ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים.

תקציר

M osaic nalysis עם arker ג r epressible ell מ (MARCM) היא מערכת תיוג פסיפס חיובית כי כבר מיושמת באופן נרחב במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית לתאר מורפולוגיות מסובכות כדי לתפעל את הפונקציה של גנים תת קבוצות של נוירונים בתוך אחר לא מסומן ו שאנן אורגניזמים. פסיפסים גנטיים שנוצרו במערכת MARCM באים לידי ביטוי בתיווכם רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים ההומולוגיים בתוך חלוקת תאים מבשרים לייצור הן (שיבוטי MARCM) מסומן לתאים בת לא מסומנים במהלך מיטוזה. הארכת תוקפה של שיטת MARCM, MARCM תאום המקום שנקרא (tsMARCM), תוויות הן של תאי התאום נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים. טכניקה זו פותחה כדי לאפשר שהליפה של מידע שימושי משני-השושלות החמות. על ידי מקיף וניתוח זוגות שונים של שיבוטי tsMARCM, מערכת tsMARCM מתירה mappin שושלת עצבית ברזולוציה גבוההז כדי לחשוף את הלידה-הסדר המדויק של נוירונים שכותרתו מופק ובתאים משותפים. כמו כן, מערכת tsMARCM גם מרחיבה מחקרים לתפקד גנים על ידי מתיר הניתוח פנוטיפי של נוירונים זהים של בעלי חיים שונים. כאן אנו מתארים כיצד ליישם את מערכת tsMARCM כדי להקל על מחקרים של ההתפתחות העצבית תסיסנית.

מבוא

המוח, מורכב ממספר עצום וסוגים מגוונים של נוירונים, מעניק חיות עם היכולת לתפוש, תהליך, ולהגיב לאתגרים מהעולם החיצוני. נוירונים של המוח המרכזי תסיסנית המבוגר נגזרים ממספר מצומצם של תאי גזע עצביים, neuroblasts שנקרא (NBS), במהלך התפתחות ^{1, 2.} רוב NBS המשתתפים neurogenesis המוח תסיסנית עוברים חלוקה סימטרית לייצר NBS עצמית חידוש תאים אמא גנגליון (GMCs), ואת GMCs ואז לעבור לעוד סיבוב של חלוקת לייצר שני לתאי הבת כי להתמיין נוירונים ³ (איור 1 א ). בגלל המורכבות של מורפולוגיה עצבית ואת האתגרים הקשורים בזיהוי נוירונים ספציפיים, טכנולוגית תיוג פסיפס חיובית, ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM), הומצא כדי לאפשר visualizatיון של נוירון בודד או קבוצה קטנה של נוירונים מתוך אוכלוסיית נוירונים שמסביב, ללא תווית ^4.

MARCM מנצל את flippase (FLP) / היעד הכרה FLP (FRT) מערכת לתווך רקומבינציה אתר ספציפי בין כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא המפריד מבשר נושאת אלל הטרוזיגוטיים של גן מדכא, שביטויים בדרך כלל מעכב את הביטוי של הגן הכתב ^4. לאחר חלוקת mitotic, הכרומוזומים רקומביננטי מופרדים לתאים התאום, כך תא אחד מכיל אללים הומוזיגוטים של הגן מדכא והתא השני אין גן-the מדכא ביטוי של הכתב בתא כי (וצאצאיו) הוא כבר לא חסם ^4. שלושה דפוסי המשובטים נמצאים בדרך כלל ניסוי MARCM כאשר FLP מושרה stochastically ב- NBS או GMCs: תא בודד ושני תאים-GMC שיבוטים, המתארים מורפולוגיה העצבית ב resolutio תא בודדn, ומשכפל רב התאי-NB, המגלה דפוסי מורפולוגיים כולו של נוירונים נגזרו NB משותף (איור 1 ב). טכניקת MARCM הוחלה נרחבת במחקרים הנוירוביולוגי תסיסנית, לרבות זיהוי סוג עצבי לשחזור רשתות חיווט-רחב מוח, שושלת עצבית ניתוחית לחשוף את ההיסטוריה ההתפתחותית של נוירונים, אפיון פנוטיפי של פונקציות גן מעורבות מפרט גורל תא, ומורפוגנזה עצבית והבחנה לומדת ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} בגלל MARCM הקונבנציונלי רק תוויות אחד משני התאים הבת (שושלות) לאחר אירוע רקומבינציה mitotic המושרה, מידע שימושי פוטנציאלי מהצד המסומן הולך לאיבוד. מגבלה זו מונעת את היישום של M הבסיסימערכת ARCM כדי ברזולוציה גבוהה מנתח של שושלות עצביות רבות לעבור גורלות תא קצב מהיר או דיוק מנתח של פונקציות גן בנוירונים זהה של בעלי חיים שונים ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) הנו מערכת מתקדמת המאפשרים תוויות נוירונים נגזרו אב משותף עם שני צבעים שונים, אשר מאפשרת שחזור של מידע שימושי משני צידי תאי התאומים, ובכך להתגבר על המגבלה של מערכת MARCM המקורית ¹¹ ( איור 2 א - 2C). במערכת tsMARCM, שתי התערבות RNA (RNAi) מבוססת מדכאי ממוקמים ב-אתרי טרנס של כרומוזומים הומולוגיים בתוך תא מבשר, והביטוי של מדכאים אלה באופן עצמאי לעכב את הביטוי של העיתונאים שלהם (איור 2 ב). בעקבות רקומבינציה mitotic באתר ספציפי בתיווכם של מערכת FLP / FRT, את two מדכאים מבוססים RNAi להיות הפרדה לתאים התאום להתיר את הביטוי של עיתונאים נפרדים (איור 2 ב). שני דפוסים משובטים, תא בודד הקשורים שיבוטי תא בודד ושני תאים-GMC הקשורים שיבוטים רבים תאי-NB, נתפסים בדרך כלל בניסוי tsMARCM (איור 2 ג). מידע נגזר צד אחד של תאי התאומים יכול להיות מנוצל כהפניה עבור הצד השני, מה שמאפשר שושלת עצבית ברזולוציה גבוהה מנתח, כגון לידת היכרויות הנוירונים שכותרתו, פנוטיפי מנתח של נוירונים זהים בחיות שונות לחקירה המדויקת של תפקוד גן עצבי ^{11, 12.} כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול המתאר כיצד לערוך ניסוי tsMARCM, אשר ניתן להשתמש בהם על ידי מעבדות אחרות כדי להרחיב את לימודיהם של ההתפתחות העצבית (כמו גם התפתחות של רקמות אחרות, אם זה אפשרי) תסיסנית.

פרוטוקול

1. בניית tsMARCM המוכן זבובי שימוש החובה Transgenes ^{11, 13}

1. צור את הגרסה המקורית של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט ¹¹ (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטיים רגילות זבוב, אשר תוארו בעבר, על ידי צבת transgenes המרובה באותו המניות לטוס ^13.
   1. באחד קו הורי, להרכיב את transgenes של FRT ^40A, כטב"מ- mCD8 :: GFP (הכתב הראשון, mCD8 :: GFP; ביטוי של transgene הוא תחת השליטה של אמרגן רצף הפעלה במעלה הזרם, אשר מייצרת עיתונאי קשור-קרום של העכבר מקבץ של חלבון בידול 8 התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק), ו כטב"מ-rCD2RNAi (להלן מדכא כי מעכב התבטאות הכתב השני, את RNAi נגד ביטוי o אשכול עכברושf בידול 2, rcd2) על יד שמאל של כרומוזום 2 ^nd. מקום רקמות ספציפיות הנהג -GAL4 על X או 3 ^rd כרומוזום, במידת האפשר.
   2. בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של ^40A FRT, כטב"מ-rCD2 :: RFP (הכתב השני, rCD2 :: RFP; כתב הקרום קשור אחרים מורכבים של חלבון rCD2 התמזג עם חלבון פלואורסצנטי אדום), ו כטב"מ-GFPRNAi (את מדכא זה מעכב את הביטוי של ה- GFP :: mCD8, את RNAi נגד הביטוי של ה- GFP) על יד שמאל של כרומוזום 2 ^nd. מניחים-הלם חום (hs) -FLP או FLP specific--רקמה על X או 3 ^rd כרומוזום, במידת האפשר.
2. צור את הגרסה החדשה של זבובי tsMARCM מוכנים מן transgenes הנזקפים על ידי זבובי פרט ¹⁴ (ראה טבלה 1). לביצוע מזימות מעבר גנטי רגילות זבוב, אשר תוארו previously, על ידי הצבת transgenes מרובים באותו מניות לטוס ^13.
   1. באחד קו הורית, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב"מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (א transgene בשילוב של mCD8 :: GFP ואת מדכא כי מעכב התבטאות rCD2 :: RFP) ביחד באותו זרוע 2 ^nd או 3 ^rd כרומוזום (זוגות מתאימים של transgenes של FRT ו כטב"מ-mCD8.GFP.UAS-rCD2i מסומנים בטבלה 1). מניח נהג הרקמות הספציפי-GAL4 בכרומוזומים מלבד כרומוזום של אתר FRT הנבחר, אם אפשר.
   2. בשורת ההורים אחרת, להרכיב את transgenes של אתר FRT ו כטב"מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi (את הגן המשולב אחרים של rCD2 :: RFP ואת המדכא כי מעכב התבטאות mCD8 :: GFP) באותה הזרוע של כרומוזום 2 ^nd או 3 ^rd (זוגות מתאימים של transgenes של FRT ו כטב"מ-rCD2.RFP.UAS-GFPi מסומנים בטבלה 1). מקום hs-FLP או רקמות ספציפיות-FLP על הכרומוזומים למעט כרומוזום של האתר FRT הנבחר, אם אפשר.

2. הצלב tsMARCM מוכן מתקיף צור tsMARCM המשובטים בקרב צאצאיהם"

1. הצלב tsMARCM מוכן זבובים יחד (למשל, לשים 10-15 זבובים זכרים משלב 1.1.1 או 1.2.1 ו- 20-30 הנשי בתולה זבובים משלב 1.1.2 או 1.2.2 יחד) בבקבוקון מזון-fly עם טרי להדביק שמרים -made על הקיר של הבקבוקון.
2. לשמור על זבובי tsMARCM המוכנים חצו במהירות של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי לשפר את הסיכוי של הזדווגות לפני איסוף ביצים מופרות.
3. לעתים קרובות להעביר את הזבובים tsMARCM המוכנים חצו לתוך צלוחיות yeasted הטרי כדי למנוע צפיפות (להקיש את הזבובים או להשתמש פחמן דו חמצני כדי להרדים את הזבובים כדי להקל על ההעברה; לשמור על לא יותר מ 80-100 ביצים מופרות בתוך מזון לטוס 10 מיליליטר דרךl להימנע מדי הזחלים בקעו).
4. תרבות החיות tsMARCM (כלומר, ביצים מופרות; דוגמה של הגנוטיפ של חיות tsMARCM, כפי שמוצג באיור 3, הוא hs-FLP ^[22], w / w; כטב"מ- mCD8 :: GFP, כטב"מ-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / כטב"מ-rCD2 :: RFP, כטב"מ-GFPRNAi, ^40A FRT; +; +) אשר נקבע ב הצלוחיות הועברו הסדרה של 25 מעלות צלזיוס עד שהם מפתחים לשלבים הרצויים (למשל, עובר, הזחלים, או גלמים).
5. מניח את הבקבוקונים הועברו המכילים חיות tsMARCM באותו שלב התפתחותי כדי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10, 20, 30, 40, ו -50 דקות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי של הלם חום שגורם ביטוי של FLP על מנת ליצור את שיבוטים של עניין tsMARCM. דלג על שלב זה אם FLP רקמות specific- נמצא בשימוש בניסוי tsMARCM (hs-FLP היא מועדפת עבור שושלת עצבית מנתח; הסיבות להעדפה זו תוארו בעבר ¹⁵).
   הערה: חזור על שלב 2.5 באמצעות הזמן האופטימלי של הלם חום בניסויים tsMARCM בעתיד אם יותר שיבוטים tsMARCM עניין מבוקשים; בדרך כלל, ביטוי FLP יותר מושרה hs-FLP ^[22] לעומת hs-FLP ^[1] עם הזמן חום הלם אותו.
6. תרבות החיות tsMARCM-בהלם חום של 25 מעלות צלזיוס עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחותי המתאים, ולאחר מכן המשך לשלב 3.

3. כן, כתם, מוח טס הר המכיל tsMARCM המשובטים

1. הכינו מאכלים מלקחיים-הגנה. מערבבים חלק (30 גרם) וחלק ב '(3 גרם) של ערכת אלסטומר סיליקון עם פחם פעיל (0.25 גרם). יוצקים את התערובת לתוך מנות המתאימות.
2. לנתח זחל, גלמים או מוחות בוגרים מתוך חי tsMARCM המלוחים פוספט שנאגר 1x (PBS) באמצעות מלקחיים על צלחת מלקחיים-הגנה מוצגת באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. הערה: פרוטוקול לנתיחת מוח לטוס כבר יורדתribed בעבר ^16.
3. תקן את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית עם PBS 1x המכיל פורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לעבד את המוח זבוב בצלחת במקום זכוכית זה לשארית המדרגות.
4. שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT (PBS 1x המכיל 1% Triton X-100) ולשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד PBT 1% (לשטוף: להסיר PBT ולהוסיף PBT חדשים במהירות; לשטוף: להסיר PBT, להוסיף חדשים PBT, דגירת מוח הזבוב בתוך PBT החדש באמצעות שייקר מסלולית).
5. דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים ראשוניים הוא עכברוש נוגדן אנטי CD8 (1: 100), נוגדן אנטי DsRed ארנב (1: 800), ועכבר אנטי Bruchpilot (BRP) נוגדנים (1:50) ב 1% PBT המכיל 5% נסיוב עז נורמלי (NGS).
6. שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT.
7. דגירה המוח לטוס עם תערובת של נוגדנים משני לילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמה של תערובת של נוגדנים משני הוא נוגדן IgG אנטי עכברוש עיזים מצומדות עם צבע ירוק ניאון (1: 800), נוגדן IgG נגד ארנב עז מצומדות עם צבע צהוב-ניאון (1: 800), ו עז נגד העכבר נוגדן IgG מצומדות עם צבע מרחיקות אדום-ניאון (1: 800) ב PBT 1% המכיל 5% NGS.
8. שוטפים את המוח לטוס שלוש פעמים עם 1% PBT, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד עם 1% PBT. הר אותם בשקופית מיקרו עם מגיב אנטי מרווה. שים כוס כיסוי מיקרו בשקופית מיקרו לכסות ולהגן על המוח זבוב. חותם את הקצוות של השקופית זכוכית מיקרו כיסוי מיקרו באמצעות לק ברור. אחסן רכוב אלה וחתומים לטוס דגימות מוח על 4 מעלות צלזיוס.

4. קחו, תהליך, ולנתח תמונות פלורסנט משובטים tsMARCM

1. צלמו תמונות הניאון של fr שיבוטים tsMARCMאום הדגימות שנוצרו בשלב 3.8 באמצעות מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה.
2. ערימות הפרויקט של תמונות ניאון confocal tsMARCM לתוך דו מימדי, שטוח התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מסופק עם מערכת מיקרוסקופיה confocal של בחירה (ראה איור 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, ו 3Q - 3T לדוגמאות של בברוטליות תמונות ניאון confocal).
3. לספור את מספר הסלולרי של הצדדים רב תאיים-NB של שיבוטים tsMARCM באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה (למשל, הפונקציה "מונה תא" ב ImageJ ^17; ראה 3E איור, 3J, 3O, ו 3T לדוגמאות של התא גופות נוירונים).

תוצאות

מערכת tsMARCM נעשה שימוש כדי להקל על שושלת עצבית מנתח ומחקרי תפקוד הגן באמצעות אחזור מידע חשוב על נוירונים נגזרו NBS המשותף. המערכת נעשתה שימוש כדי לזהות את רוב (אם לא כל) סוגי נוירונים, לקבוע את המספר הסלולרי של כל סוג עצבי, ותוודא הלידה מהסדר של נוירונים אלה ^{11, 12, 18} (ראה פרטים בפרק הדיון לקבלת פרטים אודות שימוש tsMARCM כדי לנהל שושלת ...

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

צעדים 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, ו -3.2 הם קריטיים להשגת תוצאות tsMARCM טובות. רקמות ספציפיות נהגי -GAL4 כי אינו מבטא GAL4 ב אבות עצביים הם העדיפו צעדים 1.1.1 1.2.1. הימנע צפיפות גדולה החיות גדלו צלוחיות-אוכל לטוס בשלב 2.3. מכיוון חביון האינדוקציה, את רמת הביטוי של FLP אפון-הלם חום, ובפעם המפריד הממוצעת של אבות עצביים (כלומר, NBS ו GMCs) אינם ידועים, עדיף לגוון את הזמן החו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פחמן דו חמצני (CO2)	ספק מקומי	n.a.Anesthetize	זבובי הרדמה
CO2 pad	ספק מקומי	n.a.מיון	, הצלבה והעברה של זבובי
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (או ספקים אחרים)	PBS001	ניתוח, שטיפה, שטיפה וחיסון מוחות זבובים
פורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	252549	תיקון מוחות זבוב
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	לשטוף, לשטוף ולחסום מוחות זבובים
רגילה	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	מוחות זבוב אימונוסטיין
סרום
נוגדן עכברוש נגד עכבר CD8 נוגדן	Invitrogen	MCD0800	מוחות זבוב אימונוסטיין
ארנב נוגדן נגד DsRed	Clonetech	632496	מוחות זבוב אימונוסטיין
עכבר נוגדן נגד BRP	מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה	nc82	מוחות זבוב אימונוסטיין
נוגדן IgG נגד חולדות עיזים מצומד עם Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	מוחות זבוב אימונוסטיין
נוגדן IgG נגד ארנב עיזים מצומד עם Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	מוחות זבוב חיסון עיזים
נגד עכבר נוגדן IgG מצומד עם Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	מוחות זבוב אימונוסטיין
SlowFade מגיב זהב אנטי-דהייה	בדיקות מולקולריות	S36936	הר מוחות זבובים והגן על כיבוי הקרינה
PYREX 9 דיכאון זכוכית	ספוט צלחת קורנינג	7220-85	ניתוח, שטיפה, שטיפה ואימונוסטייל מוח זבוב
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון	Precision Instruments	SYLG184	הכינו צלחות סילגארד שחורות להגנה על מלקחיים במהלך דיסקציה מוחית
פחם פעיל	סיגמא-אולדריץ'	242276-250 גרם	הכינו כלי סילגארד שחורים
Dumont #5 מלקחיים	משובח כלים	11252-30	לנתח ולהרכיב מוחות זבוב
מיקרו שקופיות	קורנינג	2948-75x25	הר מוחות זבוב
כיסוי זכוכית מס' 1.5	VWR בינלאומי	48366-205	הר מוחות זבוב
לק	ספק מקומי	לא זמין	חותם זכוכית כיסוי מיקרו על מיקרו שקופיות
אינקובטור	Kansin Instruments	LTI603	עפה ב-25 מעלות; C
(או ספקים אחרים)
אמבט מים	Kansin Instruments	WB212-B2	לגרום להלם חום בזבובים ב-37 מעלות; C
(או ספקים אחרים)
שייקר אורביטלי	Kansin Instruments	OS701	שטיפה ואימונוסטיין מוחות זבובים
(או ספקים אחרים)
מיקרוסקופ דיסקציה	Leica	EZ4	מיון, הצלבה והעברה של זבובים; לנתח, לשטוף, לשטוף וליצור מוחות זבובים חיסונים
מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss (או ספקים אחרים)	LSM 700 (או דגמים אחרים)	תמונהMARCM משכפלים
תוכנת עיבוד תמונה 1 (למשל , דפדפן תמונה Zeiss LSM)	Zeiss	לא זמין	ערימות פרויקט של תוכנות עיבוד תמונה של תמונות קונפוקליות
2 (למשל , ImageJ)	לא זמין	לא זמין	ספירת מספר תאים של שיבוטי tsMARCM