מאמר שיטה

האדם תאים דנדריטים ריאות: הפריסה המרחבית וזיהוי פנוטיפי ב Endobronchial ביופסיות שימוש אימונוהיסטוכימיה ו cytometry זרימה

DOI:

10.3791/55222

⸱

20 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Allergy Unit, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, 2Division of Medicine, Department of Public Health and Clinical Medicine, Umeå University, 3Divison of Infectious Diseases, Department of Clinical Microbiology, Umeå University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי חיסון שוכני ריאות, כולל תאים דנדריטיים (DCs) בבני אדם, הם קריטיים להגנה מפני פתוגנים ואלרגנים בשאיפה. עם זאת, בשל המחסור ברקמת ריאה אנושית, המחקרים מוגבלים. עבודה זו מציגה פרוטוקולים לעיבוד ביופסיות אנדוברונכיאליות ברירית אנושית לחקר DCs ריאתיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה וזרימה ציטומטרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאות חשופות כל הזמן לסביבה החיצונית, אשר בנוסף לחלקיקים לא מזיקים, מכילה גם פתוגנים, אלרגנים ורעלים. על מנת לשמור על סבילות או לגרום לתגובה חיסונית, מערכת החיסון חייבת לטפל כראוי באנטיגנים הנשאפים. תאים דנדריטיים של הריאות (DCs) חיוניים לשמירה על איזון עדין כדי ליזום חסינות בעת הצורך מבלי לגרום נזק משני לריאות עקב תגובה דלקתית מוגזמת. בעוד שקיימת הבנה מפורטת של הפנוטיפ והתפקוד של תאים חיסוניים כגון DCs בדם אנושי, הידע על תאים אלה ברקמות פחות נגישות, כגון הריאות, מוגבל בהרבה, מכיוון שמחקרים על דגימות רקמת ריאה אנושיות, במיוחד מאנשים בריאים, הם נדירים. עבודה זו מציגה אסטרטגיה ליצירת אפיון מרחבי ופנוטיפי מפורט של DCs השוכנים ברקמת ריאה בבני אדם בריאים העוברים ברונכוסקופיה לדגימת ביופסיות אנדוברונכיאליות. ניתן לאסוף מספר ביופסיות קטנות מכל אדם וניתן להטמיע אותן לאחר מכן לחתך אולטרה-דק או לעכל אנזימטית לניתוח ציטומטרי זרימה מתקדם. הפרוטוקולים המתוארים עברו אופטימיזציה כדי להפיק מידע מקסימלי מדגימות רקמה קטנות אשר, בתנאי מצב יציב, מכילות רק תדר נמוך של DCs. בעוד שהעבודה הנוכחית מתמקדת ב-DCs, ניתן להרחיב ישירות את השיטות המתוארות כך שיכללו תאים אחרים (חיסוניים) מעניינים הנמצאים ברקמת הריאה הרירית. יתר על כן, הפרוטוקולים חלים ישירות גם על דגימות המתקבלות מחולים הסובלים ממחלות ריאה שבהן ברונכוסקופיה היא חלק מקביעת האבחנה, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סרקואידוזיס או סרטן ריאות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאות נמצאות בקשר רצוף עם הסביבה החיצונית ונחשפות מאוד לשני חלקיקים וחיידקים מזיקים עם היכולת לגרום למחלה. לכן, חשוב עבור מערכת החיסון לעלות תגובה חיסונית חזקה נגד פתוגנים פולשים, אך חשוב לא פחות לשמור על סובלנות לאנטיגנים בשאיפה כי אינו גורם למחלות. כדי לספק מעקב חיסוני חזק, מערכת הנשימה היא מצופית עם רשת של תאי מערכת חיסון, כוללים תאים דנדריטים (DCS). DCs הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן עם היכולת הייחודית להפעיל תאי T נאיביים. בריאות האדם, DCS תושב נתקלים אנטיגן ולאחר מכן תהליך ולהעביר אותה אל קשרי הלימפה לנקז-ריאה להגשה והפעלה של תאי T 1, 2, 3.

במערכת החיסון האנושית, DCS ניתן לחלק לכמה קבוצות משנה, עם distinct אבל פונקציות חופפות: CD1c + ו- CD141 + DCs מיאלואידית (MDCs) ו CD123 + DCs plasmacytoid (PDC) 4, 5. בעוד שרוב ידעתי מפורט על אדם DCs נובע ממחקרים בדם, עכשיו זה ברור כי ריאות אדם הנמל גם אוכלוסיות נדירות של תת DC עם קיבולת 6 גירוי תאי T, 7, 8, 9. עם זאת, הנתונים המצטברים מראים כי תאי חיסון, כולל DCS, נבדלים תדירות, פנוטיפ, ותפקודם בהתאם למיקום האנטומי שלהם 10. לכן, חשוב ללמוד תאים חיסוניים מן הרקמה הרלוונטית להבין תרומתם החסינה וסובלנות מקומיות. יחדיו, זה מדגיש את הצורך בלימוד DCS-תושב ריאות כאשר פונים מחלות ריאה, למרות DCs הדם להיות בקלות יותר זמין ונגיש בבני אדם.

המחקרים הראשונים שחקרו DCs תושב-ריאות בבני האדם הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה הביטוי של סמנים יחידים, כגון HLA-DR ו CD11c, בסעיפי רקמות באמצעות אימונוהיסטוכימיה 11, 12, 13. לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה יותר בדרך כלל יש לסמוך על תזרים cytometric מנתח ללמוד תת תא החיסון שונה. עם זאת, מאחר וקשה למצוא סמנו על פני קרום תא יחיד המזהה באופן ייחודי משנה DC ספציפי, ההגבלה הפוטנציאל של מחקרים החלימה רק בארבעת צבעים cytometry זרימה הוא הסיכון כולל אוכלוסיות תאים עם סמנים פנוטיפי דומים כמו DCs. לדוגמה, CD11c מתבטא בכל DCs מיאלואידית ואת הרוב המכריע של מונוציטים. מצד השני, במחקרי החלת לוחות cytometry זרימה מתקדמים יותר, רקמת ריאה שאינה סרטנית כריתות כירורגית של חולים בדרך כלל שמשהXref "> 10, 14, 15, 16, אם כי לא ברור אם האוכלוסיות הנדירות אלה הן מייצגים את חומר שבאמת נוכחי DCs בנבדקים בריאים. בסך הכל, מחקרים מוגבלים במידה רבה בשל העובדה כי בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר.

כדי להתגבר על כמה מגבלות אלו, עבודה זו מתארת ​​כיצד לבצע ניתוח מפורט של הפריסה המרחבית וכן זיהוי פנוטיפי של DCs בביופסיות endobronchial הרירית המתקבל מתנדבים בריאים שעברו ברונכוסקופיה. ביופסיות קטנות אחדות ניתן לאסוף כל פרט ולאחר מכן יכולות להיות מוטבעת עבור חתך וניתוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה או מתעכלת enzymatically עבור ניתוח התזרים cytometric מתקדם. באמצעות רקמת הריאה בצורה של ביופסיות endobronchial המתקבל bronchoscopies מקנה יתרון של מה שהופך אותו ניתן לבצע את study על מתנדבים בריאים, בניגוד ניתוח פתוח של הריאות כי, מסיבות מובנות, הוא מוגבל לחולים הדורשים ניתוח חזה. יתר על כן, אותה הרקמה תדגם במהלך ברונכוסקופיה ממתנדבים בריאים נורמלית מבחינה פיזיולוגית, בניגוד אזור שאינו מושפע של רקמת ריאה בחולים עם מחלת ריאות. מצד השני, הביופסיות קטנות ומספר התאים להיאסף, גם כאשר איגום ביופסיות כמה, מגבילים את סוג הניתוחים שניתן לבצע.

בעוד העבודה הנוכחית מתמקדת DCS, השיטות שתוארו ניתן להרחיב ישירות לכלול אחרים (חיסוניים) תאים בעלי עניין הנמצאים ברקמת ריאה רירית אדם. יתר על כן, פרוטוקולים חלים גם ישירות דגימות שהתקבלו מחולים הסובלים ממחלות ריאות שבו ברונכוסקופיה היא חלק בהקמת האבחנה, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סרקואידוזיס, או סרטן ריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: מחקר זה אושר על ידי המועצה לביקורת האתית האזורית Umeå, שוודיה.

1. ברונכוסקופיה עבור דגימת Endobronchial ביופסיות מ בבני אדם

  1. קבלת הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
  2. פנקו את הנושאים עם midazolam הפה (4-8 מ"ג) ו glycopyrronium תוך ורידי (0.2-04 מ"ג) 30 דקות לפני ברונכוסקופיה. החל הרדמה מקומית עם לידוקאין הגרון הסמפונות. בואו מגרגרים הנושא עם ~ 3 מ"ל של לידוקאין 4% ולהחיל 3 מ"ל לבסיס הלשון לתוך הגרון באמצעות מזרק הגרון. מטב את ההרדמה המקומית עם 8-10 מנות של ספריי לידוקאין. ביצוע שלב זה עם הישיבה בנושא.
  3. הכנס ברונכוסקופ וידאו גמיש דרך הפה באמצעות שופר פלסטיק עם הנושא במצב שכיבה. השתמש קטטר ספריי מתוצרת בכוונה כדי להשלים את ההרדמה המקומית של קנה הנשימה הסמפונות דיסטלי באמצעות ברונכוסקופ. הנה, להשתמש במינון של כ5-10 מ"ל של 2% לידוקאין.
  4. קח 6-9 ביופסיות ברירית endobronchial מ קארינה הראשי לבין חטיבות סימפונות הראשיות באמצעות מלקחי fenestrated (איור 1). בעקבות ברונכוסקופיה ולפני שעזב את בית החולים, ולתת לשאר הנושא במשך 2-4 שעות ולספק לו / לה עם ארוחה קלה.

2. הטמעת ביופסיות ב גליקול Methylacrylate (GMA) שרף

הערה: פרוטוקול immunostaining GMA פותחה במקור באוניברסיטת סאות'המפטון, היסטוכימיה יחידת המחקר 17.

  1. קיבוע: אימונוהיסטוכימיה, להסיר את ביופסיות מן מלקחיים ומניחים אותם ישירות לתוך צלוחיות זכוכית המכיל 3 מ"ל של מעכבי פרוטאז ואצטון מיובש קר כקרח (פלואוריד phenylmethylsulfonyl (35 מ"ג / 100 מ"ל אצטון) ו iodoacetamide (370 מ"ג / 100 מ"ל אצטון )). לתקן את רקמת הלילה ב -20 ° C (איור 2).
    הערה: השלבים הבאים יש performed במנדף עם כפפות ניטריל מתאימות. ערכת הטבעה מכיל רכיבים שעלולים לגרום לרגישות, גירוי, ו / או תגובה אלרגית בעור. כל הפסולת חייבת להיות מסולקת פסולת מסוכנת כמו.
  2. התייבשות: הסר את אצטון עם מעכבים ולהחליף עם אצטון המיובש הטרי (ללא מעכבים) במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT). הסר אצטון ולהחליפה בנזואט מתיל במשך 15 דקות.
  3. הסתננות: כן פתרון עיבוד של פתרון בנזואט 5% מתיל מונומר methacrylate גליקול; 10 מיליליטר מספיק עבור בקבוקון אחד. באמצעות טפטפות פסטר מפלסטיק, שאיבה את הפתרון בנזואט מתיל ולהחליף עם 3 מ"ל של תמיסת עיבוד. דגירת ביופסיות פתרון עיבוד עודף על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות; טפטפות פסטר יכולה לשמש את כל שינויי הפתרון שלאחר מכן, כולל הטבעת פתרון.
  4. להחליף את פתרון עיבוד כל שעה 2 (3x 2 incubations hr), אז בפעם חדירה הכולל של ביוpsies בפתרון העיבוד הוא לפחות שעה 6. הכנס מדבקות נייר לתוך הקצה העליון של קפסולות הטבעה לזהות הביופסיות.
  5. הכן פתרון הטבעה של בנזואיל פרוקסיד 75 מ"ג ב 10 מ"ל של מונומר methacrylate גליקול. להוסיף 0.25 מ"ל של N, פולי N -dimethylaniline (אתילן אוקסיד) (מאיץ) לפתרון הטבעה כדי להתחיל את התגובה פילמור. הסר את פתרון העיבוד ומניח ביופסיה אחת לתוך הקפסולה ההטבעה הרלוונטי באמצעות מלקחיים.
  6. לאט למלא את הקפסולה ההטבעה לפסגה עם הטבעת פתרון ולסגור את המכסה. הימנע מפריע הביופסיה ויצירת בועות אוויר גדולות. דגירה הכמוסה ב 4 ° C. עד השרף יש polymerized לחלוטין.
  7. אחסן את הביופסיות המוטבעות ב -20 ° C בתוך שפופרת 50 מיליליטר המכילה כ 5 גרם של ג'ל סיליקה.

3. חתך של ביופסיות Endobronchial GMA-מוטבע

  1. ציפוי שקופיות מיקרוסקופ: שטפו את השקופיות למיקרוסקופמדיח כלים על מחזור רגיל. מכסים את השקופיות ולאפשר להם אוויר יבש.
  2. כן פתרון ציפוי של 10% פולי- L- ליזין (PLL) פתרון במים מזוקקים. להטביע את שקופיות פתרון ציפוי למשך 5 דקות, ולאחר מכן לתת להם להתייבש באוויר. אחסן שקופיות PLL מצופה יבש בקופסאות המקוריות שלהם.
  3. לשטוף רצועות זכוכית וכו 'עם 0.1% Tween 20 במים מזוקקים. יש לשטוף את הזכוכית עם 70% אתנול ו יבש עם מגבות נייר. חותך להבי זכוכית מרצועת הזכוכית באמצעות יצרנית סכין. אחסן את הלהבים במכל המונע תנועה על מנת להבטיח כי חוד החנית לא ולהינזק או פצע.
  4. ביופסית זמירה: מניח את הקפסולה ביופסית מפצל הקפסולה ולכרות כל צד באמצעות סכין חד קצה פחמן פלדה. סר ביופסית GMA-מוטבעת ולמקם אותו היטב סגן. חתוך עודף GMA מרחבי הביופסיה באמצעות להב הפלדה.
  5. חתך GMA.
    1. כן פתרון אמוניה 0.05% עם מים מזוקקים. מניח את סכין זכוכית ביופסיה ב הדואר microtome. בזהירות ליישר את בלוק הביופסיה עם הלהב ידי התאמת בעל סכין ואת הזווית של בלוק הביופסיה כך להב המוטלת שטוח נגד פני השטח של הבלוק.
    2. חותכים 2 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות microtome על מהירות חיתוך איטי להשתמש במלקחיים להעביר ולהציף חלקים על פני המים אמוניה. Float בסעיפים עבור 45-90 שניות, המאפשר אחזור אנטיגן עדין ופתיחה של הסעיף.
    3. תרים קטעים עם שקופיות מיקרוסקופ. בדוק את היסטולוגיה ביופסיה על ידי צביעה במהירות עם toluidine כחול.
    4. לייבש את השקופיות על סט צלחת חמה עד 50 מעלות צלזיוס וליישם 500 μl של כתם כחול toluidine מסוננים קטע בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק. מומלץ לחמם את החלק על הצלחת החמה עד טבעת ירוקה מתחילה להסתמן בקצה הכתם, ולאחר מכן לשטוף אותה עם מים.
    5. באמצעות מיקרוסקופ אור, לבדוק את היסטולוגיה ביופסיה. סעיפים המשמשים אימונוהיסטוכימיה יכילו אזורים טובים של lamina הניזוקpropria אפיתל, עם בלוטות מעטות ככל ואת שריר חלק כמה שפחות.
    6. כמו בסעיף 3.4.2, לחתוך קטעים שיש היסטולוגיה טוב לאסוף אותם עם שקופיות מיקרוסקופ PLL מצופה מכתים immunohistochemical. חותכים לפחות שני קטעים מתוך כל ביופסיה לניתוח. מגלשות יבשות לפחות שעה 1. לאחר ייבוש, ניתן לזהות קטעים עטופים בנייר כסף פח ומאוחסן ב -20 ° C עד 2 שבועות, או שהם יכולים להיות immunostained מייד.

4. מכתים immunohistochemical של ביופסיות Endobronchial GMA-מוטבע

הערה: אזיד הנתרן הוא רעיל. הכן את הפתרון אזיד הנתרן 0.1% בתוך במנדף והרחק חומצות. לתקשר עם חומצות משחררות גזים רעילים.

  1. צייר את מיקומם של חלקים באמצעות עט יהלום שהקצה ולסדר את השקופיות על מתלה מכתימה.
  2. בצע בלוק Peroxidase. כן פתרון לחסום peroxidase של חמצן 0.3% מימן בתמיסה יזיד הנתרן 0.1%. Apply 1 מ"ל של גוש peroxidase סעיפים דגירה במשך 30 דקות.
  3. כן פתרון לשטוף של 0.05 מ 'טריס שנאגר מלוח (TBS), pH 7.6. שטפו את השקופיות TBS, 3x 5 דקות.
  4. כן פתרון לחסום BSA 1% ב DMEM. האם זה מראש בכמויות גדולות, aliquot ומקפיאים עד הצורך. מסננים את השקופיות ו דגירת מקטעי פתרון לחסום למשך 30 דקות כדי לחסום מחייב נוגדן ספציפי. אם מחייב נוקב עדיין מתרחש, כולל שלב דגירה 30 דקות עם גוש סרום 5% מאותו המין כמו נוגדנים משני.
  5. לדלל הנוגדן הראשוני (CD45 או CD1a) ב TBS לריכוז הרצוי (CD45 מדולל ב 1: 1,000; CD1a מדולל ב 1: 1,00) ולהחיל אותו על שקופיות. Coverslip בסעיפים ו דגירה לילה ב RT.
  6. לשטוף שקופיות ב TBS שלוש פעמים. לדלל נוגדנים משני biotinylated (מכוונת נגד הפונדקאי נוגדן ראשוני, ארנב במקרה זה אנטי עכבר F (ab '2)) ב TBS לריכוז הרצוי (1:300 דילול) ולהחיל אותו על שקופיות. דגירה עבור שעה 2 ב RT.
  7. כן 30 דקות מורכבות ביוטין-peroxidase streptavidin לפחות לפני השימוש. ודא שיש מספיק כדי לכסות את כל השקופיות. שטפו את השקופיות TBS שלוש פעמים. החל פתרון השקופיות ו דגירה של שעה 2 ב RT.
  8. שטפו את השקופיות TBS שלוש פעמים. כן 3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC) פתרון מצע peroxidase (עשה בהתאם להוראות היצרן). ולהחיל אותו על שקופיות דגירה במשך 20-30 דקות או עד עוצמת הכתם הרצויה מתפתחת.
  9. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מהברז למשך 5 דקות. Counterstain את החלקים עם פתרון haematoxylin של מסוננים מאיירים למשך 2 דקות. שטפו את השקופיות במים זורמים מהברז למשך 5 דקות.
  10. מסנן את השקופיות ולכסות את החלקים עם הרכבה בינונית מימי קבע. ייבש את השקופיות ב 80 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש. אפשר השקופיות להתקרר, ולאחר מכן לטעון אותם עם DPX ומקום coverslip.

5. Stניתוח aining

  1. לנתח את הסעיפים בהגדלה 40X באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצלמה רכובה המחוברת למחשב.
    הערה: לקבלת ניתוח הסלולר, רוזן מוכתם חיובי, תאי בעלי גרעין בתוך שכבת הרירית מיוחדת הסמפונות האפיתל ללא פגע, למעט באזורים של שריר חלק, בלוטות, כלי דם גדולים, ורקמות תואמות או פגומות.
  2. הממוצע את ספירת התאים ולתקן את ספירת התא הממוצעת באזור של שכבת הרירית מיוחדת ואת האורך של האפיתל. האזור של שכבת הרירית המיוחדת ואורך האפיתל ניתן לחשב באמצעות תוכנית ניתוח התמונה.

6. אנזימתי עיכול של ביופסיות Endobronchial

  1. ביופסיות כביסה: בעזרת מלקחיים סטריליות, ביופסיות שלם ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת בופר של האנק (HBSS) (איור 3). דגירה במשך 5 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד. מעביר את הביופסיות על ד סטריליish באמצעות אחסון התוכן של הצינור 15 מ"ל עם HBSS.
  2. שיבוש ריר עם DTT: החלף את HBSS בצינור עם 10 מ"ל של HBSS המכיל 5 1,4-dithiothreitol מ"מ (DTT). מעביר את הביופסיות בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות מלקחיים סטרילית. דגירה במשך 15 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד.
  3. וורטקס הצינור בעדינות במשך 15 שניות. מעבירים את ביופסיות על צלחת סטרילי באמצעות אחסון התוכן של הצינור 15 מ"ל עם HBSS DTT.
  4. העברת ביופסיות עד בינוני התרבות: החלף את HBSS DTT בצינור עם 10 מ"ל של מדיום תרבות RPMI 1640. מעביר את הביופסיות בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר באמצעות מלקחיים סטרילית. דגירה של 10 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה ב 30 סל"ד.
  5. לעכל ביופסיות עם collagenase ו DNase.
    1. הכן פתרון העיכול של collagenase השנייה (0.25 מ"ג / מ"ל) ו DNase (0.2 מ"ג / מ"ל) ב RPMI מחומם מראש המכיל 1 פתרון M HEPES. הוספת 500 μL של פתרון העיכול לכל היטב כת רקמת 48-היטב צלחת יור.
    2. מקום 1 ביופסיה לכל היטב פתרון העיכול. דגירה את הצלחת על פלטפורמת רעד במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 220 סל"ד. עד פיפטה ומטה לאחר 30 דקות מחדש לפזר את הביופסיות, ולאחר 60 דקות, כדי disaggregate לחלוטין את הרקמה.
  6. הכנת תרחיפים תא בודד.
    1. ברכה יחד הביופסיות מתעכלות מבאר לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי העברתו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. אוסף את התאים הנותרים על ידי שטיפת הבארות עם חיץ FACS קר כקרח (בופר פוספט (PBS) בסרום שור 2% עובריים המכיל).
    2. סוחטים את הרקמה הנותרת על מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה של המזרק. בצנטריפוגה תאים מתעכל ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ FACS קר כקרח. ספירת התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer כתם כחול Trypan כדי להעריך את הכדאיות של תאים.

= "Jove_title"> 7. ניתוח תזרים Cytometric של תאים בודדים של ביופסיות Endobronchial לאחר אנזימתי עיכול

  1. Resuspend התא גלולה של כ 1 x 10 6 תאים 200 μl של חיץ FACS.
  2. הוספת צבע כדאיויות תא להוצאת תאים מתים על פי הפרוטוקול של היצרן.
  3. הוסף 5 μl של מגיב חסימת FCR דגירה במשך 5 דקות ב 4 °.
  4. הוספת נוגדנים פני התא נגד CD45 (2 μl), השושלת (CD3, CD20, CD56, CD66abce, ו CD14; 2 μl כל אחד), CD16 (0.5 μl), HLA-DR (3 μl), CD11c (5 μl), CD123 (5 μl), CD1c (3 μl), ו CD103 (2 μl) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 °. פרטים על נוגדנים ניתן למצוא בסעיף שיטות, אבל לכייל לייעל את הנוגדנים לזרימה המדויקת cytometer בשימוש. לשטוף נוגדנים עודפים עם PBS במשך 5 דקות ב g x 400. רוכשים את הדגימות טריות על cytometer זרימה או לתקן את תאי paraformaldehyde 1% לפני acquisit מאוחר יותריוֹן.
  5. זהה DCs האנושי בביופסיות ריאות באמצעות זרימת cytometry assay 18 (איור 4).
    הערה: שימוש cytometry זרימה תוכנת ניתוח, תאי מערכת החיסון נבדלים מתאי ריאה אחרות על ידי gating על CD45. תאים מתים ניתן לשלול כתאים כי הם חיוביים עבור צבע חי / מת. מכל CD45 + תאי החיים, תאי שושלת (תאי B, תאי T, תאי NK, נויטרופילים, מונוציטים ו) ניתן לשלול באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14, CD16 ו בערוץ אחד. לאחר מכן, HLA-DR + תאים יאפשר זיהוי של כל DCs האנושי. MDCs ניתן להבחין בין PDCs מבוסס על הביטוי של CD11c או חוסר CD11c, בהתאמה. MDCs ניתן לחלוקה נוספת לתוך CD1c + MDCs או CD141 +.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים לאפיון תאים חיסוניים רקמות תושב נשימה של אדם, כולל DCS, מוגבלים, בעיקר בשל העובדה כי הוסרו בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר. כאן, שיטה פחות פולשנית קבלת רקמת הריאה ביופסיות endobronchial (גאות) של מתנדבים בריאים ופרוטוקולים פותח על מנת ללמוד את תאי מערכת החיסון של רקמות באמצעות אימונוהיסטוכימיה או cytometry זרימה מתוארים.

מתנדב בריא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר כיצד ליצור אפיון מרחבי phenotypical מפורט של DCs ריאות רקמות תושב בבני אדם בריא באמצעות אימונוהיסטוכימיה וזרימת cytometry על ביופסיות ברירית endobronchial שנאספו במהלך ברונכוסקופיה. בפסקאות הבאות צעדים קריטיים בפרוטוקול הם דנו בפירוט.

קריטיים שלבים עם הפרוטוקול

חתך אימונוהיסטוכימיה: זה קריטי כדי לשמור על בלוקים ביופסיה ב -20 ° C כאשר ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות למתנדבים שתרמו חומר קליני למחקר זה. אנחנו גם להודות מקרב לב לצוות במחלקה לבריאות הציבור ורפואה קלינית, המחלקה לרפואת רפואה / הנשימה, בית החולים האוניברסיטאי, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) לאיסוף כל החומר הקליני.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AS-S ממועצת המחקר השוודי, קרן הלב-ריאות שוודית, קרן שוודית למחקרים אסטרטגיים, ואת קרולינסקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160מקור אור OlympusBF1T160
Olympus OlympusExera CV-160
מלקחיים מחובריםOlympusFB21Cמשמש ללקיחת ביופסיות
בלוק נשיכהConmed142920 מ"מ x 27 מ"מ
גלוקוז 25% 500 מ"ל תוך ורידי
גליקופירוניום ברומיד 0.2 מ"ג/מ"לתוך ורידי. מונע הפרשת ריר/רוק
Mixt. מידזולם 1 מ"ג/מ"ל לערךניתן להשתמש להרפיה נוספת
לידוקאין, 40 מ"ג/מ"למתן פה וגרון /
תרסיסניתן לחלק האחורי של הגרון
תרסיסניתן באמצעות ברונכוסקופ לדרכי הנשימה
<חזק>עיבוד והטמעה של GMA
בקבוקוני5 מ"ל
אצטוןסיגמא-אולדריץ'32201-1L
מסננות מולקולריות, 4 & #197;אלפא אסאר88120כדורים בקוטר 3-4 מ"מ
פנילמתיל-סולפוניל פלואורידסיגמא-אולדריץ'P-76260.035 גרם/100 מ"ל אצטון
יודואצטמידסיגמא-אולדריץ'I-61250.37 גרם/100 מ"ל אצטון
פוליאתילן-שטוח  קפסולות הטמעה TAABמעבדות TAABC094500x 8 מ"מ קוטר, פוליאתילן, קפסולות עם תחתית שטוחה
מחזיק קפסולה מעבדותTAABC054מכיל 25 קפסולות 8 מ"מ
ערכת הטבעה JB-4 GMAPolysciences00226מכיל תמיסה JB-4 A (0026A-800), תמיסת JB-4 B (0026B-3.8), בנזואיל פרוקסיד (02618-12)
מתיל בנזואטסיגמא-אולדריץ'27614-1L
סיליקה ג'ל עם מחוון לחותScharlauGE00432.5-6 מ"מ 
<חיתוך חזק>GMA
זכוכית שקופיות מיקרוסקופThermoFisher Scientific10143562CEFקצוות חתוכים, קצה חלבי
תמיסת פולי-L-ליזיןSigma-AldrichP8920-500mL1:10 לפתרון עבודה
רצועות זכוכית גיליון לאולטרה-מיקרוטומיהAlkar
Tween 20Sigma-AldrichP2287לשטוף פתרון (0.1% Tween20)
LKB 7800B יצרנית סכיניםLKB
מפצל קפסולותמעבדות TAABC065
להבי קצה יחיד מפלדתפחמן מעבדות TAABB054
Vice
אמוניה, 25%VWR1133.10002 מ"ל ב -1 ליטר, 1:500 (0.05%)
MicrotomeLeicaLeica RM 2165
מקור אורLeicaLeica CLS 150 XE
מיקרוסקופ עם מעמד זרוע נדנדהLeicaMZ6
<חזק>GMA אימונוהיסטוכימיהעט
עם קצה יהלוםHistolab5218
מי חמצן 30% תמיסהAnalaR Normapur23619.264
נתרן אזידSigma-AldrichS8032
TrisRoche10708976001
נתרן כלוריVWR כימיקלים27810.295
אלבומין סרום בקרMillipore82-045-2Probumin BSA דרגת אבחון
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)Sigma-AldrichD5546
נוגדן CD45 אנטי אנושיBioLegend304002עכבר חד שבטי, שיבוט HI30, איזוטיפ IgG1k. ריכוז עבודה של 500 ננוגרם/מ"ל
נוגדן CD1a אנטי אנושיAbD SerotechMCA80GAעכבר חד שבטי, שיבוט NA1/34-HLK, איזוטיפ IgG2a. ריכוז עבודה של 10 ומיקרו; g/ml
עכבר מונוקלונלי IgG1 איזוטיפ בקרתAbcamab27479
עכבר חד שבטי IgG2a איזוטיפבקרת DakoX094301-2
Vectastain ABC Elite ערכה סטנדרטיתVector LabsPK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) עפיפון מצע פרוקסידאזVector LabsSK-4200
Mayers haematoxylinHistoLab01820
הרכבה מימית קבועה בינוניתAbD SerotechBUF058C
ייבוש
DPX פתרון הרכבה קבועה VWR360292F
מיקרוסקופ אורLeicaLeica DMLB
מצלמת מיקרוסקופLeicaLeica DFC 320
תוכנת ניתוחLeicaLeica Qwin V3
<עיכול אנזימטי חזק>
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)סיגמא-אולדריץ'55021C
דיתיותרייטול (DTT)סיגמא-אולדריץ'DTT-RO
קולגנאז IIסיגמא-אולדריץ'C6885
DNaseסיגמא-אולדריץ'10104159001  ROCHE
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758
מלקחיים
פלטפורמת נדנדהגרנט מכשיריםPMR-30
50 מ"ל צינורות חרוטייםפלקון14-432-22
40 ומיקרו; מסננת תאיםm Falcon352340
<חזק>ציטומטריית זרימה
פוספט חוצץ מלח (PBS)
LIVE/DEAD Aqua ערכת כתמי תאים מתים הניתנת לתיקוןLife TechnologiesL34957
CD45BD555485
CD3BD557757
CD20BD
CD56Biolegend318332
CD66abceMiltenyi130-101-132
HLA-DRBD
CD14BD557831
CD16Biolegend302026
CD11cBD560369
CD1cMiltenyi130-098-009
CD141Miltenyi130-090-514
CD103Biolegend350212
ParaformaldehydeSigma-AldrichF8775
LSR II ציטומטר זרימהBDציטומטר זרימה
FlowJoFlowJoתוכנה לניתוח
לידוקאין גרגור 100 מ"ג/מ"ל לידוקאין 20 מ"ג/מ"ל זכוכית תנור 335829 555813

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים