מאמר שיטה

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו באתרו Assay קשירת הסמיכות

DOI:

10.3791/55218

⸱

16 בינואר 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון מעורבות באלפי תהליכים תאיים ומתרחשות בהקשר מרחבי מובהק. באופן מסורתי, קו-אימונו-משקעים היא טכניקה פופולרית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון. ניתוח כתמים מערביים לאחר מכן הוא השיטה הנפוצה ביותר להמחשת חלבונים בעלי משקעים חיסוניים. לאחרונה, בדיקת קשירת הקרבה הפכה לכלי רב עוצמה להמחשת אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן ומספקת את האפשרות לכמת אינטראקציות חלבון-חלבון בשיטה זו. בדומה לאימונוציטוכימיה קונבנציונלית, טכניקת בדיקת קשירת הקרבה מבוססת גם על נגישות של נוגדנים ראשוניים לאנטיגנים, אך לעומת זאת, בדיקת קשירת קרבה מזהה אינטראקציות חלבון-חלבון בטכניקה ייחודית הכוללת PCR במעגל מתגלגל, בעוד שאימונוציטוכימיה קונבנציונלית מראה רק לוקליזציה משותפת של חלבונים.

גורם גרעיני 90 (NF90) וחלבון מוטיב קושר RNA 3 (RBM3) הוכחו בעבר כשותפים אינטראקטיביים. הם ממוקמים בעיקר בגרעין, אך גם נודדים לציטופלזמה ומווסתים את מסלולי האיתות בתא הציטופלזמי. כאן, השווינו אינטראקציה של NF90-RBM3 הן בגרעין והן בציטופלזמה על ידי בדיקת קו-אימונו-משקעים וקשירת קרבה. בנוסף, דנו ביתרונות ובמגבלות של שתי הטכניקות הללו בהדמיית אינטראקציות חלבון-חלבון ביחס להתפלגות מרחבית ולתכונות של אינטראקציות חלבון-חלבון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם גרעיני 90 (NF90) הוא חלבון רב-איזופורם עם פונקציות רבות כולל בתגובה לזיהום ויראלי, הסדרת אינטרלויקין -2 שלאחר תעתיק ורגולציה של מירנה biogenesis 1-3. RBM3 הוא חלבון קושר RNA, מעורב biogenesis תרגום מירנה יכול להיגרם על ידי גורמי לחץ שונים כולל היפותרמיה היפוקסיה 4-6. לאחרונה, מצאנו NF90 ו RBM3 בתוך חלבון מורכב 7. האינטראקציה של NF90 ו RBM3 חיוני לווסת קינאז חלבון-RNA כמו קינאז reticulum endoplasmic ("הערכה") פעילות בתגובה חלבון פרש 7. שניהם NF90 ו RBM3 ממוקמים בעיקר בגרעין אלא חלק קטן NF90 ושירות הסעות RBM3 לתוך הציטופלסמה לאגד יש לזה עבור פונקציות ספציפיות, למשל להסדיר את הפעילות "הערכה". לכן, חשוב כדי להמחיש את ההפצה של אינטראקציות NF90-RBM3 בתא subcellular, אשר עשוי להצביעתפקידיהם השונים בתא בהתאמה.

לפני עשרות שנים, היברידית שמרים שני (Y2H) פותחה כדי לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים 8. עם זאת, בשל בנייה מלאכותית של חלבונים התמזגו, תוצאות חיוביות כוזבות הגבילו את היישום של שיטה זו. במשך זמן רב, שיתוף immunoprecipitation היה הטכניקה העיקרית לנתח אינטראקציות בין חלבונים, במיוחד בתנאי endogeneous 9. כדי לנתח את מורכבות חלבון-immunoprecipitated שיתוף, כתם מערבי הוא הטכניקה הנוחה ביותר, תוך ספקטרומטריית מסה משמשת כאשר רגישות ודיוק סופר הם רצויות. בשנים האחרונות, assay קשירת הקרבה פותח שיטה חדשה לאיתור אינטראקציות חלבון-חלבון בשני התאים והרקמות באתרו 10,11.

הנה, השווינו את שיטת שיתוף immunoprecipitation הפופולרית ביותר ושיטת assay רומן יחסית קרב קשירה בלכידת NF9האינטראקציה 0-RBM3 שברים subcellular. דנו גם את היתרונות והמגבלות של שתי הטכניקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Co-immunoprecipitation

  1. זרע HEK293 תאים ב 2 x 10 5 תאים לכל היטב צלחת אחת 6-היטב 2 מיליליטר הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תוספת עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו 100 U / mL פניצילין, סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס) .
  2. לגדל תאים עבור 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  3. שטוף תאים עם פוספט שנאגר מלוחים קרים (PBS) שלוש פעמים. קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. כן שברים גרעיניים cytoplasmic באמצעות ריאגנטים הפקה מסחריים גרעיניים cytoplasmic. בצע הוראה של היצרן עם כמה שינויים.
    1. השתמש 3 x 10 6 תאים לניסוי שיתוף immunoprecipitation אחד (כ 90% confluency מ 3 בארות של צלחת 6-גם אחד). הוספת 300 פתרון מיצוי ציטופלסמית μl קר (אני CER) ו מערבולת למשך 15 שניות במהירות הגבוהה ביותר.
    2. דגירה במשך 30 דקות על קרח. במהלך הדגירה, vortex עבור 5 ימים כל 10 דקות.
    3. להוסיף 16.5 פתרון מיצוי ציטופלסמית קר μl השנייה (CER II), מערבולת למשך 5 שניות ו דגירה במשך 5 דקות על הקרח.
    4. וורטקס למשך 5 שניות ו צנטריפוגות ב XG 16,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. העברת supernatant (תמצית cytoplasmic) לתוך צינור מראש צונן חדש, ולשמור על הקרח עד בשימוש.
    6. לשטוף כדורי מסיסים (גרעינים המכיל) שלוש פעמים עם 1 מ"ל קר PBS בכל פעם על ידי pipetting למעלה ולמטה חמש פעמים. הסר PBS לאחר לשטוף.
    7. להוסיף 150 פתרון מיצוי גרעיני μl קר (NER), מערבולת עבור 15 שניות ו דגירה שעה 1 על הקרח. במהלך הדגירה, מערבולת עבור 15 שניות ו פיפטה 10 פעמים עם טיפ 200 μl כל 10 דקות.
    8. וורטקס למשך 15 שניות ו צנטריפוגות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °.
    9. העברת supernatant (תמצית גרעינית) לתוך צינור מראש צונן חדש, ולשמור על קרח עד לשימוש.
  5. להוציא 10% מנפח של תמציות גרעיני cytoplasmic כל כתשומות.
  6. אdd קר PBS על תמציות הנותרים לנפח סופי של 1 מ"ל. שמור על הקרח עד לשימוש.
    הערה: Pre-הסליקה אינה הכרחית בעת שימוש חלבון G-מצומדות חרוזים מגנטיים. עם זאת, אם הרקע הוא גבוה, לבצע מראש סליקה על ידי דוגרים 40 חרוזים מגנטיים μl חלבון G-מצומדות (50% תרחיף) ו 1 מ"ל מדולל lysate משלב זה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על הכתף. supernatant הנפרד (lysate מראש פינה) עשויים חרוזים עם מתלה מגנטית. מחק את החרוזים.
  7. כדי נוגדן ראשוני זוג עם חלבון G-מצומדות חרוזים מגנטיים, דגירה 40 μl חלבון G-מצומדות חרוזים מגנטיים (50% תרחיף) עם נוגדנים או IgG ארנב נגד RBM3 ארנב polyclonal 4 מיקרוגרם (שליטה שלילי) ב 200 μl PBS בתוספת חיץ Tween 20 (PBST, 0.02% Tween 20) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 40 דקות על הכתף.
  8. נפרדים נוגדן מצמידים חרוזים supernatant עם מתלה מגנטי, וזורקים supernatant. שטפו את החרוזים פעם עם 200 PBST μl (0.02%).
  9. הוסף 1מ"ל מדולל lysates (או אם lysates הצורך, מראש פינה) על חרוזים, דגירה על הכתף ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  10. ביום למחרת, להפריד את החרוזים supernatant ידי מתלה מגנטי, וזורקים supernatant. לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ"ל PBST (0.02%) עבור כל צינור ב 4 ° C על הכתף עם מהירות קבועה של 20 סל"ד.
  11. Elute החלבונים מן החרוזים ידי הוספת מאגר מדגם 40 μl (חיץ מדגם מסחרי 1x ו -50 מ"מ 1,4-dithiothreitol (DTT)). מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ספין למטה ונוזלים והעברת צינור 1.5 מ"ל חדש.
  12. לדלל lysates קלט במאגר מדגם (ריכוז סופי: חיץ מדגם מסחרי 1x ו -50 מ"מ DTT) וחום ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. תשומות טענו וחלבוני immunoprecipitated מהשלב האחרון ג'ל טרומי 4-12% bis-טריס. היקף הטעינה של כל טוב לא יעלה על 20 μl. בצע אלקטרופורזה במאגר ריצה מסחרי 1x על קרח למשך 35 דקות.
    הערה: גרעיני טען ותמצית cytoplasmicים על יחס של 1: 2 (V / V), אשר משקף את הסכום הראשוני הזהה של תאים.
  13. העברת חלבוני קרום PVDF חיץ העברת מסחרי 1x 30 V עבור שעה 2 ב 4 ° C.
  14. קרום בלוק עם 5% חלב רזה ב PBST (0.1% Tween 20) ב RT במשך 40 דקות על שייקר.
  15. דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים (הן מדולל 1: 1,000) ב PBST (0.1%) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  16. לשטוף 3 x 10 דקות עם PBST (0.1%) ב RT על שייקר.
  17. דגירה הממברנה עם peroxidase חזרת (HRP), מצומדות אנטי עכבר או נוגדנים משני ארנבת אנטי (הן מדולל 1: 5,000) ב PBST (0.1%) ב RT עבור שעה 1.
  18. לשטוף 3 x 10 דקות עם PBST (0.1%) ב RT על שייקר.
  19. השתמש 0.2 מ"ל chemiluminescence משופרת (ECL) תערובת המצע לכל קרום 2 ס"מ, לדגור על RT במשך 5 דקות. הימנעו מכל אור משלב זה ואילך למעט אורות אדומים.
  20. בטל נוזלי ולחשוף את סרט רנטגן קלטת סרט. לפתח את הסרט באמצעות יחסי ציבור סרט אוטומטימכונת ocessing.

2. Immunocytochemistry ו Assay קשירת הסמיכות

  1. זרע HEK293 התאים ב 1.5 x 10 4 תאים לכל קאמרית השקופית מצופה אחד 8-תא פולי- D- ליזין ב 0.4 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS ו 100 U / ml עט סטרפטוקוקוס.
  2. לגדל תאים עבור 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  3. לשאוב בינוני, ולתקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 10 דקות ב RT.
  4. לשאוב PFA, לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ"ל PBS לכל תא.
  5. Permeabilize ותאי לחסום עם 0.5% Triton X-100 ו בסרום עז נורמלי 5% (NGS) ב- PBS ב RT עבור שעה 1.
  6. דגירה עם נוגדנים עיקריים 0.1% Triton X-100 ו -5% NGS ב PBS על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לדלל נוגדן אנטי NF90 חד שבטי עכבר הארנב polyclonal אנטי RBM3 נוגדן 1: 100 ב PBS עבור צביעה כפולה. לקבלת שליטה שלילית, להשמיט באופן עצמאי אחד משני הנוגדנים הראשוניים, ולהשמיט הוא נוגדני שליטה שלישית.
    הערה: אל תשתמשו חסימה מסחרית ריאגנטים דילול.
  7. לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ"ל PBS לכל תא.
  8. בכפוף פרוטוקולי assay קשירת immunocytochemistry או קרבה
    1. immunocytochemistry
      1. דגירה עם 1: 500 נוגדנים משני אנטי עכבר לצבוע מצמידים פלואורסצנטי ירוק מדולל ואדום ניאון לצבוע מצמידים נגד ארנב ב RT עבור שעה 1. הימנע אור משלב זה ואילך.
      2. גרעינים Counterstain עם 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) מדולל 1: 5,000 PBS ב RT במשך 10 דקות.
      3. לשטוף 3 x 10 דקות עם 0.5 מ"ל PBS לכל תא.
      4. סור לתאי משקופית הזכוכית ויבשה. הר עם 250 μ, הרכבה בינונית לכל שקופית.
    2. assay קשירת סמיכות
      1. הכן בדיקות assay קשירת הקרבה. מערבב לדלל שתי חלליות assay קרבת הקשירה (אנטי עכבר נוגדנים משני נגד ארנב מצורפים עם oligonucleotides שונה אשר יכול ולקשור ההתוספת הגסה של שני oligonucleotides אחרים בתמיסת קשירה) הוא 1: 5 ב 0.1% Triton X-100 ו -5% NGS ב PBS, בהיקף כולל של 320 μl עבור שקופית 8-תא אחד (כ 40 μl לסנטימטר 2) . לדגור על RT במשך 20 דקות.
      2. סור לתאי משקופית הזכוכית ולהוסיף החלליות המדוללות. דגירה באינקובטור לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
      3. כן פתרון קשירה. מיקס 8 μl אנזים, 64 μl 5 x מניות קשירה ו -248 μl H 2 O.
      4. הקש את הנוזל משקופית, ולשטוף 2 x 5 דקות 1x לשטוף הצפה (מצורף לערכה).
      5. הוסף פתרון קשירת דגירת חממת לחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      6. כן פתרון הגברה. מערבבים 4 פולימראז μl, 64 μl המניות 5x הגברה 252 μl H 2 O. הימנע אור משלב זה ואילך.
      7. הקש את נוזלי משקופית, ולשטוף 2 x 2 דקות בתוך א 1x הצפת לשטוף
      8. מוסיפים את המגברפתרון lification דגירת חממת לחות כהה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 100 דקות.
      9. הקש את הנוזל משקופית, ולשטוף 2 x 10 דקות ב 1x הצפה לשטוף B (מצורף לערכה). לשטוף דקות 1 ב 0.01x לשטוף הצפת B.
      10. ייבש את שקופית הר עם 250 μl של מדיום גובר מסחרי (עם DAPI) לכל שקופית.
  9. בדוק אותות ניאון תחת מיקרוסקופ באמצעות עדשה עינית 10X ו 20X עדשה אובייקטיבית. לרכוש תמונות באמצעות מצלמת CCD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים כי NF90 ו RBM3 הוא חלבונים גרעיניים רק חלק קטן נוכח בציטופלסמה. יש לציין, יש שלוש להקות שונות מוכתמות חיובי RBM3. הקטן רק מתחת ל -20 kDa משקף את הגודל הנכון של RBM3 (המשקל המולקולרי החזה של RBM3 הוא 17 KDA). מקורו של שתי הלהקות האחרות נשאר להיחקר. ניסויי Co-immunoprecipitation עם RBM3 כמו חלבון הפיתיון גילו כי אינטראקציות NF90-RBM3 נוכחות בעיקר בגרעין ומיעוט בציטופלסמה. נתונים Co-immunoprecipitation תומך בלוקליזציה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר יתרונות כמו גם חסרונות עבור שתי השיטות. כתוצאת שיטה חדשנית יחסית, יתרון ברור של assay קשירת הקרב הוא כדאי להבהיר אינטראקציות בין חלבונים ברמה מתא בודד במקום קבוצה של תאים הטרוגנית. תמונות עם גודל ורזולוציה גבוהים (למשל על ידי מיקרוסקופ confocal) לספק את אפשרות כימות על ידי ספירת כתמי פלורסנט בודדים. לעומת זאת, שילוב הקונבנציונלי של טכניקת שיתוף immunoprecipitation עם כתם מערבי יכול רק למחצה לכמת להקות חלבון, בעיקר בגלל טעינה מלאה מתאימה קשה לקבוע עבור דגימות IP....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ (SNSF, 31003A_163305).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הנשר השונה של דולבקו s בינוני (DMEM)SigmaD6429גלוקוז
4,500 מ"ג/
ליטר סרום בקר עוברי (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
פניצילין-סטרפטומיצין (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER ריאגנטים למיצוי גרעיני וציטופלזמיThermo Fisher Scientific78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110) נוגדןBD Transduction Laboratories612154להשתמש ב-1:1,000 עבור WB ו-1:100 עבור נוגדן ICC/PLA
RBM3ProteinTech14363-1-APהשתמש ב-1:1,000 עבור WB ו-1:100 עבור ICC/PLA
Lamin A/Cטכנולוגייתאיתות תאי נוגדנים#2032השתמש ב-1:1,000 עבור WB 
נוגדן נגד GAPDHAbcamab8245השתמש ב-1:1,000 עבור WB 
ארנב רגיל IgGסנטה קרוזsc-2027
אנטי ארנב IgG, נוגדן משני מקושר HRPטכנולוגיית איתות תאים#7074השתמש ב-1:5,000 עבור WB 
נוגדן משני HRP נגד עכברקארל רות'4759.1השתמש ב-1:5,000 עבור WB 
Clarity Western ECL Blotting SubstrateBio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS מאגר ריצה (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF ממברנהGE Healthcare Life Sciences10600021
Poly-D-Lysine 8 Well Culture SlideCorning BioCoat354632
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
סרום עיזים רגיל (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
עיזים נגד עכבר IgG (נוגדן H+L), Alexa Fluor 488 מצומדThermo Fisher ScientificA-11001
עיזים נגד ארנב IgG (נוגדן H+L), Alexa Fluor 568 מצומדThermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-דיאמידין-2-פנילינדול (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA בדיקה נגד עכבר PLUSSigmaDUO92001
Duolink PLA  בדיקה אנטי ארנב MINUSSigmaDUO92005
Duolink זיהוי ריאגנטים אדוםסיגמאDUO92008
Duolink Wash Buffers פלואורסצנטיסיגמאDUO82049
Duolink הרכבה בינונית עם DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
מיקרוסקופאולימפוסAX-70
מצלמת CCDSPOTInsight 2MP Firewire
סרט רנטגןFujifilmSuper RX
מכונת עיבוד סרטיםFujifilmFPM-100A

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western BlotHEK293NF90 RBM3

מאמרים קשורים