הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

7.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55240

⸱

18 בינואר 2017

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

במאמר זה

סיכום

ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמנועי דגל חיידקים חשים מגוון אותות סביבתיים ומעצבים מחדש בתגובה. מבחני החרוזים שנדונו כאן צפויים לעזור להסביר את תפקיד העיצוב מחדש בהסתגלות התאים לגורמי לחץ סביבתיים.

תקציר

תפקידם של מנועי דגל בתנועתיות חיידקים וכימוטקסיס מובן היטב. תגליות אחרונות מצביעות על כך שמנועי דגל מסוגלים להתעצב מחדש בתגובה למגוון גירויים סביבתיים והם בין הטריגרים להתיישבות פני השטח ולזיהומים. המנגנונים המדויקים שבאמצעותם מנועים מעצבים מחדש ומקדמים הסתגלות תאית תלויים ככל הנראה בתכונות מוטוריות מרכזיות. טכניקת מעקב החרוזים מבוססת מכפיל האור המוצגת כאן מאפשרת אפיון ביופיזיקלי מדויק של פונקציות מוטוריות, כולל התאמות במהירויות המנוע ודינמיקת המתגים. גישה זו מציעה את היתרון של מעקב בזמן אמת ואת היכולת לחקור התנהגות מוטורית לאורך פרקי זמן ממושכים. ניתן להרחיב בקלות את הפרוטוקולים הנדונים כדי לחקור מנועי דגל במגוון מיני חיידקים.

מבוא

מנועי flagellar לאפשר תאים לשחות ידי החלפת חוטים תאיים סליל. כמות מומנט המנוע יכול לייצר עבור באורך נתון של השוטון (כלומר, את העומס הצמיג) מקובעת את מהירויות השחייה. מצד השני, היכולת שלה כדי להעביר את כיוון הסיבוב שולטת נדידת תאים בתגובת כימיקלים, תהליך המכונה chemotaxis. Chemotaxis ו ארסיות להיות תנועתיות גורמי 1-3, מנועים flagellar מתאפיינים היטב במשך השנים 4. הראיות המצטברות החברה עולה כי המנוע משמש mechanosensor - זה מכנית מזהה נוכחות של 5,6 מצעים מוצקים. יכולת זו מסייעת סביר המעוררים קולוניזציה משטח וזיהומים 5,7. כתוצאה מכך, המנגנונים לפיה מנוע חושי משטחים ויוזם איתות הם בעלי חשיבות 8,9.

מנוע flagellar ניתן ללמוד בקלות על ידי קושר את flagellאממ לרוטצית תא מצע והתבוננות. קשירה כזו הושגה לראשונה על ידי סילברמן וסיימון, שעבד עם מוטציה polyhook ב E. coli ו ווים לחבר בהצלחה מצעי זכוכית עם נוגדנים נגד וו 10. את assay הקשורים התאים אפשר לחוקרים ללמוד את התגובות של מתג המנוע למגוון של גירויים כימיים. לדוגמה, סגל ועמיתים לעבודה מגורה תאים קשור כימית בעזרת טפטפות iontophoretic. השינויים המתאימים הטיה CW (את החלק היחסי של מנועים הזמן לסובב עם כיוון השעון, CW) אפשרה להם למדוד את קינטיקה של הסתגלות ברשת chemotaxis 11,12. בעוד assay התא הקשור היה יעיל בחן את תשובות מתג, זה היה מסוגל רק להציע תובנה מכניקת מנוע פני טווח מוגבל של עומסים צמיגים 13. כדי להתגבר על בעיה זו, ריו ועמיתים לעבודה קשורה כדורי, חרוזי גומי כדי נימה השוברים על תאים תקועים על משטחים. החרוזים היואז מעקב באמצעות אינטרפרומטריה גב מוקד עם מלכודות אופטיות חלשות 14. הודות לשיתוף פעולה עם חרוזים בגדלים שונים, חוקרים יכלו ללמוד את המנוע על פני טווח רחב יותר של עומסים. assay זה היה שיפור מאוחר יותר על ידי יואן וברג, אשר פיתח טכניקה חרוז מעקב מבוססי מכפיל בשילוב עם תאורה כהה שדה לייזר. המעקב מופעל שיטתם של nanobeads זהב הקשור כי הם כה זעירים (~ 60 ננומטר) כי ההתנגדויות הצמיגות החיצוניות היו נמוכות לעומת ההתנגדויות הצמיגות הפנימיות סיבוב 15,16. זה הוביל את המידות של מהירויות המרביות השגה ב E. coli (~ 300 הרץ). ב V. alginolyticus, מבחני חרוז דומים מופעלים מדידות של שיעורי ספינינג בעומסים צמיגים ביניים (~ 700 הרץ) 17. בכך שהיא מאפשרת מדידות של תגובות המנוע על פני הטווח האפשרי השלם של המון צמיגה (מאפס עומס לקרוב-דוכן), החרוז-המבחנים ספקו כלי biophysical חשוב להבין את torque דור תהליך 18,19.

לאחרונה, שינינו את assay יואן-ברג לכלול פינצטה אופטית שאפשרה לנו ליישם גירויים מכאניים מדויקים מנועים בודדים 6. באמצעות טכניקה זו, הראינו כי-גנרטורים כוח לסובב את המנוע הם mechanosensors דינמי - יעשו שינויים בתגובה לשינויים המון צמיגה. יתכן כי עומס חישה כגון מפעילת התמיינות תאים לתוך חיידקים שורצים, למרות המנגנונים עדיין אינם ברורים. כמו כן סביר להניח כי מנועי flagellar במינים אחרים הם גם mechanosensitive 20, למרות ראיות ישירות חסרות. כאן, אנו דנים מבוססי מכפיל (PMT) הגישה למעקב אחר סיבוב של חרוזים לטקס הרתומים חוטים flagellar 15. בהשוואת מעקב עם מצלמות מהירות, את ההתקנה המכפילה יש יתרון משום שהוא הוא פשוט יחסית כדי לעקוב אחר חרוזים יחידים בזמן אמת ושוב הדורה ארוכהמשא. זה שימושי במיוחד כאשר לומדים ותיק שיפוץ מתחמי מנוע flagellar בשל גירויים סביבתיים 21. למרות שאנחנו פרוטוקולים בפירוט במיוחד עבור E. coli, הם יכולים להתאים בקלות ללימוד מנועים flagellar במינים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תא הכנה

  1. לגדול תרבויות לילה של המתח הרצוי נושאת את Flic דביק אלל 15,22 ב Tryptone מרק (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) ואחריו חיסון ב 1: 100 דילול ב 10 TB מ"ל טריים. לגדול התרבות ב 33 מעלות צלזיוס חממה שייקר עד OD 600 = 0.5.
  2. גלולה התאים ב 1500 XG במשך 5 - 7 דקות מחדש לפזר את גלולה במרץ ב 10 מ"ל של חיץ תנועתיות מעוקר מסנן (MB; חיץ פוספט 10 מ"מ: 0.05-0.06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 מיקרומטר מתיונין, pH 7.0).
  3. חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות מחדש לפזר את הגלולה הסופית 1 MB המ"ל.
  4. גזירה ההשעיה על ידי עובר הלוך ושוב ~ 75 פעמים בין שני מזרקים עם 21 עד 23 מתאמי מד מחובר על ידי צינורות פוליאתילן (7 - 12 ס"מ אורך, 0.58 מ"מ פנימי קוטר). הגבל את הזמן הכולל עבור הגז כדי 30 - 45 s.
  5. צנטריפוגה תאים הטעונים ב 1500 XG במשך 5-7 דקות מחדש לפיזורגלולה ב 100 - 500 μL של MB.

2. שקופיות כנות

  1. הכין תא הדמיה על ידי הרבדה שנייה דבק דו צדדי בין תלוש-כיסוי שקופיות מיקרוסקופ. עבור מבחני chemotaxis, להעסיק כל תא microfluidic המאפשר חילופי MB וממריצים כימיים.
  2. להוסיף 0.01% הפתרון פולי- L- ליזין בתא ואחרי 5 דקות בעדינות ולשטוף את המשטחים עם MB (80 - 100 μL).
  3. הוסף 40 μL של ההשעיה תא לתא ולאפשר מספיק זמן עבור התקשרות אל משטח זכוכית (7 - 8 דקות). לזרום החוצה תאים לקלף ידי הוספת 100 μL MB בצד אחד של החדר, תוך פתילת הפתרון עם נייר סינון מהצד השני.
  4. להוסיף 10 - 15 μL של חרוזי לטקס לתוך התא ולאפשר החרוזים זמן לפרוע באמצעותם ולצרף אל התאים (7 - 8 דקות). לשטוף בעדינות עם 100 μL של MB, כמתואר בשלב 2.3, להסיר לקלף חרוזים. להשתמש במגוון של חרוז-סיzes עבור הניסויים כל עוד ניגוד טוב זמין.

3. מעקב חרוז

  1. מניח את המדגם על במה מיקרוסקופ ולסרוק את השטח עבור חרוזים מצורפים מנועים. השתמש מטרת שלב 40X לבצע תצפיות למרות מיקרוסקופיה שלב לא הכרחית. לחלופין, להעסיק הדמית שדה בהיר כל עוד ניגוד ראוי נשמר להבחין חרוז בהיר בבירור על רקע כהה.
  2. פעם חרוז נבחרת, להזיז את הבמה רוחבית כדי למקם את החרוז בפינה שנקבעה מראש כפי שמוצג באיור 1 ב. חרוזים עמדו באותו בפינה כדי להבטיח כי כיוון הסיבוב של החרוז ידוע כראוי. מסלולו החרוז האידיאלי הוא כ עגול אבל מסלולי אליפטי הם קבילים.
  3. שמירה על תדר דגימה גבוה יותר מפי שניים את תדירות הסיבוב של המנוע, כדי למנוע טעויות הקשורות aliasing. בעבודה זו, להשתמש במנוע שהיה מסתובב50 הרץ ו מדגם בתדרים שהיו היה גבוה פי 10 (500 הרץ), כדי לקבל אות חלקה.

ניתוח 4. נתונים

  1. מרכז ולהתאים את מתחי מוצא PMT ונכון סְגַלגַלוּת ב המסלולים עם טרנספורמציות המאוחד במידת צורך 23. השתמש ניתוח כוח ספקטרום לקבוע שיעורי סיבוב 17.
  2. לקבוע זוויות קוטב, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). קבע את הווריאציות במהירויות מנוע ומיתוג לאורך זמן על ידי חישוב ω figure-protocol-1 14.
  3. להעסיק מסנן חציון להחליק את הנתונים מהירי מנוע. חלון מסנן מעל שני סיבובים מלאים מומלץ 23,24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההתקנה המכפילה מוצגת באיור 1 א. חשוב כי יש PMTs רגישויות גבוהות על פני טווח של אורכי גל מפוזרים על ידי החרוזים של עניין. PMTs מועסק כאן לפעול בטווחים הגלויים קרוב אינפרא אדומים, הצליח לזהות אור מפוזר על ידי חרוזים המוארים על ידי מקור אור ההלוגן. תנאי תאורה אופטימליים, לאספקת מתח ישתנו מהגדרת אחד למשנהו. עבור ההתקנה המשמשת בעבודה זו, רווח PMT ~ 10 אפריל - 10 מאי הוכיח את יעילותו. כל מכפיל היה מכוסה למעט חרך 3 x...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

על מנת להקל על מעקב חרוז קשור ואמידה נכונה של מגבילי מנוע, את המידע הבא צריך להיבדק. בעת ביצוע מדידות אלה עם תאים והולקה בשוט, הגז הוא שלב קריטי. גזיזה מפחיתה את נימת flagellar כדי בדל גרידא, ובכך להבטיח כי העומס הצמיג על המנוע הוא בעיקר בשל החרוז ניתן לאמוד בתוך 10% שגיאה 16. גזיזה גם משפרת את הסיכוי למצוא מסלולים עגולים עם מוזרויות מופצות בחוזקה (<חרוז בקוטר 14). תוצאות גז פסולת מסלולים סוררים, אשר תרכובות טעויות מעקב בחישוב שאיפות צמיגות, כמו גם וכתוצאה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים להווארד ברג על תרומת המיקרוסקופ/מכפילי הפוטו העוקבים אחר חרוזים ותחנת הניסויים ההנדסיים של טקסס A&M עבור מימון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת פולי-L-ליזין (0.1%)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 מ"ל Luer מזרק קצה החלקהExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
קליי אדמס Intramedic Luer-Stub מתאם 23 מדBecton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
צינורות פוליאתילןהרווארד מנגנון59-8325
http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html פוטו-מכפיל צינורותHamamatsuR7400U-20טווח תגובה ספקטרלי של 300 עד 920 ננומטר, אורך גל שיא 630 ננומטר,   זמן תגובה של 0.78 ns 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
חריצים מדויקים 3 x 1 מ"מEdmund OpticsNT39-9082 חריצים המותקנים בזווית ישרה זה לזה על צינורות פוטו-מכפיל
אוסילוסקופTektronixTBS 1032Bמותגים אלטרנטיביים מקובלים. אוסצילוסקופ דיגיטלי, סדרת TBS 1000B, 2 אנלוגי, 30 מגה-הרץ, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 קוטבי LP/HP מסנןKrohn-Hite3384מותגים אלטרנטיביים מקובלים. מומלץ טווח תדרים מ-0.1 הרץ עד 200 קילו-הרץ.     
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
מיקרוסקופ OptiphotNikonNAניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פאזה זקוף או הפוך.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) מפצל קרן קובייהThorLabsBS013

מקורות

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Photomultiplier
אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.