ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמנועי דגל חיידקים חשים מגוון אותות סביבתיים ומעצבים מחדש בתגובה. מבחני החרוזים שנדונו כאן צפויים לעזור להסביר את תפקיד העיצוב מחדש בהסתגלות התאים לגורמי לחץ סביבתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
תפקידם של מנועי דגל בתנועתיות חיידקים וכימוטקסיס מובן היטב. תגליות אחרונות מצביעות על כך שמנועי דגל מסוגלים להתעצב מחדש בתגובה למגוון גירויים סביבתיים והם בין הטריגרים להתיישבות פני השטח ולזיהומים. המנגנונים המדויקים שבאמצעותם מנועים מעצבים מחדש ומקדמים הסתגלות תאית תלויים ככל הנראה בתכונות מוטוריות מרכזיות. טכניקת מעקב החרוזים מבוססת מכפיל האור המוצגת כאן מאפשרת אפיון ביופיזיקלי מדויק של פונקציות מוטוריות, כולל התאמות במהירויות המנוע ודינמיקת המתגים. גישה זו מציעה את היתרון של מעקב בזמן אמת ואת היכולת לחקור התנהגות מוטורית לאורך פרקי זמן ממושכים. ניתן להרחיב בקלות את הפרוטוקולים הנדונים כדי לחקור מנועי דגל במגוון מיני חיידקים.
מבוא
מנועי flagellar לאפשר תאים לשחות ידי החלפת חוטים תאיים סליל. כמות מומנט המנוע יכול לייצר עבור באורך נתון של השוטון (כלומר, את העומס הצמיג) מקובעת את מהירויות השחייה. מצד השני, היכולת שלה כדי להעביר את כיוון הסיבוב שולטת נדידת תאים בתגובת כימיקלים, תהליך המכונה chemotaxis. Chemotaxis ו ארסיות להיות תנועתיות גורמי 1-3, מנועים flagellar מתאפיינים היטב במשך השנים 4. הראיות המצטברות החברה עולה כי המנוע משמש mechanosensor - זה מכנית מזהה נוכחות של 5,6 מצעים מוצקים. יכולת זו מסייעת סביר המעוררים קולוניזציה משטח וזיהומים 5,7. כתוצאה מכך, המנגנונים לפיה מנוע חושי משטחים ויוזם איתות הם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תא הכנה
- לגדול תרבויות לילה של המתח הרצוי נושאת את Flic דביק אלל 15,22 ב Tryptone מרק (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) ואחריו חיסון ב 1: 100 דילול ב 10 TB מ"ל טריים. לגדול התרבות ב 33 מעלות צלזיוס חממה שייקר עד OD 600 = 0.5.
- גלולה התאים ב 1500 XG במשך 5 - 7 דקות מחדש לפזר את גלולה במרץ ב 10 מ"ל של חיץ תנועתיות מעוקר מסנן (MB; חיץ פוספט 10 מ"מ: 0.05-0.06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 מיקרומטר מתיונין, pH 7.0).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההתקנה המכפילה מוצגת באיור 1 א. חשוב כי יש PMTs רגישויות גבוהות על פני טווח של אורכי גל מפוזרים על ידי החרוזים של עניין. PMTs מועסק כאן לפעול בטווחים הגלויים קרוב אינפרא אדומים, הצליח לזהות אור מפוזר על ידי חרוזים המוארים על ידי מקור אור ההלוגן. תנאי תאורה אופטימליים, לאספקת מתח ישתנו מהגדרת אחד למשנהו. עבור ההתקנה המשמשת בעבודה זו, רווח PMT ~ 10 אפריל - 10 מאי הוכיח את יעילותו. כל מכפיל היה מכוסה למעט חרך 3 x.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
על מנת להקל על מעקב חרוז קשור ואמידה נכונה של מגבילי מנוע, את המידע הבא צריך להיבדק. בעת ביצוע מדידות אלה עם תאים והולקה בשוט, הגז הוא שלב קריטי. גזיזה מפחיתה את נימת flagellar כדי בדל גרידא, ובכך להבטיח כי העומס הצמיג על המנוע הוא בעיקר בשל החרוז ניתן לאמוד בתוך 10% שגיאה 16. גזיזה גם משפרת את הסיכוי למצוא מסלולים עגולים עם מוזרויות מופצות בחוזקה (<חרוז בקוטר 14). תוצאות גז פסולת מסלולים סוררים, אשר תרכובות טעויות מעקב בחישוב שאיפות צמיגות, כמו גם וכתוצאה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים להווארד ברג על תרומת המיקרוסקופ/מכפילי הפוטו העוקבים אחר חרוזים ותחנת הניסויים ההנדסיים של טקסס A&M עבור מימון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת פולי-L-ליזין (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 מ"ל Luer מזרק קצה החלקה | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| קליי אדמס Intramedic Luer-Stub מתאם 23 מד | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| צינורות פוליאתילן | הרווארד מנגנון | 59-8325 | |
| http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html פוטו-מכפיל צינורות | Hamamatsu | R7400U-20 | טווח תגובה ספקטרלי של 300 עד 920 ננומטר, אורך גל שיא 630 ננומטר, זמן תגובה של 0.78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| חריצים מדויקים 3 x 1 מ"מ | Edmund Optics | NT39-908 | 2 חריצים המותקנים בזווית ישרה זה לזה על צינורות פוטו-מכפיל |
| אוסילוסקופ | Tektronix | TBS 1032B | מותגים אלטרנטיביים מקובלים. אוסצילוסקופ דיגיטלי, סדרת TBS 1000B, 2 אנלוגי, 30 מגה-הרץ, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 קוטבי LP/HP מסנן | Krohn-Hite | 3384 | מותגים אלטרנטיביים מקובלים. מומלץ טווח תדרים מ-0.1 הרץ עד 200 קילו-הרץ. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| מיקרוסקופ Optiphot | Nikon | NA | ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פאזה זקוף או הפוך. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) מפצל קרן קובייה | ThorLabs | BS013 |
מקורות
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
