הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

10K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55235

⸱

20 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

במאמר זה

סיכום

מודלים מערכתיים ומקומיים של זיהום דג זברה לנגיף שפעת אנושי A. באמצעות מודל זיהום מערכתי, ניתן להשתמש בדג הזברה לבדיקת תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות מודל זיהום מקומי, ניתן להשתמש בדג הזברה כדי לאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח.

תקציר

בכל שנה, התפרצויות שפעת עונתיות משפיעות עמוקות על חברות ברחבי העולם. למרות המאמצים הגלובליים, שפעת נותרה נטל בריאותי בלתי פתיר. האסטרטגיה העיקרית לצמצום ההדבקות היא חיסון שנתי. אצל אנשים שנדבקו בשפעת, תרופות אנטי-ויראליות יכולות להקל על התסמינים. יש צורך ברור ובלתי מסופק לפתח אסטרטגיות חלופיות למאבק בשפעת. מספר מודלים של בעלי חיים נוצרו כדי לדגמן אינטראקציות בין פונדקאי לשפעת. כאן, מתוארים פרוטוקולים ליצירת מודלים של דג זברה לזיהום מערכתי ומקומי של נגיף שפעת אנושי A (IAV). באמצעות מודל זיהום IAV מערכתי, ניתן לסנן מולקולות קטנות בעלות פעילות אנטי-ויראלית פוטנציאלית. כהוכחה עקרונית, מתואר פרוטוקול המדגים את יעילותה של התרופה האנטי-ויראלית זנמיביר בדגי זברה נגועים ב-IAV. הוא מראה כיצד ניתן לכמת פנוטיפים של מחלות כדי לדרג את היעילות היחסית של אנטי-ויראלים פוטנציאליים בדגי זברה נגועים ב-IAV. בשנים האחרונות גברה ההערכה לתפקיד הקריטי שנויטרופילים ממלאים בתגובת המארח האנושי לזיהום בשפעת. דג הזברה הוכיח את עצמו כמודל הכרחי לחקר הביולוגיה של הנויטרופילים, עם השפעות ישירות על הרפואה האנושית. מתואר פרוטוקול ליצירת זיהום IAV מקומי בקו דג הזברה Tg(mpx:mCherry) לחקר ביולוגיה של נויטרופילים בהקשר של זיהום ויראלי מקומי. גיוס נויטרופילים לאתרי זיהום מקומיים מספק פנוטיפ נוסף הניתן לכימות להערכת מניפולציות ניסיוניות שעשויות להיות להן יישומים טיפוליים. שני הפרוטוקולים של דג הזברה תיארו נאמנה היבטים של זיהום IAV אנושי. למודל דג הזברה יתרונות מובנים רבים, כולל פוריות גבוהה, בהירות אופטית, התאמה לבדיקת תרופות וזמינות של קווים טרנסגניים, כולל אלה שבהם תאים חיסוניים כגון נויטרופילים מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים. הפרוטוקולים המפורטים כאן מנצלים את היתרונות הללו ויש להם פוטנציאל לחשוף תובנות קריטיות לגבי אינטראקציות בין מארח ל-IAV שעשויות בסופו של דבר להיות מתורגמות למרפאה.

מבוא

על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), נגיפי שפעת להדביק 5-10% של מבוגרים 20-30% מהילדים בשנה ולגרום 3-5 מיליון מקרים של מחלה חמורה עד 500,000 מקרי מוות ברחבי העולם 1. חיסונים נגד שפעת שנתיים להישאר האפשרות הטובה ביותר כדי למנוע מחלות. מאמצים מהסוג תוכנית הפעולה העולמי WHO גדלו השימוש בחיסון העונתי, קיבולת ייצור החיסון, ומחקר ופיתוח לתוך אסטרטגיות חיסון חזקה יותר על מנת להפחית את התחלואה והתמותה הקשורים התפרצויות שפעת עונתית 2. תרופות אנטי-ויראליות כמו מעכבי נורמינידאז (למשל Zanamivir ו Oseltamivir) זמינות במדינות מסוימות ו הוכיחו יעיל בתסמינים מקילות, כאשר מנוהלות בתוך 48 שעות מהופעה 3 הראשונות, 4, 5. למרות מאמצים הגלובליים, הכלה של שפעת עונתית outbreaks עדיין מהווה אתגר עצום בשלב זה, כפי להיסחף אנטיגני וירוס שפעת לעיתים קרובות עולה היכולות הנוכחיות להסתגל הגנום המשתנה של הנגיף 6. אסטרטגיות חיסון מיקוד זנים של וירוס חדש יש לפתח מראש ולפעמים ניתנים פחות יעיל בצורה אופטימלית בשל שינויים בלתי צפויים סוגי זנים שבסופו של דבר שולטים מגיפת שפעת. מסיבות אלו, יש צורך ברור לפתח אסטרטגיות טיפוליות חלופיות המכיל זיהומים וצמצום תמותה. על ידי השגת הבנה טובה יותר של האינטראקציה המאכסנת-הווירוס, זה עשוי להיות אפשרי לפתח תרופות נגד שפעת חדשות וטיפולים אדג'ובנט 7, 8.

מארח השפעת האנושית וירוס (IAV) אינטראקציה מורכבת. במודלים של בעלי חיים כמה הידבקות בני אדם IAV פותחו על מנת לקבל תובנות לגבי האינטראקציה מאכסן-וירוס, including עכברים, שרקנים, חולדות כותנה, אוגרים, חמוסים, ואת קופי 9. תוך מתן מידע חשוב שיפרו את הבנת הדינמיקה מאכסן IAV, כל אורגניזם מודל בעל חסרונות משמעותיים כי יש לקחת בחשבון כאשר מנסים לתרגם את הממצאים רפואת האדם. לדוגמה, עכברים, שהן המודל הנפוץ ביותר, לא בקלות לפתח סימפטומים IAV הנגרמת זיהום כאשר נגוע בשפעת אדם מבודד 9. הסיבה לכך היא כי עכברים חסרי הכמיהות הטבעיות לשפעת אדם מבודדות מאז תאי אפיתל העכבר להביע α-2,3 קשרי חומצת sialic במקום α-2,6 קשרי חומצת sialic הביעו על תאים אנושיים אפיתל 10. חלבוני hemagglutinin נוכח אדם IAV מבודדים לאגד לטובה וזן תאי מארחי נושאות α-2,6 קשרי חומצת sialic באמצעות אנדוציטוזה מתווך קולטן 9, 11, 12, 13. כתוצאה מכך, הוא היום מקובל בפיתוח מודלי עכבר לשפעת אדם, יש להקפיד על מנת לשייך את המתח המתאים של עכבר עם הזן המתאים של שפעת על מנת להשיג פנוטיפים מחלה כי לשחזר היבטים של המחלה האנושית. לעומת זאת, תאי אפיתל דרכי הנשימה העליונות של חמוסים להחזיק α-2,6 קשרי חומצת sialic דומות 14 תאים אנושיים. חמוסים אינפקטד לשתף רבות מהתכונות פתולוגיים וקליניים שנצפתה מחלות אנושיות, כולל פתוגניות ויכולת ההעברה של נגיפי שפעת אנושית העופות 14, 15. הם גם מאוד מקובלים ניסוייים יעילות חיסון. עם זאת, המודל החמוס לשפעת אדם יש מספר חסרונות הקשורים בעיקר גודלן ועלות הגידול בעלי שהופכים רכישת סטטיסטית מובהקתנתוני צביעות מאתגרים. בנוסף, חמוסים הפגינו בעבר בדלים הפרמקוקינטיקה סמים, זמינות ביולוגית, ורעילות שהופכים יעילות בדיקות קשות. לדוגמה, חמוסים להפגין רעילות amantadine מעכב ערוץ יון M2 16. לפיכך, ברור כי בבחירה במודל חיה בחקר שאלות על זיהומי אדם IAV, חשוב לשקול יתרונות הטבועים בו ומגבלות, וההיבט של האינטראקציה מאכסן-הווירוס כי הוא תחת חקירה.

דג הזברה, Danio rerio, הוא במודל חיה המספק הזדמנויות ייחודיות לחקר זיהום מיקרוביאלי, לארח תגובה חיסונית, וטיפולים תרופתיים פוטנציאל 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. הנוכחות של α-2,6 צמודות חומצות sialic על פני השטח של תאי דג הזברה הציעה הרגישות שלו IAV, אשר היה מובל החוצה במחקרי זיהום צלם in vivo באמצעות זן כתב ניאון של IAV 19. בשנת דג הזברה IAV נגועים, ביטוי מוגבר של תמלילי ifnphi1 ו MXA אנטי הצביעו על כך תגובה חיסונית מולדת היה מגורה, ואת הפתולוגיה שהפגינו דג הזברה IAV נגועים, כולל בצקת והרס רקמות, היה דומה לזה שנצפה זיהומים שפעת אנושית . יתר על כן, התמותה המוגבלת אנטי נורמינידאז IAV מעכב Zanamivir ו שכפול נגיפי מופחת של דג זברה 19.

בדו"ח זה, פרוטוקול לייזום מערכתic IAV זיהומים עוברי דג הזברה מתואר. שימוש Zanamivir במינונים רלוונטיים קליני בתור הוכחה של עיקרון, השירות של מודל דג זברת IAV זיהום בתרכובת הקרנה לפעילות אנטי מודגם. בנוסף, פרוטוקול להפקה מקומית, דלקת IAV אפיתל של דג הזברה לשחות שלפוחית שתן, איבר נחשב מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית מקביל הריאה היונקת 21, 29, 30, 31, מתואר. שימוש זה מודל זיהום מקומי IAV, גיוס נויטרופילים לאתר של זיהום יכול להיות במעקב, המאפשר חקירות לתוך התפקיד של ביולוגיה נויטרופילים זיהום ודלקת IAV. מודלי דג זברה אלה משלימים במודלים של בעלי חיים קיימים של זיהומי אדם IAV והם שימושיים במיוחד לבדיקת מולקולות קטנות ותגובות תא חיסון בשל האפשרות של ים משופרכוח tatistical, יכולת בינונית מבחני תפוקה גבוהה, ואת היכולות לעקוב אחר התנהגות התא החיסונית ותפקוד עם מיקרוסקופ אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העבודה צריכה להתבצע באמצעות biosafety ברמה 2 (או BSL2) סטנדרטים המתוארים על-ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות (CDC) ובהתאם להוראות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC). אנא להתייעץ עם הגורמים המתאימים על מנת להבטיח בטיחות ותאימות.

טיפול דג זברה 1. ותחזוקה

  1. ספון דג הזברה ולאסוף את המספר הדרוש של עוברים עבור הניסויים. בעת הצורך, טנקים רבייה המונית, כמו אלה שתיאר אדטו et al. 32, יכולים להיות מועסקים על מנת לאסוף מספר גדול של עוברים מבחינה התפתחותית-מבוימים.
  2. אפשר העוברים להתפתח עד לשלב ההתפתחותי רצוי (48 שעות לאחר הפריה עבור זיהום IAV מערכתי [סעיף 3] או 5 ימים לאחר הפריה עבור זיהום בשלפוחית ​​שתן מקומי, לשחות [סעיף 4]) במנות עמוקות פטרי בצפיפות נמוכה (< 100 עובר / צלחת) ב 28 מעלות צלזיוס במי ביצת סטרילית המכילים 60 מיקרוגרם / מיליליטר מלח ים (למשל, אושן מיידי) במים מזוקקים.
    1. הסר עוברים מתים עם pipets העברת פלסטיק ולשנות יומי במים ביצה כדי להבטיח בריאות והתפתחות אופטימלית.

2. הכנת חומרים ריאגנטים

  1. כן פתרון מניות 4 מ"ג / מיליליטר של Tricaine-S (כדי להתאים את pH 7.0-7.4) במים מזוקקים חיטוי. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. משוך נימי זכוכית בורוסיליקט עם חוטים באמצעות חולץ micropipette (למשל micropipette פולר עם ההגדרות הבאות: הגדרה לחץ = 100, חום = 550, משוך = [אין ערך], מהירות = 130, זמן = 110).
    הערה: לפני זמירת המחט, אורך מאיפת המחט מתחילה להתחדד אל קצה המחט תהיה כ 12-15 מ"מ. זה יכול להשתנות, עם זאת, על בסיס העדפה ויישום. ארוך יותר, להתחדד הדרגתי יותר עשוי להיות יותר עדיף בגלל היכולת המוגברת כדי לחדור את העובר ואת רי מופחתsk של כיפוף או שבירה מחט.
  3. ממיסים 2 גרם של agarose במים ביצה 100 מ"ל באמצעות מיקרוגל. הפוך צלחים שעליו לעמוד בתור ולהזריק את העוברים על ידי שפיכת נמס agarose לתוך מנות עמוקות פטרי המאפשרים לשמן להתמצק.
  4. הפוך מניה 10 מ"ג / מ"ל ​​של Zanamivir במים nuclease חינם. Aliquot ולהקפיא ב -20 ° C.
  5. ממיסים 0.5 גרם agarose במים ביצה 50 מ"ל באמצעות מיקרוגל לעשות העובר הרכבה agarose. לשמור באמבט מים ב 50 ° C עד מוכן לשימוש במהלך ההדמיה.

3. זיהום מערכתי IAV (48 שעות לאחר ההפריה)

זהירות: כל אנשי המחקר צריכים להתייעץ עם הממונים עליהם ורופאים לגבי חיסון לפני תחילת עבודה עם IAV.

  1. ידני dechorionate עוברים ביום של הניסוי באמצעות # 5 מלקחיים. תשמור על עצמך כדי להסיר להרדים עוברי כי נפצע בתהליך ב 200 מיקרוגרם / פתרון Tricaine מיליליטר.
  2. להכנת מי שתייהf IAV עבור Microinjection
    הערה: זנים אשר הוכחו להדביק עוברי דג הזברה הם שפעת A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), שפעת A X-31 A / איצ'י / 68 (H3N2) (X-31), ואת הכתב ניאון זן שפעת 33 ns1-GFP. פרטים על APR8 ו- X-31, זנים אחרים, ניתן למצוא בכתובת מאגר שפעת המחקר
    1. הפץ את זן ns1-GFP של IAV ב ביצי תרנגולת embryonated כפי שתואר לעיל 34, 35. אסוף, aliquot, ואת titer נוזל allantoic המכיל IAV, ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. טרום titered APR8 ו- X-31 וירוסים ניתן לרכוש מסחרית.
      1. רק לפני ההדבקה, במהירות להפשיר aliquot IAV בידיים עטויות כפפות ואז במהירות מניחים על קרח כדי להפחית את אובדן של כייל.
    2. דילול ויראלי
      1. אם באמצעות וירוסים APR8 או X-31, לדלל את 3.3 x 10 6 ביצים מנה זיהומיות 50% (EID50) / מ"ל ב supplem סטרילי, קר כקרח PBSented עם פנול אדום 0.25% (כדי לסייע ויזואליזציה) במנדף זרימה למינרית. במקביל הקים מלא המכיל PBS סטרילי עם פנול אדום 0.25%.
      2. אם אתה משתמש ns1-GFP זן 33, לדלל את ~ 1.5 x 10 2 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) לכל NL ב PBS סטרילי, קר כקרח המכיל אדום 0.25% פנול (כדי לסייע ויזואליזציה) במנדף זרימה למינרית. במקביל הקים מלא המכיל נוזל allantoic מן ביצי עוף נגועות בדילול כמו הווירוס ב PBS סטרילי עם פנול אדום 0.25%.
      3. לשמור IAV על הקרח עד מוכן לשימוש.
    3. Pipet פתרון וירוס לתוך מחטים microinjection באמצעות טיפים microloader רק לפני השימוש. הכנס מחט microinjection לתוך מחזיק המתאים של מנגנון הזרקה (מערכת הזרקה בלחץ למשל MPPI-3).
    4. בעת ההצגה תחת מיקרוסקופ סטריאו, בעדינות קליפ קצה מחט microinjection עם # 5 מלקחיים חדים, מעוקרים.
      ודוק: אין מדובר recommended כי קצה microinjection להיות מקוטע בהדרגה.
    5. לחץ על דוושת הרגל של מערכת ההזרקה בלחץ ולהזריק לתוך טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ בשקופית מיקרומטר כיול. מדוד את הקוטר של הירידה. חשב את הנפח של הירידה באמצעות המשוואה, V = 4 / 3πr 3, כאשר V הוא נפח nl ו r הוא הרדיוס ב מיקרומטר.
      הערה: אם קוטרו הטיפה קטן מדי, כוס נוספת עשויה להיות מקוטעת או לחץ הגדרות תזמון יכולות להיות מותאמת. אם קוטרו הטיפה גדול מדי, הגדרות לחץ ועיתוי יכולות להיות מותאמות.
    6. התאם את הגדרות לחץ והעיתוי על לחץ ההזרקה ו / או reclip קצה המחט עד נפח הזרקה הרצויה מושגת (בדרך כלל 1-3 nl). לחץ הגדרות בין 20 ל -30 psi ומשך דופק הגדרות בין 40 ל 80 msec אופייניות. התאם בחזרה לחץ כך מונה לוחץ נימים אבל לא להדליף IAV (נטו אפס לחץ).
  3. יישר עובר להזרקה
    1. להרדים עוברים dechorionated ב 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tricaine.
    2. לאחר התנועה נפסקת, להעביר 10-20 עוברים על צלחת 2% agarose (מוכן בסעיף 2.3) עם טפטפת פלסטיק. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להסיר עודפי נוזלים.
    3. יישר בעדינות עוברת microinjection עם נימי אש מלוטשת וזכוכית בורוסיליקט האטומה. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, עובר להתמצא בעדינות כך הדביקה של קיביה או וריד הקרדינל האחורי עולה בקנה אחד עם מחט microinjection (איור 1 א).
  4. IAV Microinjection
    1. הכנס בעדינות את המחט microinjection לתוך צינור של קיביה או וריד הקרדינל האחורי. על הדוושה ברגל כדי להזריק את העוצמה הרצויה של IAV לתוך מערכת הדם של (איור 1 א) העובר. עובר ניתן להזריק יותר מפעם אחת, אם יש צורך בכך.
      הערה: בולוס ההזרקה צריכה להיסחף לתוך מחזור הדם distribהתנהגותיות בילדים בכל הגוף. אם נפח הזרקה אוסף באתר הזרקה, להסיר עובר מן הניסוי להרדים.
    2. חזור על זריקות בעוברים שונים עם פתרון שליטה ספציפי לזן של וירוס הנבחר. לקבלת APR8 ו- X-31, השתמש בשלט בסעיף 3.2.2.1; עבור ns1-GFP, להשתמש בשלט בסעיף 3.2.2.2.
  5. העברה עוברת מנות שכותרתו פטרי המכילות מי ביצה סטרילית ומניחים חממות על 33 ° C.
    הערה: עובר אינפקטד צריך להיות מבוגר על 33 ° C לתמוך שכפול נגיפי משופר. בנוסף, דגירה על 33 מעלות צלזיוס יחקה בצורה טובה יותר את הטמפרטורה של דרכי הנשימה העליונות האנושית, אשר נמצא בקשר הדוק עם טמפרטורות נמוכות יותר בסביבה החיצונית והוא שם זיהומים IAV להתרחש. עוברים יכולים להסתגל טווח טמפרטורות רחב 34.

4. מקומית, דלקת בשלפוחית השחייה IAV ב Tg (MPX: mCherry) דג הזברה מהונדס (5 ימים לאחר ההפריה)

  1. הכנת IAV עבור Microinjection
    1. לדלל את פתרון הזרקת זן ובקרת ns1-GFP כמפורט בסעיף 3.2.
    2. הכן מחטים כמפורט בסעיף 2.2.
    3. יישר Tg (MPX: mCherry) 35 זחלים המכילים שלפוחית שחייה מנופחת כמפורטים בסעיף 3.3 למעט הבא. יישר זחלים בצורה כזאת כי המחט יכולה לנקב בשלפוחית השחייה ואת הווירוס ניתן להפקיד לתוך האחורי של בשלפוחית השחייה, כפי שתואר לעיל 36 (איור 2 א).
  2. IAV Microinjection
    1. הכנס בעדינות את המחט microinjection לתוך בשלפוחית השחייה ולהזריק את העוצמה הרצויה (למשל 5 NL) לכיוון האחורי של (איור 2 א) מבנה.
      הערה: בולוס ההזרקה צריכה לאסוף לכיוון האחורי ואת בועת האוויר של לשחות שלפוחית ​​השתן צריכה bהדואר שנעקר קדימה. ביטוי של GFP צריך להתחיל להיות שנצפה לאחר הזרקת 3 שעות.
    2. הזרקות חוזרות עם פתרון שליטה ספציפי לזן של וירוס הנבחר, כמפורט בסעיף 3.4.2.
  3. העבר הזחלים צלחות פטרי המכילות מים ביצה סטרילית ומניחים חממות על 33 ° C.

5. טיפול תרופתי אנטי

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את טיפול Zanamivir הראה בעבר ב גאבור et al. 19. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להקרין תרופות אנטי אחרות ויש לו הפוטנציאל להיות שונה כדי לסרוק תרכובות המצויות מרובות צלחת 96 היטב, בפורמט תפוקה גבוהה.

  1. בשעה 3 זיהום שעות שלאחר, להחליף מים ביצה של ns1-GFP- ודגים נגוע שליטה עם מים ביצה סטרילי המכיל 0, 16.7, או 33.3 ng / ml Zanamivir.
    הערה: ריכוזים אלו נבחרו על מנת לנסות לשכפל את הרמות הפיזיולוגיות מושגת FOllowing הממשל של Zanamivir בחולים אנושיים (100, 200, או 600 מ"ג, iv, פעמיים ביום או 10 מ"ג בשאיפה, פעמיים ביום). הריכוזים בסרום בחולים אנושיים נעים בין 9.83 כדי 45.3 ng / ml 36.
  2. במהלך 5 ימים, לשנות מי ביצה כל 12 שעות ולהחליף מי ביצת סטרילי המכילים את הכמות המתאימה של Zanamivir.
  3. עקוב אחר המסלול של זיהום.
    1. להרדים דג הזברה ב 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tricaine. צג ביטוי של GFP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו כדי להבחין בשינויים חזותיים בדפוסי זיהום בין דגים מלאים נגועים-IAV ובקרב הדגים השקועים בתוך הריכוזים השונים של תרופות.
    2. עקוב אחר תחלואה ותמותה במהלך 5 ימים.
      1. תצפיות שיא על הדינמיקה זיהום הקשורים פתולוגיה המחלה, כולל סימני עייפות הוכחה לבצקת, הבדלי פיגמנטציה, עינית ועיוותים craniofacial, ו לורדוסה. פתולוגיה מחלותבדרך כלל מתברר בדגים נגועים בקרה לאחר הזרקת 24-48 שעות, תלוי את כמות הנגיף המוזרקת. איסוף תמונות 24 שעות לאחר ההזרקה.
      2. כל 24 שעות במשך 5 ימים לאחר הדבקה, להקליט את מספר הרוגים, חולניים, ובריאים זחלים. המוות מוגדר מהיעדרם של פעימות לב ניכרת. להתוות נתונים לפי הצורך. לדוגמא, נתוני עלילה כגרף עמודות בערימה, עם אחוזי הדגים בריאים, חולניים, או מת זמם על ציר y ו בקבוצת הטיפול על ציר ה- x. 19
        הערה: תמותה יכולה להיות בקיע לפי הערכות הישרדות קפלן-מאייר. בהתאם ליישום, זה עשוי להיות מתאים לפתח גישות חלופיות לתחלואת דגי ניקוד, כוללים מטריצת ניקוד שעשוי לכמת את המעלות לתחלואה מבוססות על תכונות פתולוגיים הנ"ל ציינו.
      3. התייעץ עם סטטיסטיקאי ליישם את הניתוחים סטטיסטיים המתאימים.

6. הגירת נויטרופילים

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר שיטה למעקב אחר הגירת נויטרופילים כדי בשלפוחית ​​השחייה לאחר זיהום IAV מקומי, אפיתל. השיטות שתוארו יכולות להיות שונות כדי לבדוק את ההשפעות של מניפולציות גנטיות וכימיות. באמצעות טכניקה זו, ניתן יהיה לאפיין את המנגנונים התנהגות נויטרופילים במהלך זיהום IAV.

  1. השמה דג הזברה הדמיה
    1. להרדים הזחלים להיות צילמו ב 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tricaine.
    2. עבר יחיד Tg (MPX: mCherry) זחל כי נדבק בוירוס עם ns1-GFP אל באר של 24 היטב, צלחת זכוכית תחתונה טיפה קטנה של מי ביצה (~ 50-100 μl). אני חוזר עם דגים IAV נגועים ובקרה אחר.
    3. לאט לאט מוסיף עובר agarose 1% תקשורת גוברת היטב כל (סעיף 2.5), נזהר שלא להכניס בועות גדולות.
      1. בעדינות להתאים את המיקום של הזחל כך שהוא רכוב על צידו.גודי והנרי 37 לתאר איך לעשות בדיקות המתפקדים היטב בבקשה זו באמצעות סיכות חרקים כי הם רכובים נימי זכוכית בורוסיליקט עם חוטים ו superglued במקום.
    4. לאחר agarose מתקשה, בעדינות למלא את הבארות הבודדות עם מי ביצה המכילים 200 מיקרוגרם / מיליליטר Tricaine.
    5. עם מיקרוסקופ confocal, לכידת AZ סדרת ערימת תמונות brightfield קרינה באמצעות מטרת 20X התמקדה בשלפוחית ​​השחייה.
      1. הגדר את הגבולות העליונים ותחתונים, כך שהם ללכוד את כל הקרינה הירוקה ואדום הנצפית בעליל.
      2. צלמו תמונות על 2.0 μsec / פיקסל בצעדים כי הם ≤ 4 מיקרומטר. הגדלת זמן לפיקסל וצמצום מרחק בין השלבים (למשל 0.5 - 1.0 מיקרומטר) מגדילה תמונה ברזולוציה ואיכות.
      3. צור תמונה דו-ממדית על ידי מיזוג שכבות.
      4. השווה את מספר נויטרופילים MPX-mCherry חיובי אני מציגn את שלפוחית ​​שחייה של IAV נגועים ובקרה מוזרק דג הזברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנה, נתונים המראים כיצד מערכתי זיהום IAV דג הזברה יכול לשמש כדי לבדוק את יעילות תרופה (איור 1 א) הנם מסופקים. עובר ב 48 שעות לאחר הפריה מוזרקת עם APR8 (1C הדמוי, 1F), X-31 (1D הדמוי, 1G), או שהם ns1-GFP (איורי 1H-ט 1) דרך הצינור של קיביה ליזום זיהום ויראלי. עוקבה נוספת של עובר ב 48 שעות לאחר הפריה הוזרקה לשמש שולט על זיהום ויראלי (איורי 1B, 1E). על ידי 48 שעות לאחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי למקסם את היתרונות זכו משימוש חיה קטנה מודל אינטראקציות מארח הפתוגן אנושיים, חשוב לנסח שאלות מחקר ושערות בדיקה כי לנצל את היתרונות טמונים במערכת המודל. כמודל הידבקות בני אדם IAV, דג הזברה יש מספר חוזקות, כוללים פוריות גבוהה, בהירות אופטית, amenability כדי הקרנת סמים, וזמינות של קווים מהונדסים כי לתייג תאים חיסוניים כמו נויטרופילים. דג הזברה פותחה כחלופה חזקה יותר ויותר למערכת במודל עכבר לחקר דלקת החסינות מולדת. משום שאין להם מענה אדפטיבית החיסון מתפקדת במהלך 4-6 שבועות של פיתוח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות למארק נילן על הטיפול והתחזוקה של דג הזברה ולמייגן ברייטבך ודבורה בושארד על הפצת NS1-GFP וקביעת טיטר IAV. מחקר זה נתמך על ידי מענק NIGMS NIH P20GM103534 ותחנת הניסויים החקלאיים והיערות של מיין (פרסום מספר 3493).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 מ"מ x 25 מ"מ כלי פטרי חד פעמיים סטריליים VWR89107-632
פיפטות העברה פישרברנד13-711-7M
טריקאין-S (MS-222)בורוסיליקט כימיים
עם נימה סאטר אינסטרומנט BF120-69-10
חולץ מיקרופיפטה בוער/חום Sutter InstrumentP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 מלקחיים מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72700-D
טיפים למיקרו-מעמיסאפנדורף930001007
שמן טבילה במיקרוסקופאולימפוסIMMOIL-F30CC
שקופית כיול שלב מיקרוסקופ מזרק לחץ AmScopeMR095
MPPI-3 מכשור
מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZ61
יחידת לחץ אחורימכשור מדעי יישומיBPU
ערכת מחזיק מיקרופיפטהמכשור מדעי יישומיMPIP
מתג רגלמכשור מדעי יישומיFSW
מיקרומניפולטורמכשור מדעי יישומיMM33
בסיס מגנטימכשור מדעי יישומי בסיסמגנטי
פנול אדום סיגמא-אולדריץ' P-4758
חממה בטמפרטורה נמוכהVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
IlluminatorZeissHXP 200C
מקור אור קרZeiss CL6000 LED
תחתונה multiwell צלחת, 24 בארמטקP24G-0-13-F
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסIX-81 עם מערכת קונפוקלית סריקת לייזר FV-1000
צ'ארלס ריבר 490710
שפעת A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) צ'ארלס ריבר 
Influenza NS1-GFPמוזכר ב-Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)מוזכר ב-Lam et al. 2013
נימי זכוכית מערבייםמדעי יישומי זכוכית תוכנת Fluoview Olympus Prism v6 GraphPad Influenza A / PR / 8/34 (H1N1) וירוס 490715

מקורות

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Tg mpx mCherryZanamivir
באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.