איתות חריץ הוא צורה של תקשורת סלולרית המסתמכת על מגע ישיר בין תאים. כדי לגרום כראוי לאיתות Notch במבחנה, יש להציג ליגנדים של Notch לתאים במצב משותק. פרוטוקול זה מתאר שיטות לגירוי חוץ גופי של איתות Notch במבשרי אוסטאוקלסטים של עכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
איתות חריץ הוא מרכיב מרכזי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים מרובים. עם זאת, טבעו של איתות Notch הופך את החקירה במבחנה של תפקידיו השונים ולעתים הסותרים לאתגר. כמרכיב של תקשורת ישירה בין תאים הן עם קולטנים והן עם ליגנדים הקשורים לקרום הפלזמה, לא ניתן להפעיל איתות Notch במבחנה על ידי הוספה פשוטה של ליגנדים לאמצעי התרבית, כפי שאפשרי במסלולי איתות רבים אחרים. במקום זאת, יש להציג ליגנדים של Notch לתאים במצב משותק.
וריאציות בשיטות הפעלת איתות Notch יכולות להוביל לתוצאות שונות בתאים מתורבתים. במבשרי אוסטאוקלסטים, במיוחד, הבדלים בשיטות של גירוי Notch ותרבית מבשר אוסטאוקלסטים והתמיינות הובילו למחלוקת האם איתות Notch הוא מווסת חיובי או שלילי של התמיינות אוסטאוקלסטים. בעוד שהשוואות קרובות יותר של התמיינות אוסטאוקלסטים בתנאי גירוי Notch שונים במבחנה ובמודלים גנטיים פתרו במידה רבה את המחלוקת לגבי איתות Notch ואוסטאוקלסטים, שיטות סטנדרטיות של גירוי רציף וזמני של איתות Notch בתאים מתורבתים יכולות למנוע פערים כאלה בעתיד.
פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לגירוי איתות Notch במיוחד במבשרי אוסטאוקלסטים של עכברים מתורבתים, אם כי שיטות אלה צריכות להיות ישימות לכל סוג תא דבק עם התאמות קלות. השיטה הראשונה מייצרת גירוי מתמשך של איתות Notch וכוללת קיבוע ליגנד Notch למשטח תרבית רקמה לפני זריעת התאים. השני, המשתמש בליגנד Notch הקשור לחרוזי אגרוז מאפשר גירוי זמני של איתות Notch בתאים שכבר דבוקים למשטח תרבית. פרוטוקול זה כולל גם שיטות לזיהוי הפעלת Notch במבשרי אוסטאוקלסטים וכן סמני שעתוק מייצגים של הפעלת איתות Notch.
מבוא
מסלול איתות Notch היונק הוא הומולוגי לאותו המסלול ב תסיסנית והיא מורכבת מארבעה קולטנים Notch הטרנסממברני (Notch1-4) וחמישה הליגנדים קרום נכנס של Jagged (JAG1 & JAG2) ודלתא הדמוית (DLL1, 3, & 4) משפחות 1. איתות Notch מופעלת כאשר הקולטן Notch על תא מקבל מחויב ליגנד על תא שידור 2. במהלך הפעלה טראנס זה, ליגנד Notch הקרום נכנס מייצר כוח מתיחה על קולט Notch הקרום נכנס 3, 4. הכח המתיח של ליגנד מחייב גורם לשינויי קונפורמציה הקולטן Notch המאפשרים מחשופות תאים של הקולטן על ידי TNFalpha המרת אנזים (TACE) ואחריו אירוע מחשוף ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בהתאם פרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי החיים המוסדי פנסילבניה ועדת שימוש (IACUC).
1. הכנת מדיה ותרבות
- הכן α-MEM ידי המסת מדיום חיוני מינימום אבקת (MEM) ו סודיום ביקרבונט 1.9 גרם ב 900 מ"ל H 2 O ו להשלים עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו -100 מ"ל תרמי בסרום שור עובר מומת. לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר polyethersulfone (PES).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מטרת השיטה היא התרבות לעורר Notch איתות מבשר osteoclast. כאשר כראוי תרבותי, מבשרי osteoclast להפגין מורפולוגיה ציר בצורה מוארכת בעיקר עם הציטופלסמה חלקה (איור 1 א). יש להקפיד כדי להימנע מהפעלת אימונולוגיים של מבשרי osteoclast. לאחר ההפעלה, מבשרי להתפשט ולהפוך שטוח עם הציטופלסמה מקציף (איור 1B). אלה "ביצת עין" תאים עמידים איתות RANK ואינו מבחינים ביעילות לתוך osteoclasts הבוגרת. בתנאי התרבות והתמיינות נכונ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
תרבות בידול במבחנה של מבשרי osteoclast מספקת פלטפורמה שימושית לחקירה של מנגנונים מולקולריים של osteoclastogenesis וזיהוי מטרות טיפוליות עבור התחדשות עצם ושימור מסת עצם. כאשר culturing מבשר osteoclast העכבר, האלמנט הקריטי ביותר הוא תחזוקה של מבשרים במצב נאיבי. ככל שתאי מקרופאג דמוי, מבשרי האוסטאוקלסטים הם דרוכים להגיב לרכיבים חיידקי וציטוקינים פרו-דלקתיים. לאחר ההפעלה, מבשרי oste.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז להפרעות שרירים ושלד באוניברסיטת פנסילבניה (5 P30 AR050950-09), מענק מקרן AO (S-16-12A), מרכז המחקר התרגומי של המרכז הרפואי פילדלפיה וירג'יניה, וקרן פיתוח מחקר מחלקתי לכירורגיה אורתופדית תוך-מוראלית. JWA נתמכת על ידי מלגת ההזדמנויות לפוסט-דוקטורט במחקר והוראה של אוניברסיטת פנסילבניה (PENN-PORT) הממומנת על ידי פרס המחקר המוסדי ופיתוח הקריירה של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכבר רקומביננטי M-CSF | Biolegend | 576402 | זמין ממספר ספקים, פעילות בדיקה לפני ניסויים |
| עכבר רקומביננטי RANKL | Shenandoah ביוטכנולוגיה | 200-04 | זמין ממספר ספקים, פעילות בדיקה לפני ניסויים |
| רקומביננטי אנושי משונן1-Fc | R& D Systems | 1277-JG-050 | זמין ממספר ספקים, פעילות בדיקה לפני ניסויים |
| חרוזי אגרוז חלבון | G InvivoGen | gel-agg-2 | |
| עז אנטי אנושי IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| מינימום חיוני בינוני אבקה | סיגמא-אולדריץ' | M0894 | |
| מגיב דיסוציאציה של תאי Accutase | ThermoFisher | A1110501 | משמש להרמת מבשרי אוסטאוקלסטים |
| חומצה פוספטאז, ערכת לויקוציטים (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | משמש לצביעה של אוסטאוקלסטים מובחנים |
מקורות
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
