שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

סיכום

מתודולוגיית דגימה מבוססת קצף מאקרו פותחה והוערכה לאיתור וכימות של נורו-וירוס על משטחים קשים סביבתיים.

תקציר

noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס ספורדי ברחבי העולם. מכיוון שרוב הזיהומים או מופצים ישירות דרך המסלול של אדם אל אדם או בעקיפין באמצעות משטחים סביבתיים או מזון, fomites מזוהם ומשטחים דוממים הם כלים חשובים עבור התפשטות הנגיף במהלך התפרצויות norovirus.

פיתחנו ומוערכת פרוטוקול באמצעות מטליות macrofoam לאיתור והקלדה של noroviruses האדם מן משטחים קשים. בהשוואה מטליות שקצהו סיבים או מגבונים אנטי-סטטי, מטליות macrofoam לאפשר התאוששות וירוס (טווח 1.2-33.6%) ממשטחים מושב האסלה של עד 700 ס"מ ^2. הפרוטוקול כולל שלבים עבור החילוץ של הנגיף מן המטליות וריכוז נוסף של רנ"א הנגיפי באמצעות עמודות ספין. בסך הכל, 127 (58.5%) של 217 דגימות ספוגיות שנאספו ממשטחים באוניות שיוט ומתקני סיעודים שבו גסטרואנטריטיס norovirus היהדיווח נדבקה norovirus GII ידי RT-qPCR. 29 אלה (22.8%) ניתן genotyped בהצלחה. לסיכום, איתור של norovirus על משטחים סביבתיים באמצעות הפרוטוקול שפתחנו עשויה לסייע בקביעת רמת הזיהום סביבתי במהלך התפרצויות, כמו גם זיהוי של וירוס כאשר דגימות קליניות אינן זמינות; היא עשויה גם להקל על ניטור של יעילות של אסטרטגיות משיקום.

מבוא

Noroviruses אדם הם גורם מוביל של מגיפת גסטרואנטריטיס החריפה ספורדית ^{1 בעולם, 2, 3.} הווירוס הוא מאוד מדבק עוברים מאדם לאדם באמצעות אדם ישיר אינטראקצית אדם או בעקיפין באמצעות מגע עם מזון מזוהם, מים או משטחים סביבתיים. Noroviruses ניתן לשפוך לפארקים וממושכת הישרדות של הנגיף על משטחים סביבתיים תועדה ^{1, 2, 3.} במהלך שפיכת שיא, מיליארדים של חלקיקי נגיף משתחררים לגרם של צואה, וקיא מכיל גם מספר מספיק של חלקיקים נגיפיים כדי לגרום לזיהום ^{4, 5, 6, 7, 8,}EF "> ^{9, 10.} בנוסף, העברת הנגיף בין משטחים דוממים עור אנושי יכולה להתרחש ^{2 בקלות, 11, 12.} לפיכך, ניטור של זיהום סביבתי עשוי לסייע בחקירה פרוצה ו בהערכת היעילות של למעלה נקי נהלי חיטוי.

מספר פרוטוקולי דגימה סביבתיים תוארו לצורך זיהוי של רוטה-וירוס, coliphage MS2, calicivirus חתולים (FCV), ואת בקטריופאג P22 ^{13, 14, 15, 16.} עם זאת, תנאי האימות תארו במחקרים אלה, לרבות התייבשות מהירה (<1 שעה) ואת שטח פנים קטן (25 x 100 סנטימטרים ^2), לא יכולים לייצג הגדרות שדות כראוי. בנוסף, צפוי זיהום ברמות נמוכות של סביבתימשטחי nmental דורשים פרוטוקולים מסוגלים לזהות חלקיקי נגיף מעט מאוד.

פתחנו שיטת דגימת משטח מבוסס macrofoam לאיתור וההקלדה של norovirus. שיטה זו תאומת במהלך פרצתי מספר פעמים norovirus. הפרוטוקול כולל 1) איך לאסוף דגימות ספוגית ממשטחים הסביבה (2) מהי הדרך הטובה ביותר כדי לשמור על שלמות של דגימות במהלך איסוף ומשלוח למעבדה, ו -3) בדיקות מעבדה והקלדה של norovirus.

פרוטוקול

1. הדגימה ספוגית בתחום

1. לבש זוג נקי של כפפות.
2. מדוד את גודל שטח הדגימה בלי לגעת פני השטח באמצעות קלטת או שליט מדידה. נסו להעריך את האזור בצורה מדויקת ככל האפשר ולמלא טופס דיווח (לוח משלימה 1).
3. בדוק את הערכה הספוגית עבור דליפות אפשריות ושקיות תחבורת תווית מדגם וערכות ספוגיות.
4. הזז את הספוגית על פני שטח הדגימה כדלקמן: במכה אחת בכיוון אופקי, במכה אחת בכיוון אנכי, ושבץ אחד בכיוון אלכסוני. אל ספוגית שטח פנים גדול יותר מ -700 ס"מ ^2.
5. מניח כל ספוגית לתוך צינור ו להדק את המכסה מאובטח.

אחסון 2. ותחבורה של מטליות אל המעבדה

1. שמור מטליות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות. אם אחסון לפרקי זמן ארוכים יותר נדרש, לאחסן את המטליות ב -20 ° C (או -70 ° C).
2. שמור את הצינורות ב C 0-4 מעלות (כלומר. , להשתמש חבילות קרות) במכל מבודד במהלך הובלה למעבדת הספינה בתוך 24-48 שעות של אוסף.

3. ריכוז וירוס, הפקת רנ"א נגיפי וטיהור

הערה: כל הצעדים צנטריפוגה להשתמש בצנטריפוגה בראש הטבלה ב 5000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת. מומלץ לשים לב ולהיזהר כשעובדים עם חילוץ חומצה האוניברסלי גרעין (יונקס) החיץ. תלבש משקפי מגן או מגן פנים.

1. לייבל אחד 15 מ"ל צינור ואחד טור RNA Midi עבור כל דגימה. כלול שליטת חילוץ שלילית בכל ניסוי.
2. כדי להכין את הפתרון תמוגה עבור 10 מטליות, לערבב 25 מ"ל של חיץ יונקס עם 25 מ"ל של PBST (PBS pH 7.2 המכיל 0.02% Tween-80).
3. הוסף 50 μL של ההשעיה coliphage MS2 (10 ⁶ PFU / μl) 50 מ"ל של תמיסת תמוגה.
4. מניחים ספוגית בתוך שפופרת 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל פתרון תמוגה. מערבבים דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הוסף 5 מ"ל 100% אתנול לצינור כל מערבולת עבור 10 שניות.
6. מוציא בזהירות את הספוגית מ -15 צינור המ"ל (הוא מכיל מאגר יונקס) לחיצה קלה כנגד הצד של הצינור כדי להסיר עודפי נוזלים ולאחר מכן למחוק את הספוגית. הכרכים הנותרים צריכים להיות בין 9-10 מ"ל.

4. טור Midi ויראלי גרעין הפקת חומצה

1. בזהירות להעביר 4.5 מ"ל יונקס / אתנול תערובת משלב 3.6 על בצנטריפוגה midi טור, וזורקים את תסנין.
2. טען 4.5 אחר מיליליטר מאותה התערובת על הטור, צנטריפוגות אותו, וזורק את התסנין.
3. עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 3.5 מ"ל של אתנול 70% על הטור Midi, צנטריפוגות וזורקים את תסנין.
4. עבור לשטוף את השני, להוסיף 3.5 מ"ל של אתנול 70% על הטור Midi. צנטריפוגה וזורק את התסנין.
5. עבור ספין יבש, צנטריפוגות עמודות מידי כדי להסיר כל עקבות של אתנול (אשר יכול להשפיע התאוששות רנ"א נגיפי שלך באופן שלילי).
6. מניחים את הטור Midi בתוך שפופרת צנטריפוגות 15 מ"ל חדש. הוסף 250 μl חיץ elution על הטור Midi; לחכות 1 דקות לפני צנטריפוגה להשיג התאוששות רנ"א נגיפי הגבוהה ביותר.
7. אחסן את חומצות גרעין שחולצו ב -70 ° C או להמשיך מיד לשלב 5.

ריכוז 5. ויראלי חומצות גרעין שימוש RNA נקי ערכות מרוכזות

1. הוספת 500 μL של RNA חיץ מחייב 250 μL של RNA eluted בשלב 4.7 לעיל ו מערבולת למשך 10 שניות.
2. להוסיף 750 μL 100% אתנול ו מערבולת למשך 10 שניות.
3. לייבל טור ספין עבור כל דגימה. טענתי מדגם 750 μL על טור ספין.
4. צנטריפוגה עמודות ספין XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
5. טען את 750 μL הנותרים על עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות.
6. עבור קדם שטיפה, להוסיף 400 חיץ הכנה μL RNA כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
7. עבור הכביסה הראשונה, להוסיף 800 μL RNA הצפת לשטוף כל עמודה ספין צנטריפוגות XG ב 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
8. עבור לשטוף את השני, להוסיף 400 μL RNA לשטוף הצפת לטוות עמודה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 1 דקות. מחק את הזרימה דרך.
9. עבור ספין יבש, צנטריפוגות טור ספין כדי להסיר כל עקבות של חיץ לשטוף ב XG 12,000 במשך 2 דקות.
10. להעביר בזהירות ספין עמודה צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge נקי.
11. הוסף חוצץ elution 25 μL על הטור ספין דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. זה יגביר את ההתאוששות של רנ"א נגיפי מהעמודה.
12. אסוף הרנ"א על ​​ידי צנטריפוגה העמודה ספין על XG 10,000 דקות 1.
13. כך או להמשיך ישירות RT-qPCR (שלב 6) או RNA החנות ב -70 ° C.

6. Mutiplex RT-qPCR איתור של Genogroup לי, ו- II noroviruses, ו Coliphage MS 2 (לוח משלימה 2)

1. משטחי עבודה נקיים, pipettes, צנטריפוגות עם פתרון טיהור RNase כדי להפחית את זיהום אפשרי.
2. להפשיר ריאגנטים RT-qPCR על הקרח. RNA להפשיר על הקרח (באזור / חדר נפרד).
3. לקבוע את מספר תגובות ולהוסיף לפחות 10% יותר מהם (למשל, אם 10 תגובות נדרשות, לעשות תערובת אב 11).
4. רכיבים וורטקס תערובת אמן יחיד, למעט 25x האנזים RT-qPCR עבור 5 ים. בזהירות ומערבבים האנזים על ידי מצליף את הצינור עם האצבע.
5. בקצרה מאסטר צנטריפוגות רכיבים לערבב במשך 5 s.
6. מכינים את תערובת מאסטר לאיתור בזמן אמת RT-PCR של GI norovirus ו GII בהתאם להוראות ערכת ולהוסיף פריימרים oligonucleotide ספציפי norovirus ו בדיקות צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge (לוח משלים 3).
7. מערבבים את תערובת מאסטר ידי pipetting 5-10 פעמים למעלה ולמטה (vortexing אינה מומלצת). Aliquot 22 μL של מיקס מאסטר היטב בכל צלחת 96-היטב בזמן אמת PCR.
8. RNA המדגם וורטקסבמשך 5 שניות, ולאסוף על ידי צנטריפוגה קצר (5 ימים).
9. להוסיף 3 μL של המדגם RNA ו- GI ו שולטת חיובית GII לצלחת RT-qPCR (אחרי תבנית מתוך טבלה 2). להוסיף 3 μL של nuclease-Freewater בבארות ללא תבנית שליטה (NTC).
10. חותם את הצלחת בזמן אמת עם סרט דבק אופטי.
11. בזהירות בצנטריפוגה הצלחת בזמן האמת ב -1,300 XG דקות 1 כדי להסיר בועות אוויר או טיפות נוזלות שעשויה להיות נוכח הבארות.
12. הגדרת מכשיר בזמן אמת PCR ועל הגדרת התנאים thermocycling הבאים: 1) שלב RT במשך 10 דקות. ב 45 ° C (2) הפעלת פולימראז תקי, 10 דק '. ב 95 מעלות צלזיוס ו (3) 45 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס ו -60 של ב 60 ° C.

7. כימות norovirus בדגימות ספוגית

1. בדוק את התוצאות של בקרות חיוביות ושליליות כדי לאמת תוצאות RT-qPCR (לוח משלים 3).
2. לקבוע אם כל עקומת סטנדרט עונה עלערכים מקובלים מתפרסמים בלוח משלים 2 ולחשב את סטיית ההתקן כוללת על העקומה הרגילה באמצעות משוואת 1.
   (משוואת 1)% יעילים = 100 x 10 ^{(CT ממוצע ערכים-יירוט) / סלופ.}
3. אם תוכנת Cycler תרמית PCR לא לחשב את השיפוע עבור כל עקומת סטנדרט, לקבוע מדרון R ² ערכים על ידי רגרסיה באמצעות תוכנה נתונה (למשל Excel, SPSS, או SAS). בנוסף, לחשב את יעילות% עבור עקומות סטנדרטיות הבא אני המשוואה
4. רשום את מספר עותק RNA מחושב על ידי תוכנת Cycler תרמית עבור כל דגימות הבדיקה מבוססות על עקומות סטנדרטיות העונות על הקריטריונים מפורטים בטבלה משלימה 4. שידור חוזר כל דגימות עם כובע לא עקום סטנדרטי אינו עומד בקריטריונים או יש בקרות חיוביות שגויות. בדוק ערכי ה- CT של coliphage MS2, שהתווסף בקרה פנימית לפקח עיכוב PCR.
5. לקבוע את המספר הכולל של p עותקי RNAמדגם ER ידי הכפלת מספר עותק RNA המחושב בשלב 7.2 ידי היחס בין נפח (25 עד 50 μL) של eluent RNA סך לזה של רנ"א (3 עד 5 μL) המשמש התגובה RT-qPCR. לחלופין, לחשב את צפיפות RNA על ידי חלוקת מספר עותק RNA הכולל ידי שטח הפנים אובייקט ⁽² ס"מ) ניתחו.

8. Genotyping של דוגמאות בזמן אמת RT-PCR חיובי על ידי חמי מקונן PCR קונבנציונאלי הגברה

1. מכינים את הסיבוב הראשון של תערובת אמן עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2, ו -5).
2. הוסף 5 μL של RNA חיובי norovirus עד 20 μL של תמהיל מאסטר.
3. הפעל את RT-PCR בתנאים הבאים: (1) שלב RT למשך 30 דקות ב 42 ° C (2) הפעיל פולימראז תקי, 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ו- (3) 40 מחזורים של 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס 30 s, ב 50 מעלות צלזיוס, ו -60 שניות על 72 מעלות צלזיוס. אחרי 40 מחזורים, דגירה 10 דקות נוספות ב 72 מעלות צלזיוס.
4. מכינים את הסיבוב השני של תמהיל מאטר עבור כל קבוצה פריימר של assay RT-PCR (לוחות משלים 2 ו -5).
5. להוסיף 23 μL תמהיל מאסטר ולהוסיף 2 μL של מוצרים בסיבוב הראשון RT-PCR (מ בסיבוב הראשון) על צינור אחד (רצוי המוצר בסיבוב הראשון צריך להיות מדולל 1/10 במים RNase ללא).
6. חזור על שלב 8.3.
7. הכן ג'ל agarose 2% ב 100 מ"ל 1x טריס-אצטט EDTA (40 מ"מ טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית, ו 1 mM EDTA, ב- pH 8.3). לאחר המסת agarose על ידי חימום תערובת במיקרוגל, להוסיף 10 μL של כתם חומצות גרעין לכל 100 מ"ל של ג'ל מוכן לאחר קירור התערובת ל- C 60-70 מעלות, יוצקים את הג'ל והכנס את מסרקים. תנו ג'ל להסתפק לפחות 30 דקות.
8. מערבבים 15 μl של כל מוצר RT-PCR עם 3 μL של צבע טעינת 6x. טען 15 μL של כל דגימה electrophorese הג'ל agarose ב -100 V עבור H 1.
9. היעד ובלו שבר RT-PCR בגודל מתאים (330 נ"ב עבור GI ו -341 נ"ב עבור GII) מן ג'לd לטהר RNA באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרית. מוצר PCR מטוהר כעת ניתן להשתמש עבור רצף סנגר.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים זרימה של פרוטוקול הדגימה הספוגית. פרוטוקול זה מכיל ארבעה שלבים עיקריים; 1) אוסף מדגם, 2) מדגם אחסנה והובלה 3) טיהור רנ"א נגיפי וריכוז ו -4) RT-qPCR assay ו גנוטיפ.

איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול הסופי עבור דגימת משטח סביבתית של no...

דיון

יש noroviruses מנת זיהומיות אדם 50% בין 18 ו -10 חלקיקי ³ וירוס ^20. לכן, גם זיהום ברמה נמוכה של משטחים עלול להוות סיכון לבריאות הציבור. כמה היבטים של פרוטוקול הדגימה הספוגית הוערכו כולל: 1) חומרי ספוגית שונה, 2) מטליות תנאי אחסון במהלך הובלה, 3) ריכוז הנגיפי RNA, ו -4) coliphage MS2 כשליטת חילוץ פנימי.

עד לאחרונה, רק את הביצועים של מטליות עשויות כותנה, פוליאסטר, ניילון אנטי-סטטי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם גנרי לערכות
Macrofoam	Premoistened EnviroMax Swab kit	פוריטן	2588060PFUW
חזק>RNA מאגר ליזה	CDC מאגר UNEX	מיקרוביולוגיות	חתול מס' MR0501
<חזק>עמודת מיצוי RNA	מידי	אומגה ביוטק	חתול מס' R6664-02
<חזק>עמודת סיבוב לטיהור RNA	ערכת RNA נקי ורכז	Zymo Research	Cat No R1016
ערכת RT-PCR בזמן אמת	AgPath ערכת RT-PCR חד שלבי Life	Technologies	Cat No
4387391ערכת RT-PCR קונבנציונלית	Qiagen ערכת RT-PCR שלב אחד	ערכת Qiagen ערכת	ג'ל Cat No
210212Gel Extract	Qiagen QIAquick gel extraction	kit ערכת Qiagen Cat	לא 28704 או 28706
	Coliphage MS2	ATCC	Cat No 15597-B1
	תמלילי
פלטפורמת PCR בזמן אמת	Applied Biosystems	דגם ABI 7500
	MicroAmp סרט דבק שקוף	Thermo Scientific	Cat No 4306311

< מיצוי ריצה של RNAצלחת תגובה אופטית 96 בארות Thermo Scientific Cat No 4316813