מתואר השימוש במולקולות פולידאוקסינוקלאוטיד (44-mer aptamer) לחישת יון גדוליניום (III) בתמיסה מימית. נוכחות היון מתגלה באמצעות עלייה בפליטת הקרינה של החיישן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודגמת שיטה לקביעת נוכחותו של יון גדוליניום תלת-ערכי לא כלאטי (Gd3+) בתמיסה מימית. Gd3+ קיים לעתים קרובות בדגימות של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום כתוצאה מתגובות לא שלמות בין הליגנד ליון, או כתוצר דיסוציאציה. מכיוון שהיון רעיל, יש חשיבות קריטית לגילויו. כאן מתוארים התכנון והשימוש בחיישן מבוסס aptamer (חיישן Gd) עבור Gd3+. החיישן מייצר שינוי פלואורסצנטי בתגובה להגדלת הריכוזים של היון, ויש לו מגבלת זיהוי בתחום הננו-מולרי (~100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3). ניתן להפעיל את הבדיקה במאגר מימי ב-pH הסביבה (~7 - 7.4) במיקרו-פלטה של 384 בארות. החיישן אינו מגיב יחסית כלפי יוני מתכת רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כגון יוני נתרן, אשלגן וסידן, אם כי הוא אינו ספציפי ל-Gd3+ על פני לנתנידים תלת-ערכיים אחרים כגון יורופיום (III) וטרביום (III). עם זאת, הלנתנידים אינם נמצאים בדרך כלל בחומרי ניגוד או במערכות הביולוגיות, ולכן ניתן להשתמש בחיישן כדי לקבוע באופן סלקטיבי Gd3+ בתנאים מימיים.
מבוא
החשיבות הגוברת של דימות תהודה מגנטית (MRI) באבחון קליני, אשר מוגבל על ידי רגישות הטבועה של הטכניקה, הביאה את הצמיחה המהירה של המחקר על פיתוח של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום רומן (GBCAs) 1. GBCAs הם מולקולות אשר מנוהלים על מנת לשפר את איכות התמונה, ובדרך כלל יש להם את המבנה הכימי של יון גדוליניום trivalent (ה 3+) מתואם ליגנד polydentate. Complexation זה הוא בעל חשיבות קריטית כפי שהקב"ה unchelated 3+ הוא רעיל; זה כבר לידי ביטוי בהתפתחות של סיסטיק מערכתית nephrogenic בחלק מהחולים עם מחלת כליות או אי ספיקת 2. כתוצאה מכך, הקולט את היון חינם המימי הוא סייע להבטיח את שלומם של GBCAs. הנוכחות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: מי כיתה וביולוגיה מולקולריים משמשים בכל הכנות חיץ פתרון. כל הצינורות הפנויים (microcentrifuge ו- PCR) וטיפי pipet הם DNase- ו RNase חינם. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ בחום.
1. הכנת פתרונות מניות Aptamer
- לרכוש 2 קווצות polydeoxynucleotide מסחרית. להזמין שני גדילים עם טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC).
גדיל 1 (-aptamer ה '):
5 '- / 56-FA....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שינוי קרינה אופייני הפתרון ה-החיישן בנוכחות unchelated אלוקים 3+ מוצג באיור 2. הפליטה ניתן להתוות כשינוי לקפל פלואורסצנטי (איור 2 א) או את קרינת הגלם לקרוא (תרשים 2B) ביחידות כלשהן (עף). מגרשי שני להניב עקומות כיול דומות מאוד עם מגוון ליניארי לריכוזי ה 3+ מתחת ל -1 מיקרומטר ו רוויה של האות ב> 3 מיקרומטר. המגבלה של זיהוי היא ~ 100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שימוש בחיישן ה-מבוסס aptamer, גידול פליטת קרינה כי היא יחסית ריכוז unchelated אלוקים 3+ הוא ציין. כדי למזער את כמות מדגם, assay ניתן לרוץ microplate 384 גם עם נפח דגימה כולל של 45 μL לכל טוב. בתכנון זה, הבחירה של והעמסה (FAM) ו dabcyl (DAB) התבססה בעיקר על העלות של החומרים הכימיים; כדי לשנות את אורך גל הפליטה, זיווג של fluorophore שונה מרווה ניתן להשתמש 11.
חשוב לציין כי על מנת להשיג את התוצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות לד"ר מילאן נ' סטויאנוביץ' מאוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ניו יורק על תרומה מדעית רבת ערך. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מאוניברסיטת קליפורניה סטייט איסט ביי (CSUEB) ומענק התמיכה בפקולטה של CSUEB - חוקר פרטני. O.E., T.C. ו-A.L. נתמכו על ידי מלגת מרכז CSUEB למחקר סטודנטים (CSR).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Gd-aptamer | IDTDNA | רצף קלט ושינוי פלואורופור בצורת הסדר | ניתן להשתמש בפלואורופור עם אורך גל פליטה שונה. ניתן להזמין את האפטמר גם מחברה אחרת. |
| גדיל מרווה | IDTDNA | רצף קלט ושינוי מרווה בצורת הסדר | ניתן להשתמש במרווה שונה להעברת אנרגיה אופטימלית מהפלואורופור. ניתן להזמין את האפטמר גם מחברה אחרת. |
| בדרגת ביולוגיה מולקולרית | אין יצרן ספציפי, גם DEPC וגם לא מטופל DEPC עובדים באותה מידה | ||
| גדוליניום (III) כלוריד נטול מים | Strem | 936416 | HEPES רעיל |
| פישר סיינטיפיק | BP310-500 | ||
| מגנזיום כלוריד נטול מים | MP ביומדיקל | 0520984480 - 100 גרם | |
| נתרן כלורי | אקרוס אורגני | ||
| אשלגן כלורי | פישר סיינטיפיק | P333-500 | |
| נתרן הידרוקסיד, כדורים | פישר סיינטיפיק | BP359 | |
| חומצה הידרוכלורית | פישר סיינטיפיק | SA49 | רעיל וקורוזיבי |
| 384 בארות אוגן נמוך שחור שטוח תחתון פוליסטירן NBS לוחות | קורנינג | 3575 | המתאימות לפלואורסצנטיות נדרשת קריאה. |
| מסנן עליון בקבוק חד פעמי סטרילי של Nalgene Rapid-Flow | Thermo Scientific | 5680020 | החלק העליון של הבקבוק מצויד בקרום PES 0.2 מיקרון |
| בקבוקים סטריליים חד פעמיים 250 מ"ל | קורנינג | 430281 | ניתן להשתמש בבקבוק גדול או קטן יותר |
| מיקרוצנטריפוגה | אין יצרן ספציפי, כל עוד הם צינורות PCR 0.2 מ"ל נטולי | ||
| DNA ו-RNAseאין יצרן ספציפי, כל עוד הם | |||
| אין יצרן ספציפי | |||
| טיפים ל-Pipet (לא מסנן) בגדלים | אין יצרן ספציפי, כל עוד הם נטולי DNAse ו-RNAse | ||
| Equipment | |||
| Plate | Reader Biotek Synergy H1 | קוראי צלחות של יצרנים אחרים יעבדו באותה מידה |
מקורות
- Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
- Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for car....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
