כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה עבור אוסף spermatozoa דולפין, הקפאה קריוגנית וביצועים heterologous IVF באמצעות oocytes שור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו Heterologous הפריה
במאמר זה
סיכום
תקציר
השימוש של דולפין cryopreserved spermatozoa מקל על חילופי חומר גנטי בין פארקים ימיים והופך spermatozoa נגיש למעבדות ללימודים לקדם את ההבנה שלנו של יונקים ימיים רבייה. Heterologous להפריה חוץ גופית, תחליף הומולוגי להפריה חוץ גופית, יכול לספק אמצעי כדי לבדוק הזרע פוריות אפשריות; ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם; כדי למנוע את השימוש oocytes דולפין בעל ערך, אשר קשה להשיג. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה כדי לאסוף cryopreserve spermatozoa דולפין. איסוף זרע מתבצע על ידי גירוי ידני על דולפינים מיומן. הקפאה קריוגנית מושגת באמצעות הרחבה מבוסס חלמון ביצה של טריס גליצרול. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול זה מתאר heterologous חוץ-גופית בשיטת דולפין spermatozoa, oocytes שור ומוודא כי מהות היברידית וכתוצאה מכך העובר באמצעות PCR. הפריה heterologous מעלה שאלות על הפריה והוא יכול לשמש ככלי ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם. בנוסף, ההצלחה של הפריה חוץ גופית heterologous מדגימה את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי לבדוק הזרע דולפין הורס את ביצועיו, שווה בדיקה נוספת.
מבוא
בסיוע טכנולוגיות פריון הן מפותחות חיות בר, כולל יונקים ימיים. העדר רגיש שיטות להערכת ההצלחה המפרה זרע תורם להתפתחות איטית של טכנולוגיות פריון במינים כמו דולפין. זה לא היה עד לאחרונה כי הפרמטרים הבסיסיים החלוצי של דולפינן (והוולדות truncatus) היו שדווחה1,2. עם זאת, משתנים כגון תנועתיות, מורפולוגיה, למרות בשימוש נרחב, לתת מידע מוגבל על יעילות הרבייה. הסימן הכי טוב של איכות הזרע הוא הערכת פוטנציאל המפרה.
לאחרונה, הקבוצה שלנו להשתמש בשיטה כדי להעריך דולפין הזרע להפרות את הפוטנציאל על-ידי הערכת היווצרות pronuclear זכר ו/או היברידית היווצרות העובר לאחר IVF heterologous באמצעות zo....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אתיקה משפט: כל ההליכים ניסיוני היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של y אינסטיטוטו נאסיונאל דה Investigación Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). כל הניסויים בוצעו בהתאם לקו המנחה על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, כפי שאומצה על ידי אגודת המחקר של רבייה, וכדי חוק רווחת בעלי חיים לטיפול של יונקים ימיים.
1. איסוף זרע דולפין של הקפאה קריוגנית
- הכנת
- ןשד להפוך בינוני (הפארין ו hypotaurine-חינם). להכין בינוני ןשד-TALP בתוספת 25 מ מ ביקרבונט 22 מ"מ סודיום לקטט, פירובט נתרן 1 מ מ, 6-מ"ג/מ"ל חומצה שומן חינם BSA, הפארין 10 מ"ג/מ"ל (pH 7.4).
הערה: להכין בינוני ביום של השימוש ו....
- ןשד להפוך בינוני (הפארין ו hypotaurine-חינם). להכין בינוני ןשד-TALP בתוספת 25 מ מ ביקרבונט 22 מ"מ סודיום לקטט, פירובט נתרן 1 מ מ, 6-מ"ג/מ"ל חומצה שומן חינם BSA, הפארין 10 מ"ג/מ"ל (pH 7.4).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כל תוצאות, טבלאות או איורים (1 ו 2) המובאת כאן שוחזר עם הרשאה3.
דולפין spermatozoa יש תנועתיות גבוה לאחר הקפאה והפשרה
שופך הדולפין קפוא-הקרת הראה באחוזים (% ± SD) של 84.5 ± 5.3 הכוללת תאי ואין 69.1 ± 5.1 spermatozoa תאי מתקדמת. במונחים של תנועתיות, המספרים האלה הם נציג של spermatozoa cryopreserved באיכות גבוהה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבור מינים רבים יונקים שונים, ישנם יתרונות מגוונים לשימוש זרע קפוא-הקרת. אלה כוללים את היכולת להעביר חומר גנטי בעל ערך, את הפוטנציאל להפצה ברחבי העולם, הסיכון נמוך של זיהום, את היכולת לשמר את זכר גמטות במשך עשרות שנים. השימוש cryopreserved הזרע חיוני דולפינן, כי מין זה מוגן תחת נספח ב- CITES, אשר מגביל את התחבורה ואת חילופי בעלי חיים בין פארקים ימיים שונים. דולפינים תחבורה היא פעילות היוצרת בעיות לוגיסטיות והסיכונים מסוכן. עם זאת, הימנעות המסיעה אותם יש גם השלכות, כגון הסיכון של החדרת וקרבת הדם אוכלוסיה בשבי של בעלי חיים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודתו מומן על ידי משרד ספרדית של הכלכלה ואת התחרותיות (AGL2015-70140-R ל ד Rizos), AGL2015-66145R א גוטיירז-אדן, ג'יי פ פרז-גוטיירז. סנקה קרן מורסיה (גרנט 20040/נבט/16 ל פ גארסיה-ואסקז)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| FERT-TALP בינוני | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4 בארות כלים | Nunc | 176740 | |
| שיפוע צפיפות BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| פתרון כביסה Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| מגנזיום כלוריד | Promega | A35 1H | |
| מים סטריליים | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB | agarose Biotools | 20.012 | |
| טאק פולימראז | פרומגה | ||
| SafeView | NBS ביולוגית בע"מ | M 890 A | |
| תא ספירה מקלר | תא ספי רפואי | ||
| תומא | הכט-עוזר | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| אוסמומטר מיקרו אוסמומטר מתקדם 3300 | נורווד | ||
| מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב | Projectes y Serveis R+D | ||
| סטריאומיקרוסקופ MZ 95 | Leica | ||
| אופטיקה אפיפלואורסצנטית Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 תוכנה | Bio-Rad | תוכנת ניתוח | |
| מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | צינורות מיקרוצנטריפוגה של גילסון | ||
| VWR | |||
| UV תאורה | ביו-ראד | ||
| PCR תרמי מחזורי פרימוס 96 פלוס | MWG AG ביוטק |
מקורות
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
