סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

סיכום

מוצג פרוטוקול לסובלימציה של מטריצת DAN על רקמת מוח של חולדה לזיהוי גנגליוזידים באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI.

תקציר

להכנת דגימות הוא המפתח לגילוי אופטימלי וויזואליזציה של analytes ב Desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) ניסויים. קביעת הפרוטוקול המתאים לעקוב לאורך כל תהליך הכנת המדגם יכול להיות קשה כמו כל צעד חייב להיות מותאם על מנת לקיים את המאפיינים הייחודיים של analytes עניין. תהליך זה כרוך לא רק במציאת מטריצה ​​תואמת שיכול desorb ו ליינן המולקולות של עניין ביעילות, אלא גם בחירת הטכניקה בתצהיר המטריצה ​​המתאימה. לדוגמא, טכניקה בתצהיר מטריצה ​​רטובה, שמשמעותה המסה מטריצה ​​ממסה, היא מעולה עבור desorption של רוב החלבונים ופפטידים, ואילו טכניקות בתצהיר מטריצה ​​יבשות יעילות במיוחד יינון של שומנים. סובלימציה דווחה כשיטה היעילה ביותר של בתצהיר מטריצה ​​יבש לצורך זיהוי של שומנים ברקמות ידי MALDI IMS בשל homogeneity של בתצהיר קריסטל מטריקס delocalization אנליטי מזערי בהשוואה לשיטות בתצהיר רטוב רבות ^{1, 2.} באופן כללי, זה מתבצע על ידי צבת מדגם מטריקס אבקה בתא אטום ואקום עם הדגימות נלחצו משטח קר. המנגנון הוא הוריד ואז לתוך אמבט מחומם (חול או שמן), וכתוצאה מכך סובלימציה של מטריקס אבק על שטח מדגם רקמות המקורר. כאן אנו מתארים פרוטוקול סובלימציה באמצעות 1,5-diaminonaphthalene (DAN) מטריקס לאיתור להדמיה של gangliosides במוח החולדה באמצעות MALDI IMS.

מבוא

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) הופכת מאד מבוקש טכניקה להדמיה של הפריסה המרחבית של שומנים, פפטידים וחלבונים על פני משטחים מדגם שלמים. MALDI IMS היה ידוע בעבר בתור שיטה אנליטית עבור analytes מראש מטוהרים, אך בשנים האחרונות, זה כבר למשוך תשומת לב בתחומים רבים אחרים בגלל היכולת לשלב את הדיוק של ספקטרומטריית מסה עם נקודות התייחסות אנטומית / וידאו ברזולוציה גבוהה ללא צריך עבור כל תיוג חיצוני. כמו הברכה המדעית של חוקרי שימוש בטכניקה זו ממשיכה לגדול, שם הוא גדל צורך סטנדרטי, קלים לעקוב פרוטוקולים כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של ניסויי IMS. Gangliosides, קבוצה של ליפידים קרום בהיקף נרחב ביותר במערכת העצבים המרכזית, הם אידיאליים עבור ניסויים MALDI IMS כמו מיקומם, מוטבע בתוך הממברנה, גורם ספציפי מסויםes בלתי אפשרי לזהות באמצעות תיוג חיסוני קונבנציונלי. בנוסף, הראינו, באמצעות MALDI IMS, כי שומנים אלו, אשר מתפקדים מאפננים של איתות תאית, בין יתר, יש דפוסי תפוצה אנטומי ייחודיים במוח המכרסם הבריא כי הם שינו לאחר פגיעה מוחית ^{3, 4, 5.} Gangliosides ממוקם מגוון מסה גבוה יותר בהשוואה למיני השומנים ביותר, ועל כן הם מתאימים ביותר פלטפורמת הדמית MALDI.

איור 1: Workflow של ניסוי MALDI IMS. תרשים של זרימת העבודה הכללית של ניסוי IMS MALDI באמצעות סובלימציה. רקמות קפואות ב -80 ° C מחולקות בתוך cryostat ו -10 מיקרומטר חלקים הם הפשרה רכובה על גבי שקופיות איטו מוליך. השקופית ממוקמת אז ייבוש עד סובלימציה. SLIdes מוכנס לתוך מנגנון סובלימציה וכן גם שכבה של מטריקס מוחלת על פני שטח מדגם רקמות. דוגמאות מוקפא לילה במקפיא -20 מעלות צלזיוס ממוקם אז ייבוש במשך 10 דקות. לאחר סטנדרטים יושמו, הדגימות מוכנסות לתוך מכשיר MALDI שבו ליזר מכוון על פני הרקמה גורמת מולקולות desorbed במטריצה ​​כדי ליינן. היונים לנסוע במורד צינור טיסה ונפרד מבוסס על המסה שלהם (זמן של טיסה / TOF) עד שהם מגיעים אל הגלאי. המידע על השפע היוני של analytes בתוך מסה-אל-תשלום קבוע מראש (m / z) טווח מוצג גם תמונה מולקולרית ספקטרום המוני. נתונים אלה יכולים לשמש הם לחזות ולכמת את השפע היוני של אנליטי של עניין בתוך רקמת ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

להכנת דגימותעבור MALDI IMS הוא משתנה מאוד כמו כל שלב של התהליך חייב להיות מותאם אישית אל analytes עניין. התכונה המגדירה של ניסויים מבוססים MALDI היא השימוש ציפוי מטריקס מופקד על פני השטח המדגמים לפני הניתוח. בנוסף לתפקיד של קליטה והעברת אנרגית קרינה מהליזר במהלך תהליך אבלציה, המטריצה משמשת גם כדי לבודד analytes השונה מן המדגם, ובכך מקלות על הניתוח של תרכובות של עניין ^{6, 7.} יישום אחיד של המטריצה ​​אל פני שטח המדגם הוא הצעד החיוני ביותר בתהליך הכנת המדגם. בתצהיר מטריצה לא נכון יכול להוביל תצורות גביש מטריקס הטרוגניות גדולה בפיתוח של חפצים, אות-יון נמוך, ו ^-7 שחזור עניים.

בשל הזיקה של מטריצות מסוימות לבודד analytes הספציפי, הסוג של מטריקס נבחר לניסוי יכוללשנות את התוצאה באופן משמעותי. המטריצות המשמשות הדמיה של חלבונים ופפטידים לעתים קרובות שונות מאלה המשמשים שומני הדמיה והתהליך מסתבך עוד יותר על ידי הצורך בהליכים נוספים כגון צעדי כביסה להחזרת נוזלים כדי לזהות אותות בהצלחה מרקמות. למרות צעדי כביסה להתקיים להגברת אותות שומנים ^8, הם לא תנאים הכרחיים לצורך זיהוי של רוב מיני שומנים. בעת בחירת מטריקס עבור ניסוי הדמית שומנים, חשוב לשקול את הקוטביות של השומנים של עניין כמו זה יהיה לצמצם את הטווח של מטריצות מתאימות. לדוגמא, gangliosides להכיל שאריות חומצת sialic המקנות להם קוטביות שלילית הכוללת. ישנם מספר של מטריצות שיכולים desorb ביעילות ליינן gangliosides מרקמות; עם זאת, גורמים כגון פסגות הנגזרות מטריקס בספקטרום והיציבות של מטריקס תחת ואקום חייבים יילקחו בחשבון. 1,5-diaminonapthalene (DAN) מטריקס היא יציבה מספיק בתנאי ואקום מכשיר עבור רוב יישומי הדמיה הוכיחה רמה גבוהה של רגישות desorption שומנים ויכולה לשמש לניתוח של שומנים הם מצבי יון חיוביים ושליליים ^2. DAN מטריקס, בהשוואה מטריצות זיקה השומנים שליליות אחרות כגון חומצה dihydroxybenzoic (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), ו -5 כלורו-2-mercaptobenzothiazole (CMBT), הצליח desorb gangliosides ביעילות ביותר מהמוח חולדה רקמות במצב יונים שליליים (כתב יד בהכנה).

בחירת השיטה המתאימה של בתצהיר מטריצה ​​היא בעלת חשיבות שווה בחירת המטריצה ​​עצמה. שיטות בתצהיר מטריצה ​​רטובות שבו המטריצה ​​המוצקה מומסת ממס אורגני, ותופקדנה על פנאומטי או אוטומטית מתזים או תצפיתנים, יעילות במיוחד עבור desorption של חלבונים ופפטידים בעוד הנוזל מחלחל המדגם כדי לאפשר תוספתction של תרכובות ושיתוף התגבשות עם מטריקס. למרות ששיטות אלה יכולים לשמש גם עבור יישומי שומנים, delocalization אנליטי ותצורות קריסטל מטריקס אחידה היא תופעה נפוצה בשל שפע המסיסות הגבוה של שומנים ממסים, במיוחד ברקמה ^{2, 9.} בגלל שומנים הופכים להיות מיוננים בקלות מרקמות, טכניקות בתצהיר מטריצה ​​יבשות, כגון סובלימציה, להציע אלטרנטיבה יעילה פשוטה, עלות מתזים תוך עקיפת רבי החסרון של טכניקות אלה. ההצלחה של סובלימציה בניסויים MALDI IMS מיוחסת תכונות כגון מורפולוגיה מטריקס מיקרו דבר המגדיל את שטח הפנים החשוף-אנליטי מטריצה מחייב, טוהר מטריקס גדל, בתצהיר מטריצה הומוגנית המוביל שחזור מוגברת בהשוואה לטכניקות מטריקס רטוב ^{1, 10.}

סובלימציה involves חימום מטריצת אבקה תחת ואקום מייד מתחת לפני שטח מדגם מקורר וכתוצאה מכך מוצק המעבר לשלב גז של מטריקס האבקה ואחריו בתצהיר על פני שטח מדגם רקמות. במהלך סובלימציה, בתצהיר מטריקס יכול להיות נשלט על ידי גורמים שונים כגון זמן, טמפרטורה ולחץ כדי לספק תוצאות מאוד לשחזור. ניסוי סובלימציה יחיד יכול לקחת בין 5 ל 20 דקות, תלוי בסוג של מטריקס נבחרה, אשר ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כמה פעמים לפני סילוק. המנגנון ניתן לרכוש מסחרי בכל חלק של המחיר של מתזים אוטומטיים נלקח בקלות בנפרד לניקוי ותחזוקה. עלות נמוכה הפשטות היחסית של טכניקה בתצהיר מטריצה ​​זו להפוך אותו אידיאלי עבור חוקרים מתחילים או הרחבת על יישומי הדמיה ליפיד MALDI IMS. אף כי מידע המפרט פרוטוקולים סובלימציה של רקמות עבור IMS דווחו ^11, כמה פרוטוקולים סטנדרטיים קיימים which להתמקד העבודה הבסיסית מעורבת עם ביצוע ניסוי סובלימציה הדמית שומני מסה גבוהים במצב יונים שלילי, ולכן קשה לקבוע את הטכניקה ללא ניסוי וטעייה נרחבים. להלן פרוטוקול הניסוי במטרה למלא את החלל עבור סובלימציה של מטריקס DAN על חלקים במוח החולדה הדמיה ברזולוציה גבוהה וזיהוי של gangliosides.

איור 2: מכשירי סובלימציה. תצלום (א) ו תרשים סכמטי (B) של מנגנון סובלימציה. משאבת הוואקום מחוברת באמצעות צינור גומי ל מלכודת קרה מלאה 300 מיליליטר של אתנול. המלכודת הקרה מחוברת אז על ידי צינורות גומי למנגנון סובלימציה. המנגנון הוא מורכב משני חלקים נפרדים של כלי זכוכית שאינם חתומים יחד עם מתכת U-משותף. המחצית העליונה של sublimatorמכיל הקבל אשר מתמלא רפש קרח. צלחת המדגם היא מודבקת על החלק התחתון של הקבל, בתוך התקן הזכוכית האטום. המחצית התחתונה של מנגנון סובלימציה מכילה מטריצת DAN, פרושים מול צלחת המדגם באופן שווה. במהלך סובלימציה, מנגנון הזכוכית מושם על אמבט חול מחומם ל -140 מעלות צלזיוס על ידי פלטה חשמלית ישירות מתחתיה. חללית הטמפרטורה עוזרת לשמור על טמפרטורה יציבה לאורך ניסוי סובלימציה באמצעות משוב של טמפרטורת חול האמבטיה לעומת הטמפרטורה מראש עבור הניסוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פרוטוקול

כל הנהלים טיפול בבעלי חיים כמתואר להלן לדבוק אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים של מערב אונטריו (2016-014).

רקמות 1. הכנת חתך

1. חלץ רקמת מוח מן החולדה באמצעות תהליך המכונה "הפקה הקפואה" (FFE).
   1. להרדים את העכברוש עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital ולפקח רפלקסים בגפיים. לאחר כל הרפלקסים חדלו, לנתק את הראש של החולדה באמצעות הגיליוטינה.
   2. בזהירות להפריד את השרירים ורקמות אחרות מהגולגולת באמצעות אזמל. שימוש במלקחיים חיתוך העצם כדי לשבור את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, החל מבסיס של (מגנום foramen) הגולגולת על החלק הקדמי.
   3. ברגע שהמוח חשוף, בזהירות ולשלוף אותו עם מרית כירורגית ומיד מניחים על קרח יבש כתוש להקפאה פלאש.
      הערה: המוח יהיה מאוד נזיל. לכן, לקחת בזהירות רבה בעת ביצוע המוח עלקרח יבש. אם המוח הוא כתוש או נלחץ משטח, זה ישנה את צורתו ולהקפיא במצב הזה.
2. סרה של רקמה קפואה (לא perfused עם פורמלדהיד או מוטבע אוקטובר) מ - 80 ° C במקפיא ומניחים על קרח יבש.
3. מניחים כמה טיפות של מים על בעל cryostat ומניחים על קרח או יבש או סרגל ההקפאה cryostat. רקמת לחץ קלה על בעל cryostat כפי שהוא מתחיל להקפיא וחזק עד קפיאת מים מסביב לבסיס של הרקמה ומעגן אותה במקום. מוסיף מים נוספים בהמשך לאבטח את הרקמה על הבעל במידת צורך.
   הערה: מים משמשים במקום מדיה אוקטובר הרכבה רקמה על מנת למנוע זיהום של הרקמה עם תרכובות אשר יכול להשפיע על הגילוי של האות הרצויה.
4. רקמת תפקיד cryostat. קטע רקמה עד המיקום האנטומי הרצוי. ודא כי עובי החיתוך הוא בין 8 - 12 מיקרומטר.
   הערה: כאשר חתך רקמות cryostat הקהילתיתהתקנים, קיים הכרח כי חומרים נפרדים כגון להבים, מברשות, ברים אנטי רול, ומחזיקי לשמש כדי למנוע זיהום עם הטבעה תרכובות. החלק הפנימי של cryostat צריך גם לנקות ביסודיות עם אתנול לפני השימוש.
5. שימוש בסרגל אנטי רול cryostat, לאט סעיף בברוטליות סעיפים רקמות. חורים או סימונים על הרקמה יכולים להתרחש אם המיקום בר רול שגוי או להב הוא משעמם. הזז את הרקמה למרכז חיתוך פלטפורמה בעזרת מכחולים נקיים.
6. הַרכָּבָה
   1. להקפיא שקופיות מוליך או לוחות מתכת על ידי הצבתם cryostat בזמן שחתך. כאשר השקופית היא קפוא לחלוטין, בזהירות להעביר את הרקמה מחולקת על פני שטח המוליך של השקופית באמצעות מכחולים נקיים. לאחר כל קטעי הרקמה ממוקמים בצורה נכונה בשקופית, מניח אצבעות מתחת למגלשה, מול הרקמות, ולחץ עד הקטע מפשיר.
      הערה: ייתכן שחלקים עשויים לקפל או להתכרבל במהלך תהליך ההפשרה כאשרבשיטת הרכבה זה. זה יכול להיות מופחת על ידי שמירה על שקופית cryostat כאשר מפשיר הרקמה. אם הבעיות אלה להיות בעייתיות, אלטרנטיבה, שיטה חמה-mount היא מפורטת להלן.
   2. לחלופין, לקחת תחמוצת אינדיום-בדיל בטמפרטורת חדר (איטו) שקופיות (או צלחת מתכת) ואת לחץ בעדינות על קטע רקמה קפוא על פני שטח פלטפורמת החיתוך, בצד מוליך למטה. זה יוביל את הפשרת קטע הרקמה באופן אחיד על פני השטח של השקופית עם סלסול קטן או קיפול של הרקמה.
      הערה: עיבוי עשוי להופיע שמתחת לקטע כאשר גוברים בשיטה זו אשר עלולה להוביל לאובדן של חלבונים ושומנים מסוימים.
7. מניחים שקופיות עם רקמת ייבוש עבור 5 - 10 דקות.

2. Apparatus Sublimator הגדרה

הערה: בצע את השלבים הבאים במנדף.

1. מניח באמבט חול במכל אלומיניום על פלטה חשמלית, עם הפלטה החשמלית על מעלית מספרי מתכתשל שטח פנים המתאים (כלומר גדול יותר הפלטה החשמלית). הפעל את הצלחת החמה להגדיר את הטמפרטורה ל -140 מעלות צלזיוס.
   הערה: נקודת ההתכה עבור מטריקס DAN היא בין 187 - 190 ° C. אין לעבור טמפרטורה זו על הפלטה החשמלית.
   1. אם הצלחת החמה מצוידת חללי משוב טמפרטורה, להשתמש בו כדי לעקוב אחר טמפרטורת חול לאורך הניסוי ולהבטיח עקביויות טמפרטורה. תכונה זו יכולה לסייע עם שחזור ניסוי על פני ניסויים סובלימציה שונים.
      הערה: אמבט החול צריך להיות בתוך מיכל אלומיניום כמכל זכוכית עלולה לנפץ בטמפרטורות גבוהות.
2. מניח 300 מ"ג של מטריקס DAN על המשטח התחתון של מנגנון סובלימציה. מניח את המטריצה ​​במרכז המנגנון והתרווח שכבה אחידה של רוחב ואורך המשוער של השקופית להיות מעודן.
   זהירות: מטריקס DAN הוא רעיל. לכן, כפפות ללבוש חשובה, מסכות, ובטיחותמשקפים בכל העת במהלך הטיפול בו מטריצת האבקה. DAN יש לאחסן בחושך כפי שהוא רגיש לאור.
3. קלטת לוחית מתכת על פני השטח הפנימיים של המנגנון עם הצלחת ליצור קשר ישיר עם החלק התחתון של הקבל כדי להבטיח חלוקה שווה של טמפרטורת קירור על פני כל השטח של השקופיות במהלך סובלימציה. לחלופין, חול התחתון של הקבל כדי להבטיח משטח שטוח.
   1. מניח את הקלטת לאורך השולים החיצוניים של הצלחת לדבוק צידי הזכוכית הפנימית. אם הסרט ממוקם מתחת הצלחת ואת שומר על החלק התחתון של משטח הזכוכית הפנימי, חלוקת הטמפרטורה לא יכולה להיות אפילו ועלולה להוביל הפצה מטריקס אחידה על פני השטח של השקופית.
   2. קלטת (מבחן) ריק להחליק באלכסון על פני השטח של צלחת מתכת עם הקלטת להציב שוב על השוליים החיצוניים של השקופית.
4. חבר את החלקים העליונים ותחתונים של המנגנון, wה- i O-Ring גומי באמצע כדי להבטיח חותם שלם.
5. מניח מתכת U-משותף סביב מרכז המנגנון ודק מידות רעות עד החצי העליון ותחתון של המנגנון נסגר בחוזקה. מניח את אטם המתכת מעל אמבט החול.
6. לוקחים חופן קרח כתוש ולמקם אותו הקבל. מלאו קבל ¼ כדי ½ מלא עם מים קרים כדי ליצור רפש קרח. רפש הקרח יקרר את לוחית המתכת על החלק הפנימי של המנגנון ובהמשך השקופית דבק בו. חכו לפחות 5 דקות על הטמפרטורה להגיע למצב יציב.
7. יוצקים 300 מ"ל של אתנול בתוך המיכל מלכודת קר ומניחים את כלי הזכוכית לתוך המיכל. זרוק 2 - 3 חתיכות קטנות של קרח יבש לתוך אתנול בתחתית המיכל מלכודת קר. קלט המלכודת הקר יש שפופרת זכוכית פועלת לתחתית של הגליל, ואילו התפוקה לא.
8. חבר את משאבת הוואקום לפלט המלכודת הקר באמצעות צינור גומי. השתמש עוד פיסת גומיצינורות לחבר את הקלט מלכודת הקרה למנגנון סובלימציה. ודא כי הצינורות מהודקים היטב באמצעות מלחצי מתכת אם זמין.
9. השתמש משאבת ואקום כדי לספק ואקום של 30 - 50 מטרים. אפשר המשאבה לפעול במשך לפחות 5 דקות על איזון לחץ. מידות רעות על U-טבעת של מנגנון סובלימציה ייתכן שתהיינה צורך להדק שוב פעם את משאבת הוואקום מופעלת בגלל לחץ ירד במנגנון.
   הערה: מומלץ מאוד כי מד ואקום לצרף המשאבה לפקח על הלחץ של ואקום במהלך הניסוי וכדי לבדוק דליפות לחצו על מנת להשיג את השחזור הגבוה ביותר האפשרי בין ניסויים. עם זאת, רוב המשאבות נועדו לשמור על לחץ קבוע, ולכן המד לא יכול להיות חיוני עבור משתמשים מנוסים. בנוסף, גריז ואקום חותם יכול לשמש כדי לעזור לשמור על לחץ ואקום.

3. סובלימציה

1. ודא כי הטמפרטורה באמבט חול יש stabilized ב 140 מעלות צלזיוס, כי המנגנון מאובטח ב O-Ring המתכת מעל אמבט החול עם כל הצינורות המחוברים ואת הוואקום מופעל.
2. כוונו את הטיימר עבור 7 דקות אבל לא להתחיל טיימר. לאט להעלות את מי האמבט להרים וחול מספריים למנגנון סובלימציה עד U-משותף של sublimator הוא הרבה מעל טבעת O מתכת. שטח נוסף זה מאפשר התאמה של המנגנון על החול.
   1. במהירות ללחוץ על sublimator בעדינות על פני השטח בחול על מנת להבטיח כי המנגנון יושב באופן שווה על החול, ולאחר מכן מיד להפעיל את הטיימר.
3. כאשר הטיימר נשמע, לכבות את משאבת ואקום ובזהירות להנמיך את המעלית מספריים עד sublimator כבר לא נוגע אמבטיה בחול יושב בבטחה המתכת O-Ring.
   1. לאט לשחרר את שסתום מיקרו-vent לשחרר לחץ במנגנון. שחרר את מהדק המתכת סביב צינור הגומי של מנגנון סובלימציה ולאט לאט מתחיל להתרופף הצינור. לאחר ruצינור bber כבר התיר מעט, לכופף את הצינור לצד אחד כדי לאפשר ללחץ שיורית לברוח.
   2. כאשר חוזר בלחץ הסביבה, להסיר בזהירות את צינורות גומי מן המנגנון סובלימציה.
4. שחרר את המידות הרעות על U-משותף של המנגנון ולהסיר. בזהירות להפריד את שני החצאים של מנגנון סובלימציה לשלוף את השקופית מלמעלה של הזכוכית הפנימית. בדוק שקופיות כדי לאשר חלוקה שווה מטריקס.
   הערה: אם המטריצה ​​אינה אחידה, מטריצת האבקה התחתונה של sublimator ניתן למקמו מחדש או במנגנון sublimator ניתן למקמו מחדש בחול עבור לשקופית הבאה. תהליך סובלימציה ניתן לחזור מספר פעמים תוך שימוש באותו מטריקס, עם זאת, המטריצה ​​בסופו של הדבר תהפוך כהה מחשיפה חומה חוזרת בכמות האבקה תקטן כך זמן סובלימציה יצטרך להיות מותאם מעט כדי לפצות על כך. מסיבה זו, חשוב לפקח על כמות מטריקס being סובלימציה לאחר כל ניסוי כדי להבטיח עקביות בתצהיר מטריצה ​​בין שקופיות
5. אם החלוקה תהיה וכמות מטריקס סובלימציה מספיקה, קלטת שקופית חדשה עם רקמות על החלק הפנימי של סעיף sublimator וחזור 3.
   הערה: עבור בקרת איכות (QC) למטרות, בסך של מטריקס סובלימציה ניתן למדוד לאחר כל ניסוי על ידי שקילת השקופיות לפני ואחרי סובלימציה חלוקת המשקל של מטריקס סובלימציה עם שטח הפנים של השקופית ^2, יש לציין כי בשל חוסר הדיוק של רוב הכף מעבר ל -4 נקודות עשרוניות ולהבדלים בין סולמות, מדידות אלה צריכים להיות לשמש רק מדריך להפקדה מטריקס אופטימלית בניגוד אמצעי לכימות מלא של QC אלא איזון דיוק גבוה משמש (ראה איור 3).

4. רקמות חפצים / Rehydration

1. לאחר סובלימציה, חנות שקופיות במיכל אטום או קאס קטןette בתיק ניילון אטום.
2. דגירת שקופיות במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות או למשך הלילה.
   הערה: המטרה של תהליך ההקפאה היא לפעול כצעד התייבשות עבור desorption של חומרים רקמה לתוך המטריצה. תהליך ההקפאה גם הוכח כדי למנוע שפלה של אותות שומנים עד 1 שבוע, כאשר הם מאוחסנים ב -80 ° C ^12. מסיבה זו, את הכמות זמן הדגימות מאוחסנות במקפיא יכולה להיות מגוונת במידה מסוימת כדי להתאים לצרכימים של הנסיין מבלי לשנות זיהוי אותות משמעותי (כפי שנצפה במעבדה שלנו). עם זאת, יש לנו לב כמה דהוי של מטריקס כאשר דגימות קפואות למשך זמן ארוך יותר מ -24 שעות ב -20 מעלות צלזיוס. לפיכך, אנו ממליצים הדמית רקמת סובלימציה לפני הזמן או לאחסון רקמות ב -80 מעלות צלזיוס במשך תקופות דגירה כבר.
3. סר שקופית מהמקפיא (מיכל) ומניח ייבוש למשך 5 - 10 דקות.

הדמיה 5. ו- Analysis

1. סר שקופיות ייבוש וליישם סטנדרטים מכשירים כדי להבטיח דיוק המוני של מכשיר MALDI במהלך הדמיה. הסוג של סטנדרטים ישתנה בהתאם מכשור. התקנים מיושמים בדרך כלל באופן שווה על פני השקופית כולה, לרקמות להיות צילמו (איור 3D).
2. הוסף שקף לתוך מכשיר MALDI אחרי הוראות יצרן עבור ניסויי הדמיה (שיטות מכשיר צריכות להיות מותאמות עבור 1,000 - טווח המוני 2,000). תוצאה נציג (איור 4) נרכשה במצב שלילי reflectron עם רסטר 70 מיקרומטר ו 20 יריות / ספקטרום (רכישת זמן ~ 2 ח).

תוצאות

עם השלמת ניסוי סובלימציה, שני החצאים של התקן הזכוכית מופרדים ב למכסת המנוע קטר ואת השקופיות, מודבקת הקבל, ניתן להסיר (איור 3 א). בשלב זה, את השקופית יש לבחון להפצה מטריקס אחידה ואת הזמן, טמפרטורה, או מיקום של המנגנון באמבטית החול עשוי להיות מותאם עבור לשקופית הבאה. ניסוי סובלימציה DAN מוצלח יגרום ציפוי אפילו של מטריקס אפור / חום על פני השטח של השקופית שבה התכונות אנטומיות של הרקמה ניתן דמיינו בבירור וכמות מטריקס בשקופית הזכוכית דומ...

דיון

עבודה זו מפרטת פרוטוקול סטנדרטי של סובלימציה מטריקס על רקמות לצורך זיהוי של שומנים טעונים שלילית, כגון gangliosides, בניסויים MALDI IMS. לדוגמא כהכנה MALDI IMS הוא משתנה מאוד וחייב להיות מותאם אישית כדי להתאים את המאפיינים הייחודיים של אנליטי של עניין. היישום של מטריקס על גבי משטח דגימת רקמה היא היבט חיוני של תהליך הכנת המדגם לגבי איכות התוצאות IMS. זהירות מיוחדת יש לנקוט בעת בחירת מטריצות, על מנת להבטיח כי מטריקס תואם אנליטי של עניין והוא ללא ממצאים שמקורם מטריצה ​​בספקטרום. סובל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סובלימטור	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
מטריצת 1,5-Diaminonapthalene (DAN)	Sigma-Aldrich	D21200	100 גרם
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
פלטה חמה עם משוב טמפרטורה	Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
שקע נירוסטה	Thermo-Fisher Scientific	2216479	10x10
מלכודת			בהתאמה אישית נבנה באתר
משאבת ואקום	פרנקלין אלקטריק	1102180403	Savant VP100 דו-שלבי
אינדיום-תחמוצת פח (ITO) שקופיות	הדסון משטח	טכנולוגיה PSI 1111000	סוג II, 1.1 מ"מ/25 כל אחד
MALDI TOF/TOF 5800 מכשיר	AB Sciex
Desiccator	Sigma-Aldrich	D2797	מייבש שולחן