הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו לאפשר לחוקרים לחקור את התקשורת התאית מבלי לשנות את שלמות הסביבה שבה נמצאים התאים. באופן ספציפי, הם פותחו כדי לנתח את הפעילות החשמלית של תאים מעוררים, כמו נוירונים בעמוד השדרה. בתרחיש כזה, חיוני לשמור על שלמות תא עמוד השדרה, אך חשוב גם לשמר את האנטומיה והצורה הפיזיולוגית של המערכות המעורבות. אכן, הבנת האופן שבו פועלת מערכת העצבים - ומערכות מורכבות אחרות - חייבת להתבסס על גישה מערכתית. מסיבה זו, עובר דג הזברה החי נבחר כמערכת מודל, ושינויי מתח קרום הנוירונים בעמוד השדרה הוערכו מבלי להפריע לתנאים הפיזיולוגיים של העוברים.
כאן מתוארת גישה המשלבת העסקה של עוברי דג זברה עם חיישן ביולוגי מבוסס FRET. עוברי דג הזברה מאופיינים במערכת עצבים פשוטה מאוד ומתאימים במיוחד ליישומי הדמיה הודות לשקיפותם, המאפשרת שימוש במחווני מתח מבוססי פלואורסצנטיות בקרום הפלזמה במהלך התפתחות דג הזברה. הסינרגיה בין שני המרכיבים הללו מאפשרת לנתח את הפעילות החשמלית של התאים ביצורים חיים שלמים, מבלי להפריע למצב הפיזיולוגי. לבסוף, גישה לא פולשנית זו יכולה להתקיים יחד עם ניתוחים אחרים (למשל, הקלטות תנועה ספונטניות, כפי שמוצג כאן).
מבוא
ב vivo ניתוח מרכיב מערכתית מאפשרת למדענים לחקור התנהגות הסלולר בצורה האמינה ביותר. הדבר נכון במיוחד כאשר הפעילות הנבדקת מושפעת במידה רבה מהאינטראקציות של תאי-התא (הן מגע והן ללא קשר), כמו במערכת העצבים, שבה שינויים בממברנה יוצרים את התקשורת בין תאים נרגשים. הבנת המידע המקודד על ידי אותות חשמליים אלה היא המפתח להבנת האופן שבו פועלת מערכת העצבים במצבים פיזיולוגיים ומחלות כאחד.
על מנת ללמוד תכונות חשמליות התא בתנאים פיזיולוגיים לא פולשנית ביותר, כמה אינדיקטורים מתח מקודד גנטית פותחו לאחרונה 1 . בניגוד לדורות הקודמים של חיישני מתח אופטי (בעיקר צבעים רגישים למתח) 2 , GEVIs מאפשרים ניתוחי vivo של מערכת העצבים השלמה,הביטוי שלהם יכול להיות מוגבל סוגי תאים ספציפיים או אוכלוסיות.
העובר דג הזברה הוא ב "המצע" vivo של בחירה כדי לנצל את הפוטנציאל הגדול המיוחס GEVIs. למעשה, הודות לבהירותה האופטית ולמערכת העצבים הפשוטה אך המשופעת שלה, מודל דג הזברה מאפשר זיהוי ומניפולציה פשוטים של כל רכיב סלולרי ברשת. ואכן, התעסוקה של FRET מבוססי בתולת הים GEVI 3 הובילה לזיהוי שינויים טרום סימפטומטיים בהתנהגות נוירון מוטורי עמוד השדרה במודל דג הזברה של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 4 .
להלן בפרוטוקול vivo מתאר כיצד לפקח על המאפיינים החשמליים של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של עוברי דג הזברה שלם להביע בתולת ים בצורה ספציפית נוירונים. יתר על כן, הוא מדגים כיצד chan המושרה pharmacologicallyגזים אלה תכונות חשמליות יכול להיות קשור שינויים בתדר של עובריים ספונטנית עובריים, פעילות מוטורית סטריאוטיפית המאפיינת את התנהגות התנועה של דג הזברה בשלבים מוקדמים מאוד של פיתוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. pHuC_Mermaid דור פלסמיד
הערה: בת הים היא biosensor שפותחה על ידי זיווג מתח חישה מתח (VSD) של Ciona intestinalis (עכשיו Ciona rubusta ) 5 חיישן מתח המכיל phosphatase (Ci-VSP) עם השותף FRET fluorophores Umi-Kinoko גרין (mUKG: התורם) ואת גרסה מונומריים של חלבון פלואורסצנטי פולטת כתום Kusabira Orange (mKOk: acceptor). עבור biosensor זה, שינויים קונפורמטיביים של תחום VSD, המושרה על ידי depolarization ממברנה, להגדיל את הקרבה של התורם ו acceptor פלואורסצנטי חלבונים, ובכך להגדיל את העברת האנרגיה ביניהם (הגדלת יחס FRET) 3 . ה- VSD מבטיח את לוקליזציה יעילה של biosensor על קרום הפלזמה. הביטוי העצבני של biosensor (בעמוד השדרה, האות הוא לזיהוי הן interneurons ו נוירונים המנוע) מושגת על ידי שיבוט האופרה בת היםEn מסגרת הקריאה (ORF) תחת מקדם דג הזברה פאן עצבית HuC 6 .
- להגביר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ORF בתולת הים מ pCS4 + בת הים פלסמיד 3 עם PFU (הגהה) פולימראז דנ"א באמצעות פריימר יוניברסל T3 ואת בת הים Sma אני פריימר (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) על מנת להכניס סמה אני הגבלה האתר במעלה הזרם של ORF בת הים.
- השתמש בתערובת ה- PCR הבאה: 0.5 μL של פולימרז DNA PFu, 7.5 μL של חיץ 10x ספציפי, 1 μL של dNTPs 10 מ"מ, 2.5 μL של sulfoxide דימתיל (DMSO), 0.5 μL (50 ng) של הכנה פלסמיד, ו 1 ΜL של 20 מניות מניות פתרונות של כל פריימר בהיקף כולל של 50 μL.
- מחממים את תערובת ה- PCR עבור 15 s ב 95 מעלות צלזיוס, הממשלה אותו 15 S ב 50 מעלות צלזיוס, ו להאריך אותו במשך 4 דקות ב 72 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של 35 מחזורים.
- ג 'ל לטהר את בוטה ספציפימוצר PCR באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרי, בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- לשכפל את קטע ה- DNA לתוך וקטור pCMV-SC קהה בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- לינאריזציה של פלסמיד חיובי בת הים (בשם pCMV-SC_Mermaid) עם אנמה סמה אני הגבלה עבור הכניסה הבאה של האמרגן HuC.
- הגדר את תגובת ההגבלה כדלקמן: 0.5 μL (10 U) של אנמה הגבלה סמה אני, 2 μL של חיץ 10x קיט, ו 5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד בנפח כולל של 20 μL. דגירה התגובה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1 ח.
- ג'ל לטהר את פלסמיד מתעכל באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרי בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- PCR-להגביר את האמרגן HuC (pHuC), עם פולימרז DNA Phenu דג הזברה הדנומית דג הזברה כמו בתבנית, באמצעות זוג primers ספציפיים HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA ו HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) ו פורש 3,150-bp במעלה הזרם של ATG.
- הגדרת תערובת ה- PCR באמצעות ערכת הבאה: 0.5 μL של פולימראז DNA Pfu, 7.5 μL של חיץ 10x מסוים, 1 μL של dNTPs 10 מ"מ, 2.5 μL של DMSO, 200 ng של DNA גנומי, ו 1 μL של 20 מיקרומטר פתרונות מלאי של כל פריימר בהיקף כולל של 50 μL.
- לאחר צעד ראשוני של 2 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, לחמם את תערובת ה- PCR עבור 15 s ב 95 מעלות צלזיוס, הממשלה אותו במשך 15 שניות ב 50 מעלות צלזיוס, ו להאריך אותו במשך 4 דקות ב 72 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של 35 מחזורים .
- ג'ל לטהר את המוצר PCR בוטה ספציפי באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרי בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- לקשר כמות שווה של pcmv-SC_Mermaid (שלב 1.5) ואת ה- DNA pHuC (שלב 1.7) באמצעות 1 μL של ליגז DNA T4 ו 1 μL של חיץ 10X ספציפי בנפח כולל של 10 μL. דגירה התגובה עבור 16 שעות ב4 ° C.
- להפוך aliquot של תאים המוסמכות עם 5 μL של התגובה קשירת (שלב 1.8) בעקבות הוראות היצרן.
- בחר את שיבוטים חיובי pHuC (pHuC_Mermaid) עם היזם מוכנס בכיוון הנכון על ידי עיכול סאל I- אקו RV פעמיים (האתר סאל אני הגבלה הוכנס במעלה הזרם של מקדם שבר בשלב 1.6, בעוד Eco RV הגבלת האתר ממוקם במורד הזרם של אזור polyadenylation, PolyA, של pCMV-SC פלסמיד).
- הגדר את תגובת ההגבלה כדלקמן: 0.5 μL (10 U) של שניהם אני סאל אני ואנזים RV הגבלה, 2 μL של חיץ kit10X, ו 1 מיקרוגרם של ה- DNA pHuC_Mermaid בנפח כולל של 20 μL. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות. הפעל את התגובות על גבי ג'ל agarose.
2. עוברי Microinjection
- להעביר את מופרית למשלGS המתקבל wild-type (זן AB) או דג הזברה Sod1-G93R מבוגר 4 כדי צלחת 10 מ"מ פטרי באמצעות פיפטה פלסטיק.
- שוטפים את העוברים במים קרים (4 מעלות צלזיוס) דגים ו microinject אותם מיד חלמון עם 200 pg של pHuC_Mermaid פלסמיד באמצעות microinjector (לתיאור כולל ומפורט של הליך microinjection, ראה הפניות 7 ו - 8).
- באמצעות פיפטה פלסטיק, להעביר את העוברים לצלחת פטרי דגירה אותם במי הדגים על 28 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי (20-24 שעות לאחר ההפריה, hpf) עבור הניתוחים הבאים.
3. ספונטנית זנב סליל ניתוח
הערה: להעריך את התנהגות זנב ספונטנית זנב ב 20-24 עוברים hpf עם או בלי riluzole התרופה.
- העברת העובר לצלחת פטרי 90 מ"מ עגול מלא מים דגים המכילים 0.2% DMSO (רכב riluzole) ו ידנית dechorionate זה באמצעות twמלקחיים של תכשיטן עם טיפים חדים. לדגור את העובר במשך 5 דקות.
- זיהוי הזנב פיתול ב RT במהלך הקלטה וידאו 1 דקות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על stereomicroscope. לרכוש סדרה בזמן ברזולוציה של 30 מסגרות / s.
- חישוב תדירות של זנב ספונטנית coilings על ידי ספירת מספר bends (הן contralateral ו ipsilateral) ליחידת זמן.
- כדי להעריך את ההשפעה של riluzole התרופה, בעדינות להשתמש פיפטה פסטר פלסטיק להעביר את העובר לצלחת פטרי 90 מ"מ חדש מלא מים דגים המכילים 5 מיקרון riluzole.
- דגירה העובר במשך 5 דקות לפני הקלטה של 1 דקות וידאו וביצוע ניתוח התנהגותי כאמור.
4. הדמיה ההתקנה של הדמיית Biosensor בת הים בעוברים חיים: זיהוי סימולטני של אותות התורם ו acceptor
- הר העוברים 20 - 24 hpf ב 1% נמוך נמס agarose נקודת במים דגים ב37 ° C בתוך 35 מ"מ זכוכית בתחתית הדמיה צלחת. אוריינט את העוברים על צדם. המתן עד agarose מתקשה בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את צלחת הדמיה לשלב של confocal הפוך רכוב על מיקרוסקופ הפוך. זיהוי נוירונים מוטוריים להביע את biosensor עם מטרה 20X (0.7 צמצם המספרי, NA) על ידי מרגש mUKG עם 488 ננומטר קו לייזר ארגונית הקלטה ההקלטה שלה בין 495 ו 525 ננומטר.
- עבור מדידה סריג, לעורר mUKG, התורם של זוג סריג, עם קו לייזר 488 ננומטר. במקביל לזהות, עם סורק התהודה ההפעלה ב 8,000 הרץ במצב דו כיווני, הקרינה הנפלטת על ידי התורם (בין 495 ו 525 ננומטר) ואת הקרינה הנפלטת על ידי המקבל mKOk (בין 550 ו 650 ננומטר, ערוץ סריג). אם זמין, להשתמש לייזר 473 ננומטר.
הערה: יעילות העירוי של התורם תהיה קטנה במקצת (85% במקום 93% עם 488 ננומטר), אבל את עירור צולבת של acceptor יהיהיופחת גם (מ 17% עם 488 ננומטר ל 9% עם 473 ננומטר קו לייזר). - כדי להפחית phototoxicity ו הלבנה fluorophore, למזער את הארה של המדגם על ידי הפחתת כוחו של קו לייזר (על חלון הנתיב קרן של תוכנת הרכישה).
- לייעל את עירור כדי להתאים רווח הפרמטרים לקזז שנקבעו בתחילת הניסוי ונשמר קבוע לאורך כל הפגישה. כדי להגדיר את ההיסט, שנה את צבע התמונה לעוצמת העוצמה (באמצעות טבלת החיפוש Q), ובזמן שסורק את הלייזר, סובב את כפתור ההיסט (אופסט חכם) כך שלפיקסלי הרקע יש מעט עוצמה גבוה מאפס. עם אותו שולחן נראה, על ידי החלפת הלייזר בזמן סריקה, להפוך את כפתור הרווח (רווח חכם) כדי למקסם את יחס אות לרעש, נזהר להימנע פיקסלים רוויים.
- באמצעות פתח פתח (2 יחידות אוורירי), לרכוש תמונות 16 סיביות כדי לספק טווח דינמי מספיק quantitativE מנתח. הימנע ממוצעים כדי להגדיל את מהירות הרכישה כדי למזער photobleaching.
- בחלון רכישת התוכנה, בחר גודל שדה תמונה של 512 x 64 פיקסלים (גודל פיקסל: 605 ננומטר) מהתפריט הנפתח.
- מ חלון מצב הרכישה, בחר xyt (זמן לשגות על מטוס Xy יחיד) f ROM את התפריט הנפתח ורשום את השינויים העובר מתח הנוירון השדרה על ידי רכישת מטוס Xy יחיד, הגדרת פרמטרים הרכישה כדי להקליט תמונה אחת בכל 30 Ms במשך 1 דקות.
- כדי להעריך את ההשפעה של הממשל riluzole על המפולת הממברנה של נוירון אותו, לרכוש מערך נתונים חדש 5 דקות לאחר תוספת של מים דגים המכילים 5 מיקרון riluzole.
- לניתוח FRET, השתמש ב- BIOSensor_FRET מאקרו של ImageJ (הבעת חיישנים מסוג FRET של שרשרת אחת.
- להעריך את יחס הממברנה הבסיסית של כל נוירון ב t 1 כמו ((משמעות FRET - רקע רקע) / (התורם אומר - רקע התורם)), שבו FRET ו Donאו בעוצמה הממוצעת היא עוצמת הקרינה מתכוון מחושב באותו אזור של עניין (ROI) נמשך סביב התא עבור כל ערוץ רכשה ו סריג רקע התורם היא עוצמת הקרינה מתכוון מחושב ההחזר על ההשקעה של שדה הראייה ללא מדגם פלואורסצנטי.
הערה: תיאור מפורט שלב אחר שלב של השימוש בפלאגין ניתן למצוא באתר האינטרנט www.med.unc.edu /microscopy/resources/imagej - plugins - and - macros/biosensor - fret . - השתמש בתוכנת גרפים כדי להשוות את תדירות, משרעת ומשך של קוטביות בין פרדיגמות ניסוי שונות. השווה בין שתי קבוצות באמצעות t- test של תלמיד לא מזוהה ולשקול ערכים ממוצעים כפי שונה סטטיסטית כאשר P <0.05.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
וקטור הביטוי נושא את קידוד ה- BIOSensor המבוסס על תרכובת ה- Mermaid ביולוגית, תחת שליטתו של האמרגן הפאן-נוירוני של ה- pHuC, המניע את הסינתזה של החלבון באופן בלעדי במערכת העצבים, נמסר לתוך ביצים מופרות של תא בודד באמצעות מיקרו- כדי לקבל עוברי מהונדס חולף ( איור 1 , לוח שמאל). לאחר מאסטרינג הטכניקה microinjection, אחוז עוברים חיובי בת הים היה קרוב ל 100%. בין אלה, רק את העוברים להביע את הכמות הנכונה של biosensor בת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המוצג כאן אפשר לנו לחקור את הקשר בין התכונות החשמליות של עוברי דג הזברה נוירונים מוטוריים עמוד השדרה ואת ההתנהגות סלילה ספונטנית, הפעילות הסטריאוטיפית המוקדם המוקדם ביותר, אשר מופיע סביב 17 hpf של התפתחות עובריים ונמשך עד 24 hpf 10 .
הגישה שלנו מספקת לחוקרים כלי לבדיקת המערכת העצבית של העוברים השלמים, תוך שמירה מלאה על המורכבות של האינטראקציות בין תאים ברשת תפקודית מתפתחת. ההדמיה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לסימונה רודיגירו על תמיכתה שלא תסולא בפז בניתוח הדמיית FRET.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נקודת התכה נמוכה אגרוז | סיגמא-אולדריץ' | A9414 | |
| DMSO | סיגמא-אולדריץ' | W387520 | |
| רילוזול | סיגמא-אולדריץ' | R116 | |
| Pfu אולטרה HQ DNA פולימראז | אג'ילנט טכנולוגיות - חטיבת מוצרי סטרטג'ן | 600389 | |
| פריימר אוניברסלי T3 | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI פריימר | Eurofins | ||
| StrataClone מערכת וקטורית ביטוי יונקים / וקטור קהה pCMV-SC | אג'ילנט טכנולוגיות - חטיבת מוצרי סטרטג'ן | ||
| סמאי | ניו אינגלנד Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | ניו אינגלנד Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | ניו אינגלנד Biolabs | R0195S | |
| 35 מ"מ, צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית | Ibidi | 81151 | |
| מלקחיים | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| סטריאומיקרוסקופ | Leica Microsystems | M10 F | |
| מצלמה דיגיטלית | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 תוכנה | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | מיקרוסקופ קונפוקלי של אפל | ||
| (הפוך) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| מיקרו-מזרק | אפנדורף | מאקרו Femtojet | |
| ImageJ Biosensor_FRET | |||
| פריזמה GraphPad 6.0c | תוכנת GraphPad, בע"מ |
מקורות
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
