבוקון זכוכית שקופה. הוסף 1 מ"ל של solu Tyrodetion כדי בקבוקון זכוכית שקופה.
  4. Sonicate במשך 15-20 דקות בתוך sonicator אמבטיה.
  5. Perfuse לצבוע באמצעות משאבות פריסטלטיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. מניח את הצבע בתא צבען.
    2. השתמש מהדק מכאני לדחוס את כל קווי צינורות אחרים המחוברים הסעפת. המהדק ממוקם מעל הסעפת. זה ימנע כל backflow לתוך הצינורות המחוברים 60 מזרקי המ"ל.
    3. הפעל את משאבת peristaltic זלוף להתחיל במחזור לצבוע. מיד לסגור את שסתום 3 כיווני מתחת ל -60 מ"ל במזרק.
    4. מקם צינורית קטנה המחובר למשאבת peristaltic יניקה ליד הלב כדי recirculate לצבוע כי כבר perfused לתוך הלב.

4. Intra-SR Ca 2 + מידות: הכנת דיי מאג-Fluo4AM

  1. כן Mag-Fluo4AM באותו אופן כמו רוד-02:00. ראה גם סעיף 3 לקבלת הוראות צעד חכם.
  2. After טעינת צבע, לפתוח את שסתום הממוקם בסדרה עם 60 מזרקים מ"ל המכיל פתרון Tyrode להתחיל זלוף רטרו. הקפד להסיר את המהדק מעל הסעפת.
  3. הוסף פתרון Tyrode לתא האופקי ולחמם עד 37 מעלות צלזיוס.
  4. -Perfuse רטרו עם פתרון Tyrode במשך 45 דקות כדי להסיר את צבען cytosolic.

5. מדידות פוטנציאל הממברנה: הכנת דיי Di-8-ANEPPS

  1. הוסף 5 מ"ל של אתנול 99% כדי בקבוקון צבע המכיל 5 מ"ג של צבע.
  2. Aliquot 10 μL לתוך 500 1 פרט בקבוקוני פלסטיק מיליליטר בעזרת פיפטה מהדר.
  3. לייבש בריק במהירות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 20 μL של 20% pluronic ב DMSO בקבוקון פלסטיק עם 10 מיקרוגרם של צבע מיובש.
  5. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
  6. מעבירים את תערובת המכילה DMSO עם pluronic וצבע מבקבוקון פלסטיק גליל סיימה (10 מ"ל). הוסף פתרון Tyrode על VO סופיlume של 5 מ"ל.
  7. Sonicate במשך 20-25 דקות בתוך sonicator אמבטיה.
  8. Perfuse ללב למשך 30 דקות באמצעות משאבות פריסטלטיות. עיין בהוראות בשלבים בסעיף 3.5.

6. הקלטת איתותי Epicardial

  1. לאחר טעינת הצבע, רטרו-perfuse את הלב עם פתרון Tyrode על ידי הסרת המהדק מעל הסעפת. פתח את השסתום ממוקם בסדרה עם 60 המזרק מ"ל המכיל פתרון Tyrode. פתרון רטרו-Perfuse Tyrode במשך 10 דקות כדי לייצב את הלב.
  2. ממלא את החדר האופקי עם פתרון Tyrode ולהדליק את יחידת פלטייה כדי להביא את טמפרטורת האמבט עד 37 ° C.
  3. מקם את סיב אופטי על פני השטח של הלב.
    1. מניחים את סיב אופטי בתוך פיפטה 2 מ"ל ולאחר מכן צרף את פיפטה micromanipulator.
    2. השתמש micromanipulator ללחוץ על סיבים אופטיים מעט מול פני השטח של LV.
  4. מבחינה חיצונית לפסוע heaרט עם ממריץ בשליטה מחוללת גל.
    1. לתכנת את מחולל הגל לספק דופק מרובע ברוחב של 1 ms.
    2. הגדר את הממריץ להיות מסונכרנים חיצוני וחבר את הכניסה החיצונית אל מחולל הגל.
    3. לכל פלט של הממריץ, לחבר חוט עם מחט דיקור המולחם בסוף.
    4. מניחים שתי מחטי דיקור ב הקודקוד של הלב כ בנפרד 3 מ"מ אחד מהשני.
    5. רק לאחר המחטים מוקם בתוך הרקמה, להפעיל את הפלט של הממריץ על מנת למנוע התחשמלות.
  5. ב תוכנת הרכישה, להתאים תדירות רכישה עד 10 קילוהרץ.

7. הקלטת איתותי Endocardial

  1. עיין צעד 6.1 ו -6.2 לייצב את הלב לאחר טעינת הצבע.
  2. באמצעות נקודת 23Ga חדה בערך בגודל של סיבים אופטיים, לעשות חור קטן על פני השטח של הלב LV ליד מחצה.
  3. צב מתאם sclerotomy ניתוח intravitreal לסייע במיצוב הסיבים האופטיים הראשון לתוך endocardium באמצעות micromanipulator.
  4. מבחינה חיצונית קצב הלב. עיין לשלב 6.4.
  5. בשנת תוכנת רכישה, להתאים תדירות רכישה עד 10 קילוהרץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AP ו Ca 2 + ארעי ב endocardium ו epicardium

על מנת להשוות אותות ברחבי קיר החדר, סיב אופטי אחד ממוקם ב endocardium ואת האחרים epicardium. השוואת המורפולוגיה של AP שנרשם בגין endocardium עם אחד מן epicardium היא הדרך הטובה ביותר להעריך את תפקוד transmural. הקיר חדרית מאוד הטרוגנית ולכן, את המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה הוא מרוכז בתיאור טכניקות קרינה בשדה מקומית יש להעריך את הפונקציה של myocytes לב vivo לשעבר. המחקר של תאים אלה בסביבת מצמידים הוא לא רק יותר פיסיולוגי, אך הוא גם מאוד מתאים לבחון פתולוגיות איבר-רמה. האירועים הסלולר הבסיסיים צימוד עירור-התכווצות (ECC) ניתן להעריך ברמת האיבר השלמה עם שימוש בדיקות מולקולריות המנטרים 2+ דינמיקת Ca תאית (Rhod 2 cytosolic Ca 2 +, מג-Fluo4 SR Ca 2 +) ו פעילות חשמלית (di-8-ANEPPS). כאן, הצגנו שלוש טכניקות L...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר אלישיה Mattiazzi לדיון ביקורתי של העבודה הציגה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NIH (R01 HL-084,487) כדי ALE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריסיגמא7647-14-5
D-(+)-גלוקוזסיגמא50-99-7
אשלגן כלוריסיגמא7447-40-7
HEPESסיגמא7365-45-9
נתרן פוספטסיגמא10049-21-5
תמיסת סידן כלורידסיגמא10043-52-4
תמיסת מגנזיום כלורידSigma7786-30-3
נתרן הידרוקסידSigmaS-8045
0.2 μ m מסנן קרום ניילוןWhatman7402-004
סעפת MPPוורנר64-0216 
21G1.5 מחט גלישה מדויקתB-D305167
חוט משי קלוע שחור (תפר כירורגי שאינו נספג)AllMech TechLOOK-SP105
הזרקת נתרן הפרין 1000USP/mLAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779סיגמא67-68-5
בלביסטטיןסיגמא856925-71-8
Pluronic F-127 תמיסה 20%Biotium59004
Materflex C/L משאבה פריסטלטיתCole-Parmer77122-26
ממריץ איזוסטיםמכשירים דיוק עולמייםA320RC
מחולל צורות גלTeledyne LecroyWaveStation 2012
מנקה אולטרסאונד FS20פישר סיינטיפיק1533530
צינורות טיגון מזהה: 1/32 אינץ' OD: 3/32 אינץ' קיר 1/32 אינץ'אספקת רכיביםTET-031A
צינורות טיגון מזהה: 3/32 אינץ' OD: 5/32 אינץ' קיר 1/32 אינץ'אספקת רכיביםTET-094A
מתאם מנעול לואר לשסתום תלת כיווניCole-ParmerEW-31200-80
מתאמי טי ואביזרי פלסטיקCole-Parmer6365-90
מהדק פלסטיקWaterZoo2465
PeltierTE TechnologyTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
מחטי דיקורLHASATC1.20x13
מזרק BD 60 מ"ל עם luer-lokפישר סיינטיפיק14-820-11
LabViewNational Instruments
ואקום מהירות Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
מעגל עיבוד אותות דיגיטלי DSP TMS 320Texas Instrument
Longpass מראה דיכרואית 567 ננומטרThorLabsDMLP567L
מטרה 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard ObjectiveEdmund OpticsStock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard ObjectiveEdmund OpticsStock# 33-438
Longpass מסנן זכוכית צבעונית 590 nm ThorLabsFGL590
לייזר ירוק Nd-YAG 532 ננומטר, 500 mW
מיקרומניפולטור ללייזרSiskiyouMX130R
סיבים אופטיים מולטימוד 200 ומיקרו; m NA 0.39ThorLabsFT200UMT
נוריות LED כחולותLumiledsL135-B475003500000
נוריות ירוקותLumiledsL135-G525003500000
מפצל קרן קובייה, לא מקטבThorLabsBS007
36 אינץ' אורך, מסילה אופטית DovetailEdmund Optics54-402
2.5 אינץ' רוחב, מנשא זנב יוניםEdmund Optics54-404
0.75 אינץ' נסיעה, שלב מיקרומטרEdmund Optics37-983
מסילה אופטית Dovetail 3 אינץ'ThorLabsRLA075/M
מנשא מסילות Dovetail 1 אינץ'ThorLabsRC1
מפולת פוטודיודה Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
מחזיק מטרה XY Translator& נ.ב.פ;ThorLabsST1XY-S
לוח לחם אלומיניום 6 אינץ' x 6 אינץ'ThorLabsMB6
Nexus שולחן אוטופיק 4' x 6'ThorLabsT46HK
ברגי כובע נירוסטהThorLabsHW-KIT5/M
אקריליק  גיליוןהום דיפו/Lowes
Sylgard ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corningסילגארד 184
אפוקסי ג'ל Walmart / Home Depot2 חלקים 5 דקות clr 1oz
21G1.5 מחט גלישה מדויקתBD305167
23G מחט גלישה מדויקתBD305145
בסיס הרכבה, 25 מ"מ x 75 מ"מ x 10 מ"מThorLabsBA1 / M
עמודי מדף תיל 36 אינץ'AleraAALESW59PO36SR
מדפי תילAleraALESW582424SR
מהדק פוסט וזוויתThorLabsSWC/M-P5
מזרק זכוכית לתא צבעWheatonW851020
פקק גומימדע ביתייםCE-STOP01C
כלי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
  2. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
  3. Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
  4. Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
  5. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
  6. Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
  8. Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
  9. Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
  10. Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
  11. Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
  12. Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
  13. Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
  14. Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
  15. Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
  16. Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
  17. Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
  18. Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
  19. Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
  20. Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
  21. Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
  22. Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
  23. Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
  24. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
  25. Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LFFMLFFMPLEDFM

מאמרים קשורים