Method Article

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים מועדים לשינויים במחזור התא, כגון אנדורדופליקציה (סבבים מתמשכים של סינתזת DNA ללא קריוקינזיס וציטוקינזיס) ומיטוזה ציטוקינטית (קריוקינזיס אך ללא ציטוקינזיס). שינויים לא טיפוסיים כאלה במחזור התא מביאים לתאים פוליפלואידים ורב-גרעיניים ולא לחלוקת תאים. לכן, כדי לקבוע את תחלופת הלב והתחדשותו, יש חשיבות מכרעת לזיהוי נכון של גרעיני קרדיומיוציטים, מספר הגרעינים לתא ומצב מחזור התא שלהם. זה נכון במיוחד לשימוש בסמנים גרעיניים לזיהוי פעילות מחזור התא, כגון אנלוגים של תימידין Ki-67, PCNA או pHH3. כאן אנו מציגים שיטות לזיהוי קרדיומיוציטים וגרעיניותם ולקביעת פעילות מחזור התא שלהם. אנו משתמשים בשתי מערכות טרנסגניות שפורסמו: קו העכברים הטרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, וקו העכבר CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לווריאציות של מחזור התא. בשילוב יחד, שתי המערכות הללו מקלות על חקר התחדשות הלב והפלסטיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי הנכון של גרעיני cardiomyocyte ומעמד מחזור התא הוא בעל חשיבות מכרעת לקביעה ממחזור שריר לב והתחדשות. זה נכון במיוחד עבור שימוש סמנים גרעיניים, כגון pHH3, Ki-67, או אנלוגים תימידין, לזיהוי פעילות מחזור התא. כמו יכולת השגשוג של cardiomyocytes היונק בוגרים הוא קטן מאוד 1, זיהוי שווא של גרעין חיובי עבור סמן הפצת גרעין cardiomyocyte יכול לעשות הבדל מכריע התוצאה של assay התפשטות. יתר על כן, cardiomyocytes נוטה וריאציות של מחזור התא, כגון endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic, אשר תוצאת תאי polyploid ו multinucleated ולא חלוקת תא. לשם כך, הפירוש של מכתים נוגדן כנגד סמני מחזור התא משותפים הוא לא מכריע בכל ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים של פרוטוקול זה של בעלי-חיים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של אוניברסיטת בון ומילוי כל התחייבויותיו לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / האיחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות.

1. במבחנה ויזואליזציה של פעילות מחזור התא ב אחרי לידה cardiomyocytes

  1. דיסוציאציה cardiomyocyte אחרי לידה
    1. תכשירי קדם-ניסיוני

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על מנת לנתח את ההשפעות של miRNAs siRNAs / על פעילות מחזור התא של cardiomyocytes לאחר הלידה במבחנה, cardiomyocytes של עכברים פעמיים מהונדס Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin בודדו על יום לאחר הלידה 3 (P3) ו טרנספקציה עם פעילות וישכנע מחזור התא miR199 5, p27 siRNA, ו siRNA Fzr1. לעומת שליטה שלילית (איור 1 א), את התמונות של miR199- (איור 1B) ו p27- siRNA (תרשים 1C) transf.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנה מחלוקת בשאלה האם cardiomyocytes מסוגלים להזין את מחזור התא ולחלק לאחר פציעה ובמהלך הומאוסטזיס רקמות. הערכים של המחזור הבסיסי של cardiomyocytes ניתנו בטווח שבין 1% 1 ו -80% 7. גם לאחר נגע לב, האינדוקציה של פעילות תא מחזור וההדור של cardiomyocytes החדש דווחה באזור הגבול, עם ערכים בין 0.0083% 8 ו 25 - 40% 7. פערים אלה יכולים להיות מוסברים בחלקה על ידי גישות ניסוייות שונות לזיהוי גרעינ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לס' גרינברג (בון, גרמניה) ולפ' פרייטג (בון, גרמניה) על עזרתם הטכנית.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת פטרי 10 ס"מSarstedt821472
100 ומיקרו; מסננת תאים mBecton Dickinson GmbH / Falcon352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ צינורית הזרקה, StericanBraun, Melsungen4657519
20 מד מחטBecton Dickinson GmbH301300
24 בארותצלחות Becton Dickinson GmbH / Falcon353047
2-מתיל-בוטאןCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
תמיסת פורמלדהיד 37%AppliChem GmbH A0936,1000
עצירה תלת-כיווניתב. בראון מדיקל בע"ממזרק 16494C
50 מ"לב. בראון מדיקל בע"מ8728810F
70% אתנולOtto Fischar GmbH27669
נוגדן משני מצומד Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
אלפא-אקטינין EA-53, עכבר IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 ובכן, חצי שטחגריינר ביו-אחד675986
קולגנז Bרוש11088815001
מיקרוסקופ קונפוקלי Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
donkey serumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate BufferedSaline Sigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
סרום עגל עובריPromoCell,
(4%)PanReac AppliChemA3697
ג'לטין מעור חזיר, סוג ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
כיסויי זכוכיתVWR631-0146
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7021
צינור הארכה היידלברגרIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
הפרין-נטריוםרציופארם5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
שקופיות מיקרוסקופ היסטובונדMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
מזרק אינסוליןBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
סריקת לייזר Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mouse IgG Cy5 (חמור)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
צינור מיקרוצנטריפוגהSarstedt72690
מיני שייקרVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pאמביון / תרמו פישר 4464066
ביופסיה עובשSakura Finetek / VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
שלילי בקרה (RNA מקושקש)אמביון/תרמו פישר סיינטיפיקAM4611
ערכת דיסוציאציה של לב ילודיםMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü
חומצות אמינו לא חיוניותGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, סרום מופחתבינוני Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
פניצילין/סטרפטומיציןGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
מדיום הרכבה אלכוהול פוליוויניל עם DABCO®, אנטי-דהייהSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
מיכלים לדוגמאVitlab80731
פיפטה סרולוגיתגריינר607180
תוכנה NIS אלמנטיםניקון
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה פינטק / VWR25608-930
ToPro3 יודיד (642/661)מולקולרי בדיקות / ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
נבט חיטה אגלוטינין (WGA) פלואורסצאין עם תוויתVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&אלפא;-נוגדן אקטיניןסיגמא-אולדריץ'A7811
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ', שטיינהייםM3148
תמיסת פורמלדהיד היידלברג sseldorf של סלדורף, NEAA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiomyocyte NucleiCell Cycle ActivityH2B mCherry TransgenicEGFP Analin SignalsConfocal Video MicroscopyHeart Tissue DigestionNuclearity DeterminationEndoreduplication DetectionMitosis VisualizationCardiac Regeneration

Related Articles