מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

סיכום

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

תקציר

Mycobacterium tuberculosis, הגורם לשחפת, הוא גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. עם ההתפשטות המוגברת של שחפת עמידה לתרופות מרובות (MDR-TB), יש דחיפות אמיתית לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד זיהומי שחפת. באופן מסורתי, תרכובות מוערכות על סמך פעילותן האנטיבקטריאלית בתנאי גידול במבחנה במרק; עם זאת, לעתים קרובות התוצאות מטעות עבור פתוגנים תוך-תאיים כמו שחפת, שכן תנאי הסקר הפנוטיפיים במרק שונים באופן משמעותי ממצבי המחלה בפועל בגוף האדם. סינון מעכבים הפועלים בתוך מקרופאגים היה קשה באופן מסורתי בשל המורכבות, השונות בזיהום וקצב השכפול האיטי של M. tuberculosis. במחקר זה, אנו מדווחים על גישה חדשה להערכה מהירה של יעילות התרכובות על הכדאיות של M. tuberculosis במודל זיהום מקרופאגים. באמצעות שילוב של בדיקת ציטוטוקסיות ובדיקת כדאיות M. tuberculosis בתוך המרק, הצלחנו ליצור מערכת סינון המייצרת ניתוח מקיף של תרכובות מעניינות. מערכת זו מסוגלת לייצר נתונים כמותיים בעלות נמוכה הנמצאת בהישג ידן של רוב המעבדות ועם זאת ניתנת להרחבה גבוהה כדי להתאים לסביבות תעשייתיות גדולות.

מבוא

שחפת Mycobacterium, הסוכן סיבתי של שחפת (TB), היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם. Drug-רגיש TB היא מחלה שניתן לטפל הדורשת אנטיביוטיקה מרובה לתקופה של 6 חודשים. למרות היותו מחלה שניתן לטפל בה, תמותת TB נאמד ב -1.5 מיליון 2015 ^1. בשנת 10 השנים האחרונות, התרבו חששות השכיחים של שחפת עמידה לתרופות. Multidrug העמיד TB (MDR-TB) מוגדר TB כי הוא עמיד לפחות איזוניאזיד (INH) ו ריפמפיצין (RMP), ורוב זני MDR-TB הם עמידים גם לבחור סמי TB קו שני, ובכך להגביל את אפשרויות טיפול . ההשפעות של עמידות לתרופות ליצור אתגר גדול לטיפול בחולים במשותף נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV); 400,000 חולים ברחבי העולם מתו משחפת HIV הקשורים ב 2015 ^1. למרבה האכזבה, ארצות הברית המזון והתרופות Administיחס אישר תרופה חדשה TB אחד בלבד נגד MDR-TB, bedaquiline, ב ² 40 השנים האחרונות. מקדם במציאת טיפולי TB טובים יותר קצרים יותר יש צורך דחוף כדי להקדים במאבק נגד שחפת MDR-TB.

באופן מסורתי, מסכי סמי TB מבוצעים בתנאי גידול במבחנה במדיום גידול, לפיו תרכובות מתווספות תרבות גוברת והאפקטיביות שלהם בביעור מיקרואורגניזמים נקבעות על ידי ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) על מדיום מוצק. כמו ספירת CFU הם עבודה אינטנסיבית, גוזל זמן יקר, שיטות עקיפות שונות פותחו כדי להקל על בעיה זו. שיטות אלו כוללות את assay הכדאיות הכחולה Alamar ^3, קביעה של קרינה ⁴ מ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או הארה ⁵ מחיידקים להביע בלוציפראז, ואת הערכת אדנוזין אדנוזין הכולל (אTP) ^{6, 7.}

TB האופיינית מאופיינת זיהום שחפת של הריאות, שבו החיידקים מתגוררים ולשכפל בתוך phagosomes של מקרופאגים המכתשית ^8. מסך פנוטיפי ב-מרק פשוט עשוי להתאים פתוגנים תאיים; עם זאת, בפרספקטיבה היסטורית, פגע תרכובות נגד שחפת מזוהה בשיטה זו לעיתים קרובות אינם מצליחים לעמוד בציפיות במהלך השלבים אימות במורד הזרם מודלים זיהום. אנו מציעים כי תרופת TB מבוצעת טוב מודל זיהום תא מארח תאי. עם זאת, מודלים תאיים בעלי חסמים טכנולוגיים ביולוגיים רבים לפיתוח הקרנת תפוקה גבוהה (HTS). מכשול גדול הוא המורכבות של תהליך ההדבקה, שהודגם על ידי צעדים רבים וההסרה המשוכללת של חיידקים תאיים על ידי ב-בין הכביסה. משוכה משמעותית שנייה היא מחדש הזמן הממושךquirements, כמו גילוי גידול, בדרך כלל נעשה על ידי CFU לספור על צלחות תרבות, הוא תהליך שלוקח מעל 3 שבועות כדי להשלים. פתרון אחד כדי להחליף ספירת CFU סופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי בשילוב עם חיידקים פלורסנט. עם זאת, פתרון זה דורש השקעה בציוד ראשונית כי הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. פשוט, בעלות נמוכה, ושיטת HTS הרלוונטית-מחלה היו מאוד לשפר את תהליך גילוי תרופות.

במחקר זה, אנו מדווחים מערכת HTS חדשה, מודולרי, המכוונת מתן מהיר, ו מדרגית, עדיין חסכוני, assay מתאים לקביעת הפעילות של תרכובות נגד שחפת תאיים. מערכת זו מורכבת משלושה מודולים: (i) תאי, (ii) רעיל לתאים, וכן (iii) מבחנים-מרק. התוצאה הסופית בשילוב מספקת תיאור מקיף של התכונות המתחמות, עם מידע נוסף לגבי מצב פוטנציאלי פעולה. SC זהreening מערכת נעשה שימוש במספר פרויקטים עם ספריות מתחמות שונות למקד במצב של פעולה, כוללים הניתוח של סינרגיה סמי ^9, הגירוי של autophagy ^10, ואת העיכוב של שחפת -secreted גורם ארסי (לא פורסם). תרכובות של מצב ידוע של פעולה גם נחקרו ^11. גרסה שונה של שיטה זו אומצה גם על ידי שיתוף הפעולה עם התעשייה שלנו כשיטת ההקרנה העיקרית לזהות תרכובות חדשות נגד שחפת תאיים מ ^11.

פרוטוקול

1. זן חיידקים וצמיחה בינוני

1. הפוך דקסטרוז אלבומין פתרון מניות מלח (ADS) על ידי solubilizing 25 גרם של אלבומין בסרום שור, 10.0 גרם של דקסטרוז, ו 4.05 גרם של נתרן כלורי ב 460 מ"ל של מים ללא יונים. מסנן לעקר את המודעות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
2. הפוך 7H9 מרק ידי הוספת 4.7 גרם של 7H9 אבקה 2 מ"ל של גליצרול כדי 900 מ"ל של מים מטוהרים. החיטוי מרק 7H9 ב 121 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. הפוך 7H9ADST ידי הוספת 100 מ"ל של מודעות 0.5 מ"ל של Tween80 כדי 900 מ"ל של 7H9 מרק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. לשקול 50 מ"ג של סולפט kanamycin ו להתמוסס 1 מ"ל של מים ללא יונים; הריכוז הסופי הוא 50 מ"ג / מ"ל. מסנן לעקר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להוסיף 0.5 מ"ל של Kanamycin פתרון מניות לכל 1 ליטר של 7H9ADST.
   הערה: בינוני זה צריך להיעשות טרי, כך לטפס על הכרכים כראוי בהתאם לגודל התרבות.
4. לגדול מ שחפת ב 7H9ADST בתוספת kanamycin בעמידת התרבות. Shake התרבות היומי לדלל אותו לפני OD600 מגיע 1.0 להימנע clumping.
   הערה: זן שחפת המשמש לפיתוח שיטה זו H37Rv טרנספורמציה עם pJAK2.A פלסמיד ^12. pJAK2.A הוא פלסמיד אינטגרטיבי המבוסס על וקטור pMV361, המאפשר ביטוי ברמה גבוהה של הגן בלוציפראז גחלילית מן האמרגן hsp60 וניתן לבחור באמצעות kanamycin.

2. THP-1 בינוני ותחזוקה

1. להוסיף 50 מ"ל של סרום שור העובר חום מומת (FBS) ו 5 מ"ל של 200 מ"מ L- גלוטמין ל 500 מ"ל של RPMI 1640 כדי להפוך RPMI בינוני שלם (כ 10% FBS ו 2 גלוטמין מ"מ).
2. לשמור על תרבית תאים THP-1 על פי פרוטוקול סטנדרטי ^13. בקצרה, לגדל תאים THP-1 במדיום שלם RPMI תוך שמירה על צפיפות התאים שערכה 0.2 1 מיליון דולר מ"ל של מדיום בין pasחכם.

3. תפוקה גבוהה הקרנת תאיים באמצעות H37Rv שחפת להביע בלוציפראז

1. מדוד את הצפיפות האופטית של השעיה חיידקי ומתרחבת ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר. חשב את צפיפות חיידקים באמצעות גורם המרה של 0.1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ חיידקים למ"ל.
2. פיפטה את החיידקים מספיק ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. גלולה ב 3000 XG במשך 10 דקות לשאוב את הנוזל. להוסיף 50 μL של בסרום אדם 450 μL של RPMI1640. סולם נפח לנכס ערכים לצורך הניסוי.
3. כדי opsonize החיידקים, להשעות את הגלולה בצפיפות של 1 x 10 ⁸ חיידקים לכל 500 μL של RPMI1640 המכילים 10% בסרום אדם. אפשר התערובת כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. קביעת צפיפות תרבית התאים THP-1 על ידי ספירה עם hemocytometer ו microsco הפוכהפ.
4. גלולת התאים ב מבחנות צנטריפוגה סטריליים 100 XG ו 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות התאים RPMI שלם בצפיפות של 1 מיליון תאים למ"ל. להוסיף phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) לריכוז 40 ng / mL הסופי.
   הערה: זה יהיה המכונה תמהיל הבידול.
5. מערבבים שחפת opsonized עם תערובת בידול THP-1 בכל פנים של 10: 1 ו aliquot התמהיל הסופי 100 μL לכל היטב צלחת לבנה 96-היטב שטוחה תחתונה. באופן קבוע ומערבבים את התערובת על מנת להבטיח אחידות. אפשר בידול וזיהומים להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2.
6. לשטוף את הבארות פעמיים עם 100 μL של RPMI כל. הוספת תרכובות בדילול אל הריכוז הרצוי RPMI שלם דגירה במשך 3 ימים.
7. לשאוב את המדיום מהבארות. להוסיף 50 μL של מגיב בדיקה לוציפראז היטב כל אחד. חותם את הצלחות עם tאיטום צלחת דבק ransparent. אפשר 5 דקות של דגירה על 22 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לקבל הודעה בתוך luminometer ב 1 s לכל היטב.

4. ניתוח Cytotoxicity שימוש 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) Assay ¹⁴

1. למדו להבחין בתאי THP-1 ב RPMI בתוספת שלמה עם 40 ng / mL של PMA צלחות 96-היטב ברורות. לשמור על צפיפות התאים של 1 מיליון דולר מ"ל ו aliquot 100 μL לכל טוב. אפשר בידול כדי להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2.
2. לשאוב את המדיום מבאר ולשטוף אותם פעמים עם RPMI 1640. הוספת תרכובות מדוללות RPMI שלמים אל הבארות. דגירה של 3 ימים.
3. ממיסים 0.5 גרם של MTT ב 100 מ"ל של בופר פוספט (PBS) כדי להפוך את פתרון המניות של 5 מ"ג / מ"ל. מסנן וחנות סטריליים -20 ° C, הרחק מאור; עדיף לעשות את הפתרון הזה טרי.
4. 2.5 h beforדואר תום תקופת הדגירה 3 ימים, להוסיף 25 μL של פתרון MTT היטב כל ולהשלים את תקופת הדגירה.
5. הכן 50% N, לפוראמיד -dimethyl N (DMF) על ידי ערבוב 250 מ"ל של DMF עם 250 מ"ל מים ללא יונים.
6. הכן חיץ החילוץ MTT כדלקמן: לשקול 100 גרם של SDS בבקבוק 500 מ"ל ולהוסיף 300 מ"ל של 50% DMF. החל חום נמוך כדי לאפשר SDS להתמוסס. להוסיף 10 מ"ל של חומצה אצטית טהורה 12.5 מ"ל של 1 M HCl. מלאו עד לציון 500 מ"ל עם 50% DMF; ההרכב הסופי של חיץ החילוץ הוא 50% DMF, 20% SDS, 2.5% חומצה אצטית, ו 2.5% 1 חומצה הידרוכלורית M.
7. בתום תקופת הטיפול, להוסיף 100 μL של חיץ חילוץ (מחומם 45 מעלות צלזיוס כדי לפזר כל גבישים) זה טוב. אפשר תערובת כדי לדגור לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2. קראו את הספיגה ב 570 ננומטר.
   הערה: assay cytotoxicity מבוצע טוב במקביל עם intracellמסך ular שימוש באותן-אצווה וגיל של תאים THP-1.

5.-מרק ניתוח פעילות באמצעות ³ Assay Resazurin

1. לגדול מ שחפת ב 7H9ADST לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - .8 OD _600). לדלל את התרבות עם 7H9ADST כדי 0.01 OD _600. לדלל את התרכובות ב 7H9ADST פי 2 ריכוזי בדיקות aliquot 100 μL של כל תרכובת מדוללת לתוך זה גם.
2. העבר 100 μL של השעית החיידקים מדולל לתוך זה גם. אפשר הצלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עבור 5 ימים. ממיסים 10 מ"ג של resazurin ב 100 מ"ל של מים ללא יונים ולסנן סטרילית.
3. להוסיף 30 μL של פתרון resazurin ולנטר את שינוי הצבע אחרי 48 h; התפתחות חיידקים מצוינת על ידי מרת צבע מכחול לורוד.
   הערה: ניתוח כמותי יכול להתבצע גם על ידי מדידת גם את הקרינה בבית 590 ננומטר עם עירור ב 530 - 560ננומטר או את הספיגה ב 570 ננומטר ו 600 ¹⁵ ננומטר.

תוצאות

תפוקה גבוהה הקרנה תאית באמצעות שחפת לבטא את הגן בלוציפראז

איור 2A ולוח 1 מכילים את הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי luminometer, המבוטא ביחידות זורחות יחסית (RLU), מראים את ההשפעה של ריכוז גדל והולך של ריפמפיצין סמי TB על שחפת בתוך תאי THP-1. איור 2 א היא פיזור עלילה של הארת הגלם נמדדת...

דיון

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת HTS פשוטה וחסכונית באמצעות מודל זיהום תאיים אדם עבור שחפת. שחפת היא מחלה אנושית מתאפיינת הזיהום של מקרופאגים המכתשית ידי מ שחפת. בשל בעיות בטיחות ביולוגיות, המחקר מעורב מודלים ביולוגיים של שני החיידק ואת תאי המארח נעשה שימוש בעבר. עם זאת, הוכיח כי השימוש של חיידקים פונדקאיים ומודלים לא אנושיים הם מנבאים עניים של להיט-to-Lead הצלחה בפיתוח תרופה, המציין כי הקרנת תרופה נעשית בצורה טובה ביותר עם תאים אנושיים נגועים שבחפת מ ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'	G7513
סרום בקר עוברי (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, בקר pH7	Affymetrix	10857
דקסטרוז	פישר סיינטיפיק	BP350
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP358
קנמיצין סולפט	פישר סיינטיפיק	BP906
PMA	סיגמא-אולדריץ'	P8139
MTT	סיגמא-אולדריץ'	M2128
N,N- דימתילפורממיד (DMF)	פישר סיינטיפיק	D131
1 M חומצה הידרוקולורית (HCl)	פישר סיינטיפיק	351279212
חומצה אצטית	פישר סיינטיפיק	351269
SDS	פישר סיינטיפיק	BP166
רזזורין	אלפא אסאר	B21187
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D5879
גליצרול	פישר סיינטיפיק	BP229
THP-1	אוסף תרבות מסוג אמריקאי	TIB-202
M. שחפת H37Rv
96 בארות צלחת לבנה תחתונה שטוחה	קורנינג	3917
95 בארות צלחת שקופה תחתונה	קורנינג	3595
אוטם צלחת שקופה	תרמו פישר סיינטיפיק	AB-0580
ספקטרופוטומטר	תרמו פישר מדעי	ביומט 3
ספקטרופוטומטר מיקרופלייט	ביוטק	עידן
לומינומטר	יישומי ביוסיסטמס	Tropix TR717

שטוחה