מאמר שיטה

שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55274

⸱

7 באפריל 2017

 ,  ,  , 
1Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

במאמר זה

סיכום

שיטה לשילוב עצמי מושרה-הייבוש של biopolymers megamolecular על ממשק הגבישים-נוזלי אוויר מסופקת כאן. מתודולוגיה זו תהיה שימושית לא רק להבנת הפוטנציאלים מקרוסקופית של biopolymers, אלא גם כשיטת הערכה לחומרים רכים בתחומי ביו וסביבתיים.

תקציר

יצורי חיים העושים שימוש במים הם תמיד נוטים ייבוש בסביבה. פעילותם מונעים על ידי מיקרו-מבוסס biopolymer ו-מבנים מאקרו, כפי שניתן לראות במקרים של העברת מים בחבילות כלי הדם לחות מים בשכבות העור. במחקר זה, פיתחנו שיטה להערכת ההשפעה של תמיסות מימיות נוזל גבישי (LC) מורכב biopolymers על ייבוש. כפי biopolymers LC יש משקל megamolecular, בחרנו ללמוד סוכרים, חלבונים cytoskeletal, ו- DNA. תצפית של פתרונות biopolymer במהלך ייבוש תחת אור מקוטב חושף-אינטגרציה עצמית milliscale החל מממשק אוויר-LC יציב. הדינמיקה של פתרונות biopolymer LC המימיים ניתן לנטר באמצעות אידוי מים מתא אחד בצד-פתוח. באמצעות ניתוח התמונות שצולמו באמצעות אור המקוטב צולב, אפשר לזהות את השינויים במרחב ובזמן בפרמטר הסדר orientational. זֶההשיטה יכולה להיות שימושית עבור אפיון לא רק חומרים מלאכותיים בתחומים שונים, אלא גם ברקמות מחייתם הטבעית. אנו מאמינים כי זה ישמש אמצעי הערכה לחומרים רכים בתחומי ביו וסביבתיים.

מבוא

על ידי התמקדות במבנים קשיחים, בצורת מוט של biopolymers, חומרים רכים דינמי שימשו עבור יישומים שונים, כולל מטריצות ביופילם פוליסכריד 1, "ג'ל פעיל" מורכבת של חלבונים cytoskeletal 2, ו "אוריגמי DNA" של הצורות הרצויות 3. כדי להבהיר את תכונות מבניות, רבים אסטרטגיות נחקרו, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים חודרת, מיקרוסקופית אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי, מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. עם זאת, בגלל שיטות אלו נעשים בעיקר במצב מיובש או סטטי, קשה להסביר את ההתנהגויות דינמיות קשקשים מקרוסקופית, כפי שניתן לראות במערכות חיים בפועל. לאחרונה, הבחנו בהצלחה את ההתנהגות הדינמית של biopolymers על ממשק האוויר-LC המימי באמצעות אור מקוטב 4. במהלך להדמיה של מבנה אוריינטציה תוך ייבוש biopolymerפתרון, השינויים הזמניים הצביעו עצמית אינטגרציה של biopolymers על ממשק האוויר-LC היציב.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור הייבוש של פתרונות biopolymer LC בממשק האוויר-LC באמצעות מכשירים מקוטבים. בניגוד ניתוחים אחרים של שלב LC כי לא מחשיבים ייבוש 5, 6, דינמיקת LC במהלך תהליך הייבוש נחקרה כאן על ידי הערכת פרמטר הסדר orientational בתצוגה לרוחב של השלב הנוזל בתא אחד בצד-פתוח . השילוב של אידוי התא והשימוש במכשירים מקוטבים המותרים לניטור מקרוסקופית עם כיוון אידוי מבוקר. בנוסף, ניתן היה לאמת את הרשומות ייבוש על ידי התמקדות במבנים גבישיים של microdomains הספוחה, אשר הושפעו משקל מולקולרי, ריכוז, וכו 'כדי להדגים את היעילות של השיטה, הפרו ייבושוהיטלים של biopolymers הבסיסית עם צורות מוט קשיחות, כגון סוכרים, microtubules (MTS), ו- DNA, נחקרו. בחרנו biopolymers אלה כי הם דוגמאות אופייניות של מקרומולקולות היררכית עם משקולות megamolecular, וכן אינטראקציות מולקולאריים שלהם ולאפשר להם להקים מדינות LC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מכשירים

  1. מכשיר קיטוב
    1. כדי לבנות התקן קיטוב, מספק מקור אור עם מנורת הלוגן, מדריך אור, מקטבים, במה מדגם, מסילה אופטית, מוט עומד, ואת מצלמת רפלקס דיגיטלית עדשה אחת (ראה האיור 1C וחומרי רשימה עבור הקיטוב חלקי התקן).

2. הכנת פתרון biopolymer

  1. פתרונות פוליסכריד
    1. ממיסים sacran 7 (ז 0.5) במים טהורים (100 מ"ל) על ידי ערבוב ב ~ 80 מעלות צלזיוס למשך יותר מ 12 שעות. במהלך הפירוק, לכסות את המכל בניילון נצמד כדי למנוע אידוי. הכן תמיסה מימית של קסנטן באותו אופן.
    2. מצננים את הפתרונות ב ~ 25 ° C כדי להשיג 0.5 בתמיסות מימיות% WT.
    3. צנטריפוגה הפתרון sacran כדי להסיר זיהומים (48,400 XG, 4 ° C, 1 h, 3 טיםes).
  2. פתרון MT
    1. הכן פתרון טובולין 0.5% WT (1 מ"ל) ב חיץ בריטון-רובינסון (80 מ"מ piperazine- N, N '-bis (2-ethanesulfonic חומצה) (צינורות); 1 MM-bis אתילן גליקול (אתר β-aminoethyl) - N, N, N 'N' חומצה -tetraacetic (EGTA); ו 5 מ"מ MgCl 2, pH 6.8) על הקרח 8.
    2. השתמשו 0.5% WT פתרון טובולין (50 μL) ו guanosine-5' - [(α, β) -methyleno] אדנוזין (GpCpp) (5 μL) להכין פתרון טובולין GpCpp המכילים (50 μL). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות כדי להשיג גרעין MT יציב.
      הערה: תפקידה של GpCpp היא לתמוך היווצרות MT וכדי לחלוטין לדכא את depolymerization של MT כדי טובולין.
    3. מערבב את פתרון טובולין 0.5% WT (950 μL) ופתרון טובולין GpCpp המכיל (50 μL) ב ~ 25 מעלות צלזיוס למשך 1 יום כדי להשיג פתרון MT 0.5% WT יציב.
  3. פתרון ה- DNA
    1. הכן פתרון ה- DNA 0.5% WT (1 מ"ל) בתמיסה טריס חיץ-EDTA (10 מ"מ טריס, pH 8.0, עם 1 EDTA מ"מ).
  4. שמור הפתרונים המדגמים biopolymer 0.5% WT ב 25 מעלות צלזיוס למשך ניסוי הייבוש.

3. ניסויי ייבוש תצפית תחת אור מקוטב חוצה

  1. פתרונות בתא אחד בצד-פתוח (איור 1A)
    1. חותכים גיליון סיליקון (ראה רשימת חומרים) לתוך צורה מתאימה עם עובי של 1 מ"מ (המימד הפנימי של 5-15 מ"מ, 1 מ"מ, ו ~ 20 מ"מ; איור 1 א).
      1. הרכב תא אחד בצד-פתוח מורכב spacer סיליקון עם ממד פנימי של 5-15 מ"מ, 1 מ"מ, ו ~ 20 מ"מ ושתי שקופיות זכוכית שאינן שונה (76 מ"מ × 1 מ"מ × 26 מ"מ). תקן משני צידי התא עם קליפים כפולים מראש כדי לשמור הפתרון המדגם מ דולף החוצה.
    2. לאט לאט מוסיף כל אחד פתרון biopolymer 0.5% WT (100-300 μL) באמצעות ~ 1 מ"מ נקבובי בגודל pipette טיפ לכל תא ב ~ 25 ° C. הסר בועות אוויר מהתאים באמצעות מחט מזרק.
    3. מניחים את התאים בתנור עם סירקולטור האוויר 60 מעלות צלזיוס בלחץ אטמוספרי עבור אידוי; בכיוון האידוי הוא הפוך מזה של הכבידה.
  2. תצפיות תחת אור מקוטב צולבות (איור 1B-1C)
    1. ספק אור ישר לעין באמצעות מנורת הלוגן 100 ואט עם מקור אור שטוח משטח פני שטח נרחב (80 מ"מ x 80 מ"מ). התאם את המקטבים כדי 45 מעלות ו 135 מעלות באמצעות למחזיקים (איור 1C).
    2. תקן את העמדות של מקור האור, מקטבים, במה מדגמת, ואת המצלמה באמצעות רכבת אופטית ודוכני מוט (איור 1C). מניחים את הבמה מדגם בין שני מקטבים (המרחק בין מקטבים צריך להיות ~ 5 ס"מ). מניחים את המצלמה ~ 20 ס"מ מן הבמה מדגם לאפשר התמקדות.
    3. לפעמים נתון, למקם את דגימות משלב 3.1.3 בין פולהrizers על מקבילי הבמה אל-מטוס XZ ולכסות את המכשיר עם וילון שחור; המכשיר בפועל מוצג באיור 1C.
    4. צלם את דגימות דרך מקטבים ליניארי חצה באמצעות מצלמת רפלקס דיגיטלית עדשה אחת עם עדשת זום סטנדרטית (ראה רשימת חומרים). שליטת גדרות המצלמה, כגון אורך מוקד, באמצעות תוכנת מחשב (ראה רשימת חומרים).
  3. ניתוח במרחב ובזמן של עוצמת האור המועבר (איור 1C)
    1. כדי להעריך את השינוי של פרמטר הסדר orientational בתהליך הייבוש, לאסוף תמונות לשעה עבור 24 שעות.
    2. מדדו את עוצמת האור המועבר לאורך האמצע לכיוון-Z כערך אפור באמצעות תוכנית לעיבוד תמונה (למשל, ImageJ).
    3. לשרטט גרף של הערך האפור כפונקציה של המרחק מן הצד הפתוח העליון.
  4. תצפיות מיקרוסקופיות תחת תאורת צולבות מקוטבותt (איור 1D)
    1. כדי לבדוק את השיטות, לבצע תצפיות מיקרוסקופיות עם מיקרוסקופ קיטוב מצויד במצלמת CCD 9. שמור צלחת פיגור מסדר ראשון בנתיב האור. לשלוט על תנאי על התמונות באמצעות תוכנת PC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות המכשיר כפי שמוצג באיור 1, את השילוב בין העצמי microdomain כדי macrodomain על ייבוש האוויר-LC ממשק הוערך (איור 2 א). כפי ההפגנה הראשונה של הניסוי ייבוש, שני סוגים של סוכרים megamolecular, sacran (M w = 1.9 x 10 7 גרם mol -1) ו קסנטן (4.7 x 10 6 גרם mol -1), הושוו. איור 2B מראה תמונות של פתרונות בתא תחת אור מקוטב צולבות. לפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זה היה לפעמים קשה למצלמה להתמקד המדגם בשל עוצמת האור המועבר להיות נמוכה מדי. במקרים כאלה, הצבת סרט פלסטיק שקוף המורחבת על הבמה עזרה לסדר את הפוקוס. המגבלה של הרזולוציה הנצפית הייתה תלויה עדשת המצלמה, ~ 10 מיקרומטר במקרה הזה. המגבלה הנצפית של עובי המדגם, Δy, הייתה תלויה בעוצמת האור המרבית של המנורה, ~ 10 מ"מימ במקרה זה.

היתרון של המכשיר שמוצג באיור 1B הוא שהיא מאפשרת צילומים-נוף צדדי של מדגם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט ב- סיוע עבור מדענים צעירים (16K17956) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, מרכז קיוטו Technoscience, וקרן Mitani למחקר ופיתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
sacranGreen Science Materials Inc., יפןמ-Aphanothece sacrum.
Mw = 1.9 & times; 107 g mol-1
xantthan gumTaiyo Kagaku Co., יפןNeosoft XCמ-Xanthomonas campestris.
Mw = 4.7 & times; 106 g mol-1
tubulinCytoskeleton, Inc., ארה"בT240ממוח חזירי.
GpCppJena Bioscience, גרמניהNU405L
piperazine-N,N′ < / em>-bis (2-חומצה אתנסולפונית)סיגמא-אלדריכי, ושות' LLC.P6757-500Gצינורות
אתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטיתDojindo Molecular Technologies, Inc.342-01314EGTA
MgCl2-6H2OWako Pure Chemical Industries, Ltd.135-15055
KOHWako תעשיות כימיות טהורות בע"מ162-21813גלולה
DNAסיגמא-אולדריץ', ושות' LLC.D1626מאשכי סלמון.
Mw = 1.3 & פעמים; 106 Da (~2,000 bp)
תמיסת חיץ Tris-EDTASigma-Aldrich, Co. LLC.T9285-100ML10 מ"מ Tris, pH 8.0, עם 1 מ"מ
זכוכית שקופיותMatsunami Glass Ind., Ltd., יפןS1111
גיליון גומי סיליקוןAsone Co.6-611-32עובי:
צנטריפוגהבקמן-קולטר, בע"מ, ארה"Avanti J-25מצויד במקור אור רוטור JA-20
Sumita Optical Glass, Inc., יפןLS-LHA
Sumita Optical Glass, Inc., יפןGF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)80 מ"מ ופעמים;
מנורת הלוגןUshio Inc., יפןJCR 15V150WBN
מחזיקSigmakoki, Co., Ltd.KMH-80
שלב מדגםSigmakoki, Co., Ltd.TARW-25503L
Sigmakoki, Co., Ltd.SHA-25RO
מוטסיגמקוקי, ושות', בע"מROU-12-40
מחזיק פוסטיםSigmakoki, Co., Ltd.RS-6-40
בעל הפוסטיםSigmakoki, Co., Ltd.RS-12-60
מחזיק פוסטיםSigmakoki, Co., Ltd.RS-12-80
מחזיק פוסטיםSigmakoki, Co., Ltd.RS-12-130
מובילSigmakoki, Co., Ltd.CAA-25LS
Sigmakoki, Co., Ltd.CMH-2
מסילה אופטית בינוניתSigmakoki, Co., Ltd.OBA-500SH
Tomytech, עדשת BORGBK80φ, L25 מ"מ 
עדשהטומיטק, עדשת בורגBK80φ, L50 מ"מ 
Tomytech רב-פס, BORG80φ  
צלחתV Tomytech, BORGV צלחת 60S
מחזיק צלחתViexen, Co., Ltd.מחזיק צלחת SX
EOS Kiss X7i Canon Inc., יפן8594B001עם עדשת זום סטנדרטית,  EFP 18-55 מ"מ
תוכנת צילוםCanon Inc., יפןEOS Utility
PCמיקרוסופטפני השטח
OlympusBX51
לוחית פיגור מסדר ראשוןOlympusU-TP530λ = 530 ננומטר
מצלמת CCDאולימפוסDP80
OlympuscellSens Standard
עיבוד תמונה מבוססת Javaהמכונים הלאומיים לבריאותImageJ
EDTA 1 מ"מ ב מדריך אור 80 מ"מ מחזיק מדגם מחזיק מצלמה עדשת מיקרוסקופ קיטוב תוכנת צילום תוכנית

מקורות

  1. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  2. Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  4. Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
  5. De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
  6. De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
  7. Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
  8. Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
  9. Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
  10. Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
  11. Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
  12. Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים