הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55204

⸱

24 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

תקציר

קרדיומיוציטים מועדים לשינויים במחזור התא, כגון אנדורדופליקציה (סבבים מתמשכים של סינתזת DNA ללא קריוקינזיס וציטוקינזיס) ומיטוזה ציטוקינטית (קריוקינזיס אך ללא ציטוקינזיס). שינויים לא טיפוסיים כאלה במחזור התא מביאים לתאים פוליפלואידים ורב-גרעיניים ולא לחלוקת תאים. לכן, כדי לקבוע את תחלופת הלב והתחדשותו, יש חשיבות מכרעת לזיהוי נכון של גרעיני קרדיומיוציטים, מספר הגרעינים לתא ומצב מחזור התא שלהם. זה נכון במיוחד לשימוש בסמנים גרעיניים לזיהוי פעילות מחזור התא, כגון אנלוגים של תימידין Ki-67, PCNA או pHH3. כאן אנו מציגים שיטות לזיהוי קרדיומיוציטים וגרעיניותם ולקביעת פעילות מחזור התא שלהם. אנו משתמשים בשתי מערכות טרנסגניות שפורסמו: קו העכברים הטרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, וקו העכבר CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לווריאציות של מחזור התא. בשילוב יחד, שתי המערכות הללו מקלות על חקר התחדשות הלב והפלסטיות.

מבוא

זיהוי הנכון של גרעיני cardiomyocyte ומעמד מחזור התא הוא בעל חשיבות מכרעת לקביעה ממחזור שריר לב והתחדשות. זה נכון במיוחד עבור שימוש סמנים גרעיניים, כגון pHH3, Ki-67, או אנלוגים תימידין, לזיהוי פעילות מחזור התא. כמו יכולת השגשוג של cardiomyocytes היונק בוגרים הוא קטן מאוד 1, זיהוי שווא של גרעין חיובי עבור סמן הפצת גרעין cardiomyocyte יכול לעשות הבדל מכריע התוצאה של assay התפשטות. יתר על כן, cardiomyocytes נוטה וריאציות של מחזור התא, כגון endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic, אשר תוצאת תאי polyploid ו multinucleated ולא חלוקת תא. לשם כך, הפירוש של מכתים נוגדן כנגד סמני מחזור התא משותפים הוא לא מכריע בכל המקרים.

כאן, אנו מציגים שיטות הישר forwa הכרה rd של cardiomyocytes עכבר nuclearity שלהם בתאים יליד מבודד וקטעי רקמה עבה שלבי הלידה ומבוגרים על ידי זיהוי חד-משמעי של הגרעינים שלהם. לצורך כך, קו עכבר מהונדס עם ביטוי cardiomyocyte הספציפי של חלבון היתוך מורכב H2B היסטון אדם mCherry תחת השליטה של אמרגן Myh6 (Myh6-H2B-MCH) שמש 2. הכלאות קו העכבר הזה עם קו עכבר מחוון התפשטות מהונדס, שבו הביטוי של חלבון היתוך eGFP-anillin הוא תחת השליטה של ​​האמרגן יקטין עוף בכל המקום עם משפר CMV (CAG-eGFP-anillin), מאפשר בקביעת סטטוס מחזור התא. Anillin פיגומי החלבון מתבטא במיוחד בתאים פעילים-מחזור תא 3, ולוקליזציה subcellular ההפרש שלה במהלך מחזור התא מאפשרת התקדמות מחזור התא חי-מעקב עם רזולוציה גבוהה של M-שלבEF "> 4. לכן, העכברים המהונדסים הכפולים יכולים לשמש כדי להיפלות בין cardiomyocytes מתרבה ואלה עוברים וריאציות מחזור התא. זה מוכיח שימושי במיוחד הקרנה לגילוי חומרי התרמת התפשטות במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים של פרוטוקול זה של בעלי-חיים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של אוניברסיטת בון ומילוי כל התחייבויותיו לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / האיחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות.

1. במבחנה ויזואליזציה של פעילות מחזור התא ב אחרי לידה cardiomyocytes

  1. דיסוציאציה cardiomyocyte אחרי לידה
    1. תכשירי קדם-ניסיוני
      1. כן תקשורת ותרבות (IMDM, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1% β-mercaptoethanol); בינוני 1: להוסיף FCS 2%; בינוני 2: להוסיף FCS ל -20%.
      2. מעיל צלחת תרבות 96-היטב (אזור חצי-צמיחה: 15 מ"מ 2) עם ג'לטין 0.1% בפתרון PBS.
    2. לנתיחת לב
      1. הכינו צלחת פטרי עם 15 מ"ל של PBS ולאחסן אותו על הקרח. לעקר שני פינצטה ומספריים קטנים על ידי לשים אותם מעקר חרוז זכוכית יבש.
      2. קורבן עכברים מהונדסים בילוד (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) על ידי עריפת ראש. פתח את בית החזה, לנתח את הלב החוצה, כמתואר אל Ehler et. 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50,154 doi: 10.3791 / 50,154), ולהעביר אותו אל PBS קר כקרח. על מנת להעביר את העכבר הבא.
      3. אם אתה משתמש זוגות רבייה שאינם הומוזיגוטים, לזהות את ליבם מהונדס באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכניסים את הלב ב PBS תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדוק ביטוי eGFP-anillin (אקס .: 488 ננומטר; Em .: 509 ננומטר) וביטוי H2B-MCH (אקס .: 587 ננומטר; Em .: 610 ננומטר) עם מערכות הסינון המתאים.
    3. בידוד cardiomyocyte
      1. לנתק את הלבבות שנבחרו באמצעות ערכת דיסוציאציה לב בילוד. דגירת תמהיל האנזים 1 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כדי להשיג 1 מ"ל של תמהיל האנזים הסופי, להוסיף 945 μL של תמהיל האנזים 1 כדי 55 μL של אנזים לערבב 2.
      2. העבר עד 4 לבבות מ P1 - עכברים P3 או עד 2 לבבות מ P4 - עכברים P6 אל r 1.5 מ"לצינור eaction המכיל 1 מ"ל של תמהיל האנזים וחותכים את הלב לחתיכות קטנות עם מספריים. מעבירים את הפתרון ל -15 צינורות תגובה מ"ל.
      3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי למקסם את הקשר בין רקמות האנזימים, לשים את הצינור 15 מ"ל כמעט אופקית בחממה. מערבבים על ידי pipetting 5 - 10 פעמים למעלה ולמטה עם טפטפת של 5 מ"ל. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
      4. להוסיף 7.5 מ"ל של מדיום 2 (20% FCS) כדי לעצור את התגובה אנזים. סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. יש לשטוף את מסננת תא עם 3 מ"ל של מדיום 2.
      5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 300 × גרם במשך 15 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μL של המדיום 1; תמוגה תא דם אדום אינה נדרשת עבור ניסויים נוספים. Pipet 10 μL של ההשעיה תא אל תא ספירת תאים ולקבוע את מספר התאים.
      6. על צלחת 96-היטב: זרע 10,000 תאים לכל היטב 120 μL של המדיום 1 (2% FCS). מקוםאת התאים לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) פנה מיד transfection.
  2. Transfection של cardiomyocytes בילוד עם siRNAs או miRNAs
    1. נגב ספסל עם פתרון טיהור RNase להסיר את RNases. נקו את החומר הבא עם פתרון טיהור RNase: 10-μL, 100-μL, ו טפטפות 200 μL ותיבת קרח. aliquots המניות ההפשרה siRNA (100 מיקרומטר) על קרח.
    2. כן 2 מיקרומטר מניות עובדים של סי / miRNAs במדיום סרום מופחת (98 μL של מדיום סרום המופחת + 2 μL של siRNA 100 מיקרומטר מניות). המנייה עובדת אמורה לשמש באותו היום. הקפאה אינה מומלצת.
    3. הוסף 4 μL של המניה 2 מיקרומטר עד 6 μL של מדיום סרום מופחת לצינור התגובה 0.5 מ"ל (הסכום עבור אחד 96-היטב; סי הסופי / ריכוז מירנה 140 μL: ~ 57 ננומטר). בחר נפח מתאים עבור מספר הבארות להיות transfected עם סי מסוים / מירנה.
    4. להכין תערובת מאסטר של מגיב transfection. השתמש 10 μL (0.6 μL של מגיב transfection + 9.4 μL של מדיום בסרום מופחת) עבור כל טוב (96 בארות בסך הכל).
    5. מוסיפים את סי / מירנה לערבב לתערובת מגיב transfection. דגירה במשך 5 דקות על קרח. Pipet 20 μL לבאר כל אחד. דגירת התאים למשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להחליף את המדיום בכל טוב עם 120 μL של מדיום 1. לאחר 24 שעות או יותר, המשך קיבעון והכתים immunofluorescence.
  3. מכתים קיבוע immunofluorescence
    1. הסר בינוני לשטוף את התאים פעם עם PBS. לכסות את התאים עם פתרון פורמלדהיד 4% במשך 20 דקות. תוריד את פתרון פורמלדהיד לשטוף את התאים פעם עם PBS, ולאחר מכן לכסות אותם עם PBS לאחסון או להמשיך immunostaining.
    2. דגירה עם נוגדן ראשוני (ריכוז פי הוראות היצרן) בסרום חמור 0.2% Triton-X ו -5% עבור h 2 לפחות.אם מכתים עבור-actinin α (דילול 1: 400;-actinin אנטי-α monoclonal), כתם לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את הנוגדן הראשוני לשטוף 3 פעמים עם PBS. לדלל את הנוגדן משני Hoechst פתרון 1: 400 ו דגירה של 1 ש 'ב RT מוגן מפני אור. הסר את הנוגדן, לשטוף עם 3 פעמים PBS, ולכסות את התאים עם PBS לאחסון על 4 מעלות צלזיוס.
  4. מיקרוסקופיה וידאו Confocal
    1. שימוש במיקרוסקופ confocal לרכישת התמונה. פתח את תוכנת ההדמיה. פתח "A1plus הגדרות" וסמן את התיבות עבור CH1, CH2, ו CH3. הגדר CH1 כדי DAPI, CH2 כדי eGFP, CH3 כדי Cy3, ו CH4 כדי Cy4 ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      1. עבור כל ערוץ, לחץ על HV ולהגדיר אותו 80 באמצעות סרגל המחוון. הגדר את קיזוז ל -0 באמצעות הסורגים המחוון, ולחץ על כפתור "בית" כדי להגדיר את חריר לעמדת המוצא. הגדר את גודל סריקה 1,024 x 1,024 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      2. לחץ אופטימיזציה לפתוח"XYZ גודל Setup" חלון. בדוק "Perfect Voxel" התיבה "השלב המוצע (z)". הגדל את עוצמות הליזר עד שהתמונה אינה חשיפה חסרה ולא מחשיפת יתר.
        הערה: לדוגמה; CH1 (DAPI): 16%, CH2 (eGFP): 12%, CH3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. הגדר את הקיזוז עבור כל הערוצים לעיצוב 0.
    2. צלם תמונות באמצעות מטרת 20X (גדלת 200X). סריקת תמונה גדולה המורכבת תמונות אריח (למשל, 3 x 3).
      1. בשנת תוכנת ההדמיה, ללכת "רוכש" ובחר "סרוק תמונה גדולה" מהתפריט הנפתח. תחת "פינת" לבחור "את המיקום הנוכחי הוא בפינה השמאלית העליונה" מהתפריט הנפתח ולהגדיר "מספר שדות ב X ו- Y" עד 3 x 3. לחץ "סריקה".
  5. ניתוח תמונה
    1. הגדר את מספר הגרעינים cardiomyocyte ידי ספירת אותות-Ch H2B ומספר cardiomyocytes ידי ספירת אותות-actinin α.
      1. לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מתוך התפריט הנפתח הבא. הקישו על גרעינים עם אותות H2B-MCH, ובכך לסימון לספור אותם. לעשות את אותו הדבר עבור תאים-חיוב α-actinin כדי לקבל את מספר cardiomyocytes.
    2. הרוזן S / cardiomyocytes שלב G2 עם אותות eGFP-anillin גרעיני (eGFP-anillin + / H2BmCh + גרעינים). לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מתוך התפריט הנפתח הבא. סמן את הגרעינים עם אותות eGFP-anillin אותות H2B-MCH על ידי לחיצה עליהם.
    3. ספירת cardiomyocytes עם אותות מיטוזה ספציפי eGFP-anillin (למשל, איור 1F ו- G), כגון אותות cytoplasmatic, טבעות התכווצות, ו midbodies. לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מן pul הבאתפריט ldown. מארק cardiomyocytes עם אותות מיטוזה ספציפי eGFP-anillin (למשל, איור 1F ו- G), אותות cytoplasmatic, טבעות התכווצות, ו midbodies על ידי לחיצה עליהם.

2. קביעת נוקלאציה למבוגרים cardiomyocytes ידי Langendorff דיסוציאציה וקטעי רקמה עבה

  1. בידוד של cardiomyocytes מבוגר על ידי ניתוק Langendorff
    1. כנות לפני לנתיחת לב
      1. למלא מזרק אינסולין (מחט 30-מד) עם הפרין (20 יחידות / g משקל גוף). אחוז את העכבר על ידי בעורפו. רם ולהפוך את העכבר אחורה כדי לחשוף את הבטן להזרקה.
      2. בצע זריקה intraperitoneal. שים את העכבר heparinized בחזרה אל תוך הכלוב להמתין לפחות 15 דקות לפני תחילת לנתיחה הלב. שטפו לאוורר את המנגנון Langendorff עם 5 - 10 מ"ל של חיץ זלוף (חיץ זלוף: 135 mM NaCl, KCl 4 מ"מ, 1 מ"מ MgCl2, 2.5 מ"מ HEPES, 5 גלוקוז מ"מ, 25 מ"מ BDM DDH 2 O, להסתגל 7.4 pH עם NaOH).
    2. לנתיחת לב
      1. הכינו צלחת 10 ס"מ פטרי עם מצונן (4 ° C) PBS ומניחים אותו על קרח. מילוי לאוורר מזרק 1 מ"ל מחובר (מד 20) צינורית עם PBS. תקן צינורית עם פלסטלינה בגבול של צלחת פטרי. מניחים את קצה הצינורית מעט מתחת לפני השטח PBS.
      2. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. נגב את הבטן עם פתרון אתנול 70%. עושים חתך מהבטן באמצע אל עצם החזה עם מספריים כירורגיות. הסר את הסרעפת לחתוך את החזה בילטרלי עם מספריים כירורגיות.
      3. רם ולתקן את עצם החזה עם מחט 20-מד, לפתוח את חלל בית החזה, בעדינות לתפוס את הלב עם מלקחיים אנטומי. הרם את הלב ולהסיר אותו מריאות כלי הדם על ידי חיתוך הכלי של דרכי היצוא.
        הערה: כדי לזהות את אבי העורקים, מקם את הלב עםלמעלה בצד הגחון שלה. זה מקטין את המרחק בין שני הפרוזדורים, כך האאורטה עם ענפיו ניתן למצוא בין הפרוזדורים. בהתאם אדריכלות לב הפרט, הענפים ניתן להסיר אם הסניף הראשי של אב העורקים הוא עדיין מספיק זמן.
      4. מעבירים את הלב אל צלחת 10 ס"מ פטרי המכילות PBS מקורר (ראה שלב 2.1.2.1). Cannulate בלב ידי משיכת האאורטה עולה על צינורית הזרקת G20x1 ½, אשר נקטע על ידי כלי-רב נדנוד כדי למנוע נזק לרקמות. תקן את אב העורקים עם חוט על הצינורית. לשטוף בעדינות את הלב עם PBS להסיר דם עודף ידי דחיפת הבוכנה במזרק. לנפיחות של הלב צריכה להיות גלויה.
    3. דיסוציאציה לב Langendorff
      1. חברו את הלב cannulated במהירות למתאם מנעול Luer על מנגנון זלוף Langendorff. Perfuse הלב עם 30 מ"ל של חיץ זלוף מחומצן על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם קצב הזרימה של 1 טיפה / s. thשיעור דואר זרימה יכול להיות מותאם על ידי ויסות זרימת O 2 בתוך מנגנון Langendorff באמצעות שסתום מפחיתי לחץ (לחץ בין 0 ל 200 mbar).
      2. הכן חיץ העיכול מיד לפני השימוש: חיץ זלוף עם 6 U Collagenase B, 10,000 יחידות טריפסין, ו -50 מיקרומטר CaCl 2. הסר את חוצץ זלוף ולהתחיל את עיכול אנזימטי על ידי הוספת 30 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) ו חיץ העיכול מחומצן.
        הערה: כמות Collagenase B צריך להיות טיטרציה בהתאם לפעילות של קבוצות שונות.
      3. התאם את הזרימה לשיעור של 1 טיפה / s ולעכל את הלב במשך 10 - 13 דקות. כדי למנוע זיהום, אין להשתמש בזרימה שוב. מעבירים את הלב אל צלחת 10 ס"מ פטרי עם 5 מ"ל של חיץ העיכול. לנתח את הרקמה באופן ידני עם מלקחיים על ידי החזקת הלב עם זוג אחד של מלקחיים באמצעות הזוג האחר לקרוע את הלב לחתיכות קטנות.
        הערה: בשלב זה, הפרוזדורים ניתן להפריד, וחותכים קטניםחתיכות (עם איריס מספרית), ו מתעכלות במשך 30 דקות ב 750 μL של חיץ עיכול בחממה ב 37 מעלות על מנת להשיג תאי פרוזדורים מבודדים. כדי לקבל cardiomyocytes פרוזדורים טהור, pipet מעלה ומטה מספר פעמים בעזרת פיפטה 1 מ"ל. עצור את תגובת האנזים על ידי הוספת 750 μL של פתרון להפסיק.
      4. עצור את מערכת העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת התחנה (חיץ זלוף עם FBS 5% ו -50 מיקרומטר CaCl 2). בעזרת פיפטה סרולוגיות, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לאסוף את התאים צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. צנטריפוגה השעית התא המסוננת ב 80 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת חדר.
      5. בטל supernatant בעדינות resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של תמיסת להפסיק בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 80 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
      6. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום תרבות (IMDM עם 20% FCS, 0.1 מ"מ שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל אחד פניצילין סטרפטומיצין, ו -0.1 מ"מ β-mercaptoethanol) עבור culturing. לחילופין, המשך לשלב 2.2, "מכתים immunofluorescence," ולתקן את התאים.
      7. עבור קיבעון על 24 גם צלחות, צלחת 10,000 של תאים בודדים לכל טוב על 8 מיקרוגרם / מ"ל מצופה laminin coverslips ב 24 גם צלחות עם 500 μL של המדיום תרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפחות 3 שעות .
  2. מכתים Immunofluorescence על cardiomyocytes מבודד Langendorff בתרחיף
    1. תקן cardiomyocytes Langendorff-מבודדים 1 מ"ל של 4% PFA ב- PBS, pH 7.4, במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה השעית התא ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר, הסר את המקבע, לשטוף את התאים פעמים עם PBS.
    2. Resuspend את cardiomyocytes קבוע ב 1 מ"ל של PBS ו תעברו עם מכתים immunofluorescence או לאחסן אותם 500 μL של PBS לכל טוב עלצלחת 24 גם ב 4 ° C.. העברת חלק השעית התא (~ 100 - 200 μL) אל צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant.
    3. Permeabilize, לחסום, להכתים את התאים עם נוגדן ראשוני נגד actinin-α על ידי הוספת 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל 1: 400 ב PBS עם 0.2% Triton X-100 ו -5% בסרום חמור עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. שטפו את תא גלולה עם PBS ו צנטריפוגות ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את supernatant מדגירים 200 μL של אלקסה פלואוריד מצומדות נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG1) מדולל 1: 400 ב לצבוע Hoechst (הפתרון עובד: 1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
    5. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. חזור על שלב זה. הגנה על מדגם מן האור. Resuspend התאים ב 200 - 500 μL של PBS ו להעביר 100 - 300 μL של ההשעיה תא אל באר תא מיקרוסקופ. סגור את המכסה של החדר ולאחסן את התאים ב 4 ° C עד הדמיה. להגן מפני אור.
  3. ניתוח של nuclearity של cardiomyocytes Langendorff-מבודדים
    1. קח תמונות cardiomyocytes מוכתם α-actinin עם מטרה 25x, המקביל ל בהגדלה 250X. ספירת H2B-MCH + גרעינים רק cardiomyocytes אלה מגואלות באופן קבוע על ידי-actinin α ולהראות מורפולוגיה טיפוסית בצורת מוט ולכן הם הניחו להיות שלמים.
    2. רוזן לפחות 100 cardiomyocytes משלושה לבבות שונים. חישובים של אחוזי mononuclear, binuclear, ו cardiomyocytes trinuclear.
      הערה: בדרך כלל, תאי binuclear צריך לפצות סביב 80 - 90%, ואילו תאי trinuclear ואלה עם מספר גדול יותר של גרעינים נדירים (<1% ב cardiomyocytes Langendorff-מבודד, <3% ב פרוסות עבות). cardiomyocytes פרוזדורים הם קטנים משמעותיים cardiomyocytes חדרית. בדרך כלל, תאי mononuclear לפצות 90% מכלל האוכלוסייה.
  4. בידוד, קיבעון, cryopreservation של לבבות למבוגרים כהכנה פרוסות עבות
    1. להרכיב מנגנון זלוף עבור קיבעון על ידי חיבור מזרק 50 מ"ל כדי שסתום 3 כיווני עם צינורית הארכה Heidelberger ואת שסתום 3-הדרך השנייה. תקן את המזרק עמדה בצורה כזאת כי הזרימה דרך מופעלת על ידי כוח הכבידה. מלאו את המערכת עם 15 מ"ל של PBS.
    2. בצע את השלבים 2.1.2.1-2.1.2.4, "הכנת הלב." חבר את צינורית הזרקת G20x1 ½ עם הלב אל מתאם מנעול Luer של מנגנון זלוף מלא בועה נטולת-PBS ו perfuse זה עם PBS. מלאו את המערכת עם 10 - 15 מ"ל של פורמלדהיד 4% ב- ​​PBS, אשר perfused אז דרך הלב. טבילה לתקן את הלב בתמיסת פורמלדהיד 4% בין לילה.
    3. החזר את פורמלדהיד 4%פתרון עם PBS ולשטוף את הלב ב PBS על שייקר אופקי ב 150 סל"ד במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר. להחליף את PBS עם 20% תמיסת סוכרוז כדי לייבש את לב הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. להקפיא את הלב במדיום הטבעה-קריו בתוך תבנית קטנה.
      1. הגדרת כוס המלאה 2-methylbutane ומניח אותו בתוך קופסא עם קרח יבש. שים לב לתבנית הקפאה בעבר חצי מלאים בינוני הטבעה קריו ולכסות אותו לחלוטין עם קריו הטבעה בינוני. בזהירות את התבנית לתוך המבחנה הקרה, מניעת קשר של מדיום ההטבעה-קריו עם 2-methylbutane. אחסן את הרקמה הקפואה ב -80 ° C עד השימוש.
  5. הכנת פרוסות לב עבות
    1. השתמש ההתקנה הבאה בתוך cryotome: טמפרטורת מושא -18 ל -20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת לשכת -21 ל -23 מעלות צלזיוס, זווית סליקה על בעל הסכין של 4 מעלות, ולהבי microtome R35 הנוצה.
    2. קח את o cryopreservedrgan ממכל ההקפאה ולתקן אותה על דיסק הדגימה עם מדיום ההטבעה-קריו באמצעות מדף ההקפאה המהיר. מקם את הלב בצורה כזאת כי חתך מתחיל בשיא.
    3. חתוך משם פרוס 50 מיקרומטר עד מטוס חיתוך אפילו מושגת והאיבר הופך לגלוי. חותכים פרוסות הרקמה 50 מיקרומטר באמצעות cryotome במצב ידני עם מהירות איטית ועם צלחת אנטי רול להציב על הסכין. פרוסות הר בשקופיות מיקרוסקופ שטופלו מלוחים. תנו פרוסות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחסן את השקופיות ב -80 ° C או כתם ישירות.
  6. הכתמה של פרוסות לב עבות (גרעינים ואת קרום תא)
    1. פנקו את פרוסות הלב עם RNAse A (20 מיקרוגרם / מ"ל) ב חיץ כביסה (0.5 M NaCl, 0.1 M טריס pH 7.5, ו -50 מ"מ EDTA) ב קובט של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס. דגירה הפרוסה-X טריטון 0.2% חיץ כביסה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. פעמים לשטוף את הפרוסות במשך 5 דקות כל אחד כביסת חיץ קובט עלשייקר אופקי בטמפרטורת החדר.
    2. הכתם לילה עם 1 מיקרומטר TO-PRO3 יודיד (642/661) ו agglutinin נבט חיטה מצמידים והעמסת (WGA, 1: 100) במאגר כביסה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם חיץ כביסה ב cuvettes על שייקר אופקי ומכסים אותם עם הרכבה בינונית אלכוהול פוליוויניל עם מגיב נגד דהייה ו coverslip זכוכית.
  7. רכישת תמונה
    1. באופן אידיאלי, משתמשים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוכה מצויד מטרה 40X / 1.15 NA מים טבילה. חיפוש לפי עין עבור שטח בתוך הפרוסה שמורכבת cardiomyocytes המרופדת longitudinally; למטרה זו, בערוץ וההעמסה-WGA (488 ננומטר .: אקס) הוא מתאים ביותר.
      הערה: שלב זה הוא הכרחי, כמו הגבולות העליונים ותחתונים של cardiomyocytes צריכים להיות גלויים בתוך Z- המחסנית עבור ניתוחים מאוחר יותר. ככל עומק הדמיה מוגבל ~ 30 ננומטר ואת עובי של הפרוסה הוא 50 מיקרומטר, זה לא ניתן imחתכי גיל של תאים אלה (אורך תא: ~ 120 מיקרומטר).
    2. התאם את ההגדרה בתוכנת ההדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה. הגדרות A1plus להרחיב וסמן את התיבות עבור CH2, CH3, ו CH4. הגדר CH2 כדי egfp, CH3 כדי Alx546, ו CH4 כדי Alx647 ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      1. עבור כל ערוץ, לחץ על HV ולהגדיר אותו 80 באמצעות סרגל המחוון. הגדר את הקיזוז ל -0 באמצעות סורגי המחוון. לחץ על כפתור "בית" כדי להגדיר את חריר לעמדת המוצא. הגדר את גודל סריקה 1,024 x 1,024 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח ולחץ לייעל כדי לפתוח את החלון "XYZ גודל Setup". סמן את התיבה "Perfect Voxel" תחת "שלב שהוצע (z)".
    3. לחץ על "סריקה בזמן אמת" ולהתאים את עוצמות לייזר על ידי לחיצה על הסורגים המחוון על ערוצים בודדים. סמן את התיבה "סדרת Z" על החלון "ND הרכישה" ולחץ על "שהוגדר על ידי כפתור העליון" התיבה. גדר העליונהכפתור של Z- מחסנית על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים לאחר התאמת המוקד על המיקרוסקופ. הגדר את רוחב z-צעד ל -0.5 מיקרומטר.
      הערה: עומק Z- המחסנית מוגבלת על ידי החדירה האופטית בתוך הרקמה ואת יחס אות לרעש.
    4. יש להקליק על "A1plus הגדרות" ולהגדיר את הקו ממוצע / Integral 2-4 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח. מכווננים את עוצמות לייזר; החריר צריך להיות קטן ככל האפשר על מנת תמונת מטוס מוקד.
  8. ניתוח של התגרענות
    1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ואת לטעון את Z- מחסנית של עניין.
    2. ידני לקבוע התגרענות בין המדפים-z ידי גלילת השכבות השונות של המחסנית כדי לזהות תאים המצויים לחלוטין בתוך הערימה; זה המקרה כאשר מכתים WGA גלוי בכל הממדים. ספירת הגרעינים (רובם יהיה binuclear) ולסמן את התא נותח על ידי ביאור בתוכנה.
    3. לקבוע את מספר גרעיני CM (H2B-MCH +) גרעינים כוללים (TO-PRO3 +) ב שחזורי 3D עבור הערוצים הבודדים (איור 2 ד). בשנת תוכנת ההדמיה, לחץ על "בינארי" ולבחור "גדר 3D סף" מהתפריט הנפתח. בחר מתוך התפריט הנפתח ערוץ או Alx546 עבור במספר הגרעינים CM או Alx647 עבור במספר הגרעינים הכולל. על ידי לחיצה על החצים המתאימים, להגדיר את התכנית "4x החלק", 1x הנקי, ומלא חורים. סמן את התיבה "גודל" ולהגדיר אותו 5 מיקרומטר באמצעות סרגל המחוון. הגדר את הסף באמצעות סרגל המחוון עד מופיעים אובייקטים נפרדים.
      הערה: לאחר החל את הפיצול, את חלון התוצאות מראה טבלה של אירועים לכמת פיצול בצבע של התמונה. כמו גרעינים כמה קשר זה לזה באופן ישיר, באופן ידני לתקן את תוצאת המדידה האוטומטית עבור כפילויות, אשר עשויים שלא להיות מופרדת כראוי על ידי התוכנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על מנת לנתח את ההשפעות של miRNAs siRNAs / על פעילות מחזור התא של cardiomyocytes לאחר הלידה במבחנה, cardiomyocytes של עכברים פעמיים מהונדס Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin בודדו על יום לאחר הלידה 3 (P3) ו טרנספקציה עם פעילות וישכנע מחזור התא miR199 5, p27 siRNA, ו siRNA Fzr1. לעומת שליטה שלילית (איור 1 א), את התמונות של miR199- (איור 1B) ו p27- siRNA (תרשים 1C) transf...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנה מחלוקת בשאלה האם cardiomyocytes מסוגלים להזין את מחזור התא ולחלק לאחר פציעה ובמהלך הומאוסטזיס רקמות. הערכים של המחזור הבסיסי של cardiomyocytes ניתנו בטווח שבין 1% 1 ו -80% 7. גם לאחר נגע לב, האינדוקציה של פעילות תא מחזור וההדור של cardiomyocytes החדש דווחה באזור הגבול, עם ערכים בין 0.0083% 8 ו 25 - 40% 7. פערים אלה יכולים להיות מוסברים בחלקה על ידי גישות ניסוייות שונות לזיהוי גרעינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים לס' גרינברג (בון, גרמניה) ולפ' פרייטג (בון, גרמניה) על עזרתם הטכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטרי 10 ס"מSarstedt821472
100 ומיקרו; מסננת תאים mBecton Dickinson GmbH / Falcon352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ צינורית הזרקה, StericanBraun, Melsungen4657519
20 מד מחטBecton Dickinson GmbH301300
24 בארותצלחות Becton Dickinson GmbH / Falcon353047
2-מתיל-בוטאןCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
תמיסת פורמלדהיד 37%AppliChem GmbH A0936,1000
עצירה תלת-כיווניתב. בראון מדיקל בע"ממזרק 16494C
50 מ"לב. בראון מדיקל בע"מ8728810F
70% אתנולOtto Fischar GmbH27669
נוגדן משני מצומד Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
אלפא-אקטינין EA-53, עכבר IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 ובכן, חצי שטחגריינר ביו-אחד675986
קולגנז Bרוש11088815001
מיקרוסקופ קונפוקלי Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
donkey serumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate BufferedSaline Sigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
סרום עגל עובריPromoCell,
(4%)PanReac AppliChemA3697
ג'לטין מעור חזיר, סוג ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
כיסויי זכוכיתVWR631-0146
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7021
צינור הארכה היידלברגרIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
הפרין-נטריוםרציופארם5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
שקופיות מיקרוסקופ היסטובונדMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
מזרק אינסוליןBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiedDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
סריקת לייזר Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mouse IgG Cy5 (חמור)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
צינור מיקרוצנטריפוגהSarstedt72690
מיני שייקרVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pאמביון / תרמו פישר 4464066
ביופסיה עובשSakura Finetek / VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
שלילי בקרה (RNA מקושקש)אמביון/תרמו פישר סיינטיפיקAM4611
ערכת דיסוציאציה של לב ילודיםMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü
חומצות אמינו לא חיוניותGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, סרום מופחתבינוני Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
פניצילין/סטרפטומיציןGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
מדיום הרכבה אלכוהול פוליוויניל עם DABCO®, אנטי-דהייהSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
מיכלים לדוגמאVitlab80731
פיפטה סרולוגיתגריינר607180
תוכנה NIS אלמנטיםניקון
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה פינטק / VWR25608-930
ToPro3 יודיד (642/661)מולקולרי בדיקות / ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
נבט חיטה אגלוטינין (WGA) פלואורסצאין עם תוויתVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&אלפא;-נוגדן אקטיניןסיגמא-אולדריץ'A7811
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ', שטיינהייםM3148
תמיסת פורמלדהיד היידלברג sseldorf של סלדורף, NEAA

מקורות

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076(2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גרעיני תאי שריר לבפעילות מחזור התאטרנסגני H2B-mCherryאותי EGFP Analinמיקרוסקופיית וידאו קונפוקליתעיכול רקמת לבקביעת רמת פלואידיותזיהוי אנדורפליקציהויזואליזציה של מיטוזהרגנרציה של הלב
ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.