מאמר שיטה

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

DOI:

10.3791/55216

⸱

9 בינואר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר השימוש במולקולות פולידאוקסינוקלאוטיד (44-mer aptamer) לחישת יון גדוליניום (III) בתמיסה מימית. נוכחות היון מתגלה באמצעות עלייה בפליטת הקרינה של החיישן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודגמת שיטה לקביעת נוכחותו של יון גדוליניום תלת-ערכי לא כלאטי (Gd3+) בתמיסה מימית. Gd3+ קיים לעתים קרובות בדגימות של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום כתוצאה מתגובות לא שלמות בין הליגנד ליון, או כתוצר דיסוציאציה. מכיוון שהיון רעיל, יש חשיבות קריטית לגילויו. כאן מתוארים התכנון והשימוש בחיישן מבוסס aptamer (חיישן Gd) עבור Gd3+. החיישן מייצר שינוי פלואורסצנטי בתגובה להגדלת הריכוזים של היון, ויש לו מגבלת זיהוי בתחום הננו-מולרי (~100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3). ניתן להפעיל את הבדיקה במאגר מימי ב-pH הסביבה (~7 - 7.4) במיקרו-פלטה של 384 בארות. החיישן אינו מגיב יחסית כלפי יוני מתכת רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כגון יוני נתרן, אשלגן וסידן, אם כי הוא אינו ספציפי ל-Gd3+ על פני לנתנידים תלת-ערכיים אחרים כגון יורופיום (III) וטרביום (III). עם זאת, הלנתנידים אינם נמצאים בדרך כלל בחומרי ניגוד או במערכות הביולוגיות, ולכן ניתן להשתמש בחיישן כדי לקבוע באופן סלקטיבי Gd3+ בתנאים מימיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החשיבות הגוברת של דימות תהודה מגנטית (MRI) באבחון קליני, אשר מוגבל על ידי רגישות הטבועה של הטכניקה, הביאה את הצמיחה המהירה של המחקר על פיתוח של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום רומן (GBCAs) 1. GBCAs הם מולקולות אשר מנוהלים על מנת לשפר את איכות התמונה, ובדרך כלל יש להם את המבנה הכימי של יון גדוליניום trivalent (ה 3+) מתואם ליגנד polydentate. Complexation זה הוא בעל חשיבות קריטית כפי שהקב"ה unchelated 3+ הוא רעיל; זה כבר לידי ביטוי בהתפתחות של סיסטיק מערכתית nephrogenic בחלק מהחולים עם מחלת כליות או אי ספיקת 2. כתוצאה מכך, הקולט את היון חינם המימי הוא סייע להבטיח את שלומם של GBCAs. הנוכחות של 3+ unchelated הקב"ה בפתרונות GBCA לעתים קרובות היא תוצאה של תגובה מלאה בין ליגנד ואת יון, דיסוציאציה של המתחם, או displacement ידי קטיונים מתכת ביולוגיים אחרים 3.

בין מספר טכניקות המשמשות כיום לקביעת הנוכחות של קב"ה 3+, שמסתמך על כרומטוגרפיה ו / או דרגת ספקטרומטריית הגבוהה ביותר מבחינת צדדיות ותחולה 4. בין שאר מעלותיו שלהם גבוהה רגישות ודיוק, היכולת לנתח מטריצות מדגם שונות (כולל בסרום אדם 5, שתן ושיער 6, שפכים 7, ועל ניסוחים חומר ניגוד 8), ואת כימות סימולטני של מתחמי ה 3+ מרובים (הרישום של מחקרים קודמים עד 2013 מתוארת סקירה מקיפה על ידי Telgmann et al.) 4. החסרון היחיד הוא כי כמה שיטות אלה דורשים instrumentations (כגון מצמידי אינדוקטיבי ספקטרומטריית פלזמה המונית) 4 כי מעבדות מסוימות עשויות לא תהיינה גישה. במסגרת גילוי GBCA רומן על מחקר הוכחה של קונספט רמות, arelatively יותר נוחה, מהירה, וחסכוני שיטה מבוססת ספקטרוסקופיות (כגון ספיג או קרינת UV-Vis) עשויה לשמש אלטרנטיבה יקרה. בעזרת יישומים אלה בחשבון, חיישן פלורסנט מבוסס aptamer עבור מימיית אלוקים 3+ פותח 9.

Aptamer (חס-aptamer) הוא מולקולת DNA חד-גדילי ארוך 44-בסיס עם רצף של בסיסים כי היה מבודד בתהליך האבולוציה שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) 9. כדי להתאים את aptamer לתוך חיישן ניאון, fluorophore מחוברת התחנה הסופית '5 של גדיל, אשר הוא הכלאה ואז עם גדיל מרווה (QS) באמצעות 13 בסיסים משלימים (איור 1). QS מתויג עם מולקולת מרווה בחושך ב 3 התחנה הסופית '. בהיעדר ה 3+, החיישן (חס-חיישן), מורכב ביחס של 1: 2 חפרפרת של הקב"ה-aptamer ו QS בהתאמה, יהיה t בשל פליטת קרינה מינימאליתo העברת אנרגיה מן fluorophore אל מרווה. התוספת של מימית אלוקים 3+ יהיה לעקור את QS מן הקב"ה-aptamer, וכתוצאה מכך גידול פליטת הקרינה.

figure-introduction-1
איור 1. החיישן (חס-חיישן) שמורכב של aptamer הארוך 44-הבסיס (-aptamer ה ') מתויג עם והעמסה (א fluorophore) ואת גדיל המרווה ארוך 13-בסיס (QS) מתויג עם dabcyl (א מרווה כהה) . בהעדר unchelated אלוקים 3+, הקרינה של החיישן היא מינימלית. עם תוספת של הקב"ה 3+, עקירה של QS מתרחשת וגידול פליטת הקרינה הוא ציין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יש כרגע, אחד נפוצה מבוסס ספקטרוסקופיות שיטה לזהותing 3+ אלוקים מימי. Assay זו משתמשת תפוז xylenol מולקולה, אשר עוברת שינוי אורך הגל קליטה מקסימלית מפני 433 עד 573 ננומטר על קלאציה אל יון 10. יחס מקסימום ספיגת שני אלה יכולים לשמש כדי לכמת את כמות unchelated אלוקים 3+. חיישן aptamer מהווה חלופה (יכול להיות גם משלים) אל assay הכתום xylenol, כמו שתי השיטות יש תנאי תגובה שונים (כגון pH ורכב של תמיסות בופר בשימוש), selectivities היעד, טווח ליניארי של כימות, ואופני זיהוי 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: מי כיתה וביולוגיה מולקולריים משמשים בכל הכנות חיץ פתרון. כל הצינורות הפנויים (microcentrifuge ו- PCR) וטיפי pipet הם DNase- ו RNase חינם. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ בחום.

1. הכנת פתרונות מניות Aptamer

  1. לרכוש 2 קווצות polydeoxynucleotide מסחרית. להזמין שני גדילים עם טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC).
    גדיל 1 (-aptamer ה '):
    5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3 "
    סטרנד 2 (QS):
    5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
  2. ממיסים כל קווצה מים לעשות 100 פתרונות מניות בודדות מיקרומטר של aptamer-ה 'ואת QS.
  3. אחסן פתרונות אלה ב -20 ° C. הפתרונות הם יציבים עד כה, במשך 3 שנים.
  4. כדי למזער FreeZדואר ההפשרה מחזורים, לאחסן את פתרונות המניות ב 10 aliquots μL.

2. הכנת הפתרון-חיישן ה 2x

  1. הכן את החיץ assay (20 HEPES מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, 150 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ). התאם את ה- pH ל ~ 7.4 עם NaOH ו HCl, ולסנן דרך מסננים העליון בקבוק חד פעמי סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר PES. אחסן בבקבוקים סטריליים. אם מסונן מאוחסן כראוי (בטמפרטורת החדר), למאגר יציב עד כה, עבור 2 שנים.
  2. לדלל 1 μL של פתרון ה-aptamer המניות (משלב 1.2) ו -2 μL של פתרון המניות QS (משלב 1.2) ב 497 μL של חיץ assay. מערבבים היטב בעזרת מערבולת. הריכוזים שלהם בפתרון ה-חיישן 2x הם 200 ננומטר ו 400 ננומטר, בהתאמה.
    הערה: היקף הפתרון ה-חיישן 2x מוכן בשלב זה הוא 500 μL, וזה מספיק כדי לבדוק 6 - 7 ריכוזים שונים של אלוקים 3+ עבור עקומת הכיול ואת הפתרונות חומר ניגוד(שלב 3). כל דגימה תיתן בארות כפולות צלחת 384 גם.
    1. כוון את עוצמת הקול של פתרון 2x אלוקים-החיישן פי מספר פתרונות 3+ האלוקים שצריך להיבדק.
  3. מעבירים את הפתרון-חיישן ה 2x ל -9 צינורות PCR, עם 50 μL לתוך צינור אחד. מניחים את צינורות Cycler תרמית.
  4. הגדר את תוכנית Cycler התרמית כדי לחמם את הפתרון המוצע עבור צינורות עד 95 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 5 דקות, ואז לאט לאט לקרר את פתרונות ל -25 מעלות צלזיוס מעל ~ 15 דקות (בשיעור של ~ 0.05 - 0.1 ° C / ים). מחזור החימום וקירור הוא להבטיח הכלאה אופטימלית בין aptamer-ה 'ואת QS. תוצאות הכלאה חלקית מרווה שלמה קרינת רקע גבוהה של החיישן. אם Cycler תרמית אינו זמין, לבצע את התהליך הזה באמצעות אמבט מים חמים במקום.
  5. לאחר מצונן עד 25 מעלות צלזיוס, מיד להשתמש הפתרון, או לשמור Cycler התרמית (עד כ 2 שעות) עד מוכן להיותמְשׁוּמָשׁ. כאשר באמבט מים משמש למערכות החימום, לעזוב את הצינורות באמבטיה כמו המים מתקררים לאט לטמפרטורת חדר.

3. בניית עקומת כיול הקרינה לאיתור נוכחות של הקב"ה Unchelated 3+ בתמיסה של חומר ניגוד אלוקים

  1. ממיסים GdCl 3 מוצק למאגר assay (אותו למאגר כמו בשלב 2.1).
  2. באמצעות דילול סדרתי, להכין 100 μL כל אחד 6 פתרונות 3+ שוני אלוקים צינורות microcentrifuge ב כפול הריכוזים הרצויים הסופיים עבור עקומת הכיול (2x פתרונות).
    1. לדוגמה, כדי לבנות כיול עבור 0 (מאגר בלבד ללא GdCl 3), 50, 100, 200, 400, ו -800 ננומטר של הקב"ה 3+, להכין תמיסות המכילות 0, 100, 200, 400, 800, ו -1,600 ננומטר של היון. הקפד תמיד לכלול את "אטומים" עם 0 ננומטר אלוקים 3+ כמו שליטה שלילית.
  3. ממיסים את חומר ניגוד להיות מבחןאד למאגר assay. כן 2 או 3 ריכוזים שונים של פתרונות חומר ניגוד דרך דילול סדרתי.
    הערה: בדיקת 3 ריכוזים שונים של פתרון חומר ניגוד מומלצת. זו היא להבטיח כי ריכוזים אלה נמצאים בטווח ליניארי. אם בדגימות שנבדקו אינו מציג קשר לינארי, הקטינו את הריכוזים של חומר הניגוד בשימוש.
  4. קח את צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן משלב 2.5 מתוך Cycler התרמית.
  5. הוסף 50 μL של כל פתרון ה 3+ משלב 3.2 לתוך 6 מתוך 9 צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כל צינור PCR מכיל כעת את הריכוז הרצוי של הקב"ה 3+ להיבדק, 100 ננומטר אלוקים-aptamer, ו -200 ננומטר QS.
  6. אל צינורות הנותרים PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן, להוסיף 50 μL של פתרונות חומר ניגוד משלב 3.3. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
  7. דגירה שלolutions בתוך צינורות PCR במשך כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. הם עשויים להיות שנותרו לעמוד עד 30 דקות.
  8. העבר 45 μL של כל צינור לתוך צלחת 384 גם. כל צינור PCR ייתן בארות כפולות.
  9. רשום את הקרינה של כל אחד גם על קורא צלחת. Fluorophore (FAM) המשמש לעיצוב חיישן-ה 'יש מקסימום עירור ופליטה של ​​ננומטר 495 ו -520 בהתאמה, כמפורט באתר האינטרנט של הספק. בחר אורכי גל עירור ופליטה מתאימים או מסנן תלויים אם הצליח-הקורא monochromator- או מסנן מבוסס.
  10. שרטט את הגרף של קרינה ביחידות קרינה שרירותיות (עפו) נגד ריכוז של קב"ה 3+.
  11. שרטט את הגרף כמו שינוי לקפל הקרינה נגד ריכוז של הקב"ה 3+. חשב את השינוי לקפל הקרינה על ידי חלוקת עפו של כל ריכוז ידי עפו של הפתרון "אטומים" (עם 0 ננומטר של הקב"ה 3+). השינוי לקפל קרינה יאפשר עבור normalization של התוצאות, צריך התצוגה עפה עת מסוימת (בימים שונים, וכו ') וריאציות.
  12. השווה את פליטת הקרינה של תמיסה המכילה חומר הניגוד ו 'ריק', המהווה את התמיסה המכילה 0 ננומטר GdCl 3 (מאגר בלבד).
    הערה: קרינה גבוהה יותר של פתרון GBCA מרמזת על הנוכחות של unchelated אלוקים 3+, אשר עשוי להצריך טיהור נוספת של חומר הניגוד. הכמות הנוכחית 3+ unchelated האלוקים ניתן להעריך באמצעות עקומת הכיול נבנתה בשלב 3.10 או 3.11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינוי קרינה אופייני הפתרון ה-החיישן בנוכחות unchelated אלוקים 3+ מוצג באיור 2. הפליטה ניתן להתוות כשינוי לקפל פלואורסצנטי (איור 2 א) או את קרינת הגלם לקרוא (תרשים 2B) ביחידות כלשהן (עף). מגרשי שני להניב עקומות כיול דומות מאוד עם מגוון ליניארי לריכוזי ה 3+ מתחת ל -1 מיקרומטר ו רוויה של האות ב> 3 מיקרומטר. המגבלה של זיהוי היא ~ 100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בחיישן ה-מבוסס aptamer, גידול פליטת קרינה כי היא יחסית ריכוז unchelated אלוקים 3+ הוא ציין. כדי למזער את כמות מדגם, assay ניתן לרוץ microplate 384 גם עם נפח דגימה כולל של 45 μL לכל טוב. בתכנון זה, הבחירה של והעמסה (FAM) ו dabcyl (DAB) התבססה בעיקר על העלות של החומרים הכימיים; כדי לשנות את אורך גל הפליטה, זיווג של fluorophore שונה מרווה ניתן להשתמש 11.

חשוב לציין כי על מנת להשיג את התוצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר מילאן נ' סטויאנוביץ' מאוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ניו יורק על תרומה מדעית רבת ערך. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מאוניברסיטת קליפורניה סטייט איסט ביי (CSUEB) ומענק התמיכה בפקולטה של CSUEB - חוקר פרטני. O.E., T.C. ו-A.L. נתמכו על ידי מלגת מרכז CSUEB למחקר סטודנטים (CSR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Gd-aptamerIDTDNAרצף קלט ושינוי פלואורופור בצורת הסדרניתן להשתמש בפלואורופור עם אורך גל פליטה שונה. ניתן להזמין את האפטמר גם מחברה אחרת.
גדיל מרווהIDTDNAרצף קלט ושינוי מרווה בצורת הסדרניתן להשתמש במרווה שונה להעברת אנרגיה אופטימלית מהפלואורופור. ניתן להזמין את האפטמר גם מחברה אחרת.
בדרגת ביולוגיה מולקולריתאין יצרן ספציפי, גם DEPC וגם לא מטופל DEPC עובדים באותה מידה
גדוליניום (III) כלוריד נטול מיםStrem936416HEPES רעיל
פישר סיינטיפיקBP310-500
מגנזיום כלוריד נטול מיםMP ביומדיקל0520984480 - 100 גרם
נתרן כלוריאקרוס אורגני
אשלגן כלוריפישר סיינטיפיקP333-500
נתרן הידרוקסיד, כדוריםפישר סיינטיפיקBP359
חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיקSA49רעיל וקורוזיבי
384 בארות אוגן נמוך שחור שטוח תחתון פוליסטירן NBS לוחותקורנינג3575המתאימות לפלואורסצנטיות נדרשת קריאה.
מסנן עליון בקבוק חד פעמי סטרילי של Nalgene Rapid-FlowThermo Scientific5680020החלק העליון של הבקבוק מצויד בקרום PES 0.2 מיקרון
בקבוקים סטריליים חד פעמיים 250 מ"לקורנינג430281ניתן להשתמש בבקבוק גדול או קטן יותר
מיקרוצנטריפוגהאין יצרן ספציפי, כל עוד הם צינורות PCR 0.2 מ"ל נטולי
DNA ו-RNAseאין יצרן ספציפי, כל עוד הם
אין יצרן ספציפי
טיפים ל-Pipet (לא מסנן) בגדליםאין יצרן ספציפי, כל עוד הם נטולי DNAse ו-RNAse
Equipment
PlateReader Biotek Synergy H1קוראי צלחות של יצרנים אחרים יעבדו באותה מידה
מים 327300025 קורוזיבית צינורות של 1.5 מ"ל Micropipets נטולי DNAse ו-RNAse מתאימים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
  2. Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).
  3. Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).
  4. Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
  5. Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).
  6. Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).
  7. Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).
  8. Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).
  9. Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).
  10. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
  11. Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
  12. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
  13. Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).
  14. Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gd3384

מאמרים קשורים