מאמר שיטה

שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

DOI:

10.3791/55304

⸱

16 במרץ 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (בהלבשה) פונקציה וביטוי באמצעות מודל תרבית תאים במבחנה של תאי קאקו-2 גדל ב -3 D ו מודל vivo לשעבר של מעי עכבר. שיטות אלו חלות על המחקר של מובילי אפיתל אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל המעי יש פונקציות תחבורת מחסום חשובות לשחק תפקיד מפתח פונקציות פיסיולוגיות של הגוף תוך מתן מחסום חלקיקים זרים. תחבורת אפיתל פגומה (יון, מזין, או תרופות) נמצאת קשורה למחלות רבות ויכולה להיות שלכות מרחיבות מעבר הפונקציות הפיזיולוגיות של מובילים, כגון באמצעות השפעה על שלמות אפיתל ואת Microbiome הבטן. הבנת הפונקציה והרגולציה של חלבוני תחבורה היא קריטית להתפתחות של התערבויות טיפוליות השתפרו. האתגר הגדול ביותר בחקר תחבורת אפיתל מפתחת מערכת מודל מתאימה כי משחזרת תכונות חשובות של תאי האפיתל במעי הילידים. כמה במבחנה מודלים תרבית תאים, כגון קאקו-2, T-84, ותאי HT-29-Cl.19A משמשים בדרך כלל במחקר תחבורה אפיתל. שורות תאים אלה מייצגות גישת רדוקציוני דוגמנות הדוארpithelium שמש במחקרים מכניסטית רבים, כולל ובדיקתם של אינטראקציות אפיתל-מיקרוביאלי. עם זאת, monolayers התא אינו משקף במדויק תאי תאי אינטראקציות ואת microenvironment vivo. תאים שגודלו 3D הראו להיות מבטיח מודלים ללימודי חדירות התרופה. אנו מראים כי תאי קאקו-2 ב -3 D יכול לשמש כדי לחקור מובילי אפיתל. כמו כן, חשוב כי מחקרים בתאי קאקו-2 הם השלימו עם מודלים אחרים כדי לשלול תופעות תא ספציפיות לקחת בחשבון את המורכבות של מעי הילידים. כמה שיטות שמשו בעבר על מנת להעריך את הפונקציונליות של מובילים, כגון צק ספיג כלפי חוץ בתאי אפיתל מבודדים או שלפוחית ​​הממברנה מבודדת. אם ניקח בחשבון את האתגרים בתחום ביחס למודלים ומדידת פונקציה תחבורה, אנחנו מדגימים כאן פרוטוקול לגדל תאים קאקו-2 ב 3D ולתאר את השימוש בתא Ussing כקובץגישה יעילה למדידת תחבורה סרוטונין, כגון ב epithelia מעיים שלם מקוטב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל המעי מצויד חלבוני תחבורה שונים (ערוצים, ATPases, שיתוף מובילי מחליפים) המבצעים פונקציות רבות, החל קליטת חומרים מזינות, אלקטרוליטים, ותרופות הפרשת הנוזלים ויוני לומן. חלבונים התחבורה ליצור הדרגתיים אלקטרוכימיים לאפשר תנועה של יונים או מולקולות באופן וקטורי. זו מושגת על ידי החלוקה הסימטרית של מערכות התחבורה בממברנות הפסגה ו basolateral של תאי אפיתל מקוטבים. בנוסף, צומת הדוקים, אשר לקשור תאי אפיתל סמוכים, ממלא תפקיד חשוב בתהליך זה על ידי המשרת כמחסום דיפוזיה intramembrane של רכיבים בין תחומי קרום apical ו basolateral. מערכות דגם מתאימות מחקו תכונות אופייניות הבאות של מעי הילידים (קוטבי כלומר, בידול, ויושרת צומת חזקה) הם קריטיות עבור המחקר של functionality של מערכות תחבורה אפיתל.

בנוגע למודלים, שורות התאים האופייניות בשימוש כיום במחקר תחבורת האפיתל במעי הם קאקו-2, מודל של בדיל באופן מלא, קליטה תא אפיתל מעי דק; ותאי T-84 או HT-29 subclones, מודלים של תאים אפיתל במעי גדול הנגזרות הקריפטה 1. כמקובל, שורות תאים אלה גדלים כמו monolayers ב משטחי פלסטיק או מוסיף transwell מצופה. חוצה גם תרבית תאים מוסיף במידה מסוימת דומה בסביבה vivo בכך שהוא מאפשר לתאים מקוטבים להאכיל basolaterally. עם זאת, מגבלת מערכות תרבות 2D המקובלות היא כי התאים נאלצים להסתגל משטח מלאכותי, שטוח, ונוקשה. לפיכך, את המורכבות הפיזיולוגיות של האפיטל היליד אינה משתקפות במדויק מערכת 2D. מגבלה זו כבר להתגבר על ידי שיטות לגדל תאי 3D בתוך המיקרו-סביבה ספציפית, כגון mixtur חלבון הדביקדואר, המכיל מגוון של רכיבים התאים מטריקס 2, 3. אף על פי כן, התרבויות במבחנה לא יכול לדמות את המורכבות של האפיתל במעי, אשר יש סוגי תאים מרובים ואדריכלות המיועד לאזור ספציפי במעי. לפיכך, המחקרים באמצעות מודלי תרבית תאים דורשים אימות נוספת במעי הילידים. באמצעות תרבית תאי 3D במבחנה רירית מעי עכבר, אנו מתארים כאן שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (SLC6A4, בהלבשה).

טרנספורטר בהלבשה מסדיר את הזמינויות התאיות של הורמון חשוב הנוירוטרנסמיטר, 5 hydroxytryptamine (5-HT), על ידי במהירות והובלתו באמצעות Na + / Cl - תהליך תלוי. בהלבשה היא מטרה ידועה של תרופות נגד דיכאון, התפתחה לאחרונה כמטרה טיפולית חדשנית של הפרעות במערכת עיכול, כמו שלשול ודלקת מעיים.שיטות לחקור ספיגת 5-HT בתאי האפיתל במעי תוארה בעבר. לדוגמא, תאי קאקו-2 גדלו על תומך פלסטיק או מוסיף חדיר הוכחו להפגין fluoxetine רגיש 3 H-5-HT ספיג הן תחומי פסגה ו basolateral 4. מדידת התפקוד בהלבשה ב מבודד מברשת גבול ממברנה שלפוחית (BBMVs) שהוכנה במעי דק תורם אנושי איבר אף תוארה על ידינו 5. ספיג 3 H-5-HT ב BBVMs האנושי הוצג להיות fluoxetine רגיש Na + / Cl - תלוי, וזה הציג קינטיקה רווי עם K m של 300 ננומטר 5. ניצול בשיטות דומות, אנחנו גם נמדדנו קודם לכן פונקציה בהלבשה כמו 3 ספיגת H-5-HT ב BBMVs עכבר מעי 6. עם זאת, הכנת שלפוחית ​​קרום פלזמה טהורה דורשת כמות גדולה של רירית רקמות. שיטות אחרות, כגון radiogלהדמית raphic של 3 אתרים ספיגים H-5-HT, גם הוכחה בעבר שרקן ומעי עכברוש קטנים 7.

תא Ussing מספק מערכת פיזיולוגית יותר למדוד את התחבורה של יונים, חומרים מזינים, וסמים פני רקמות שונות אפיתל. היתרון העיקרי של הטכניקה קאמרית Ussing הוא שהיא מאפשרת מדידה מדויקת של פרמטרים חשמליים והובלה של שלם, אפיתל המעי מקוטב. יתר על כן, כדי למזער את ההשפעה של מערכת עצבית-שרירית מהותי, הפשטה seromuscular של רירית המעי ניתן לבצע כדי לחקור את הרגולציה של מובילי באפיתל 8.

אנו מראים כי קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D על חלבון דביק יוצרים לומן חלול להביע סמני פסגה ו basolateral ברורים. תאים אלו מראים ביטוי גבוה של בהלבשה מאשר תאי 2D קאקו-2. שיטות לגדל תאי 3D וכדי peimmunostaining rform או מיצוי RNA והחלבון מתואר. בנוסף, אנו מתארים שיטות ללמוד לתפקד בהלבשה וויסות TGF-β1, ציטוקין pleiotropic, ב רירית המעי הדק בעזרת ניצול טכניקה קאמרית Ussing.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר 1. של מסועי מעיים בתוך מערכת תרבות 3D של קאקו-2: קאקו-2 3D גידול תרבית תאים על תערובת חלבון דביקה

  1. גורם גדילת הפשרה מופחת תערובת חלבונים דביקה על קרח למשך 8 שעות (או O / N) בשעה 4 מעלות צלזיוס. לאחר מופשר, להפוך 1 מ"ל או 500 aliquots μL לשימוש או בחנות ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  2. ביום התרבות, precool צלחות התרבות (להפקת RNA וחלבון) או שקופיות תאיות (עבור immunostaining) על קרח. הוסף 30 μL של תערובת חלבונים דביקה היטב בכל שקופית שמונה גם מחולקת לתאים-זכוכית (או 120 μL לכל טוב של צלחת 6-היטב) להתפשט באופן שווה. יש להיזהר שלא ליצור בועות אוויר תוך כדי התהליך.
  3. מניחים את השקופיות / צלחות בתוך תרבית תאים חממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 - 30 דקות ולאפשר לתערובת חלבון דביקות כדי לחזק.
  4. בעוד תערובת החלבונים הדביקה היא לחיזוק, trypsinize בקבוק ומחוברות של תאי קאקו-2.
  5. הספירהשל תאים ומסובב אותם ב XG 500 בצנטריפוגה השולחן במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 3D קאקו-2 בינוני לפי הצורך.
  6. זרעי השקופיות קאמרי זכוכית ב 4000 תאים לכל טוב (צלחות, 20,000 לכל טוב). אפשר התאים לגדול בתוך חממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. שנה בינונית כל 3 - ד 4.

2. Immunofluorescence מכתים עבור מסועים אפיתל בתוך תאים 3D קאקו-2: יום 1

  1. לשאוב הבינוני לתקן את התאים עם 400 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) (ב PBS עם pH מותאם 8.5 עם NaOH) למשך 30 דקות ב RT.
    הערה: פתרון PFA לא צריך להיות מאוחסן במשך יותר מ -1 שבוע ב 4 ° C, ואת הפתרון יכול לשמש טרי. זהירות: PFA היא רעילה ביותר ו קרצינוגן פוטנציאלי. תמיד טפל בו בזהירות במנדף כימי ושימוש בציוד מגן אישי.
  2. יש לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS 1x ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C ב PBS (400 μL /טוֹב). לאחר קבוע, ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  3. מומלץ לחמם את השקופיות הקאמריות כדי RT (זה יקשיח מיטת תערובת חלבונים הדביקה ולהפוך אותו קל לשאוב במהלך שלבי הכביסה).
  4. Permeabilize את התאים עם 0.5% טריטון ב PBS לא יותר מ -15 דקות.
  5. הכן חיץ PBS-גליצין (130 mM NaCl, 7 מ"מ Na 2 4 HPO, 3.5 מ"מ לאא 2 PO 4, ו -100 מ"מ גליצין). לשטוף 3x עם 1x PBS-גליצין במשך 10 דקות כל אחד ב RT.
  6. הכן חיץ immunofluorescence (IF): 130 מ"מ NaCl, 7 מ"מ Na 2 4 HPO, 3.5 מ"מ לאא 2 PO 4, 100 מ"מ גליצין, 7.7 מ"מ NaN 3, 0.1% BSA, 0.2% TritonX-100, ו 0.05% Tween-20 .
  7. 3x לשטוף IF חיץ במשך 10 דקות כל אחד ב RT. בלוק 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במאגר IF. דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל סרום עיזים IF + 1%, 200 μL / גם עבור 1 - 2 שעות ב RT. לשטוף עם 3x חיץ IF במשך 10 דקות כל אחד.
  8. דגירה עם אנטי משניהגוף (1: 200) מדולל IF + 1% NGS, 200 μL / היטב, עבור 1 ש 'ב RT.
  9. לשטוף עם חיץ IF שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. שמור את השקופיות בחושך משלב זה על. הרם את תאי הפלסטיק מן שקופיות זכוכית על ידי צבת את השקופית הקאמרית בפומית שחורה והחלקת מרים לבן דרך מחזיק עד מגעי הקצה שלה לקץ הבארות. משכו בעדינות את התאים (מחזיק המרים צריך לבוא עם מגלשות התרבות).
  10. הר עם מדיום אנטי לדעוך לאט ולאפשר לו להתייבש במשך 10 דקות ב RT.
  11. מיובש פעם לגמרי, לאטום את השקופיות עם לק ותמונה אותם עם מיקרוסקופ confocal. אחסן את השקופיות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים או ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.

3. רנ"א מיצוי חלבון מתאי 3D קאקו-2

  1. פנקו את התאים בתרבית על תערובת חלבונים דביקות עבור 12 - 14 ד עם סוכן הבדיקה, כגון β1 TGF- (10 ng / mL, 1 ח).
  2. לאחר הטיפול, לשטוף את התאים עם 1x PBS. שמור את התאים על קרח למשך 30 דקות כדי למוסס את תערובת חלבונים הדביקה.
  3. לשטוף את הבארות עם PBS הצונן לאסוף את תאי צינורות צנטריפוגות בודדים. אוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה ב XG 500 ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חלץ את RNA באמצעות הליכים סטנדרטיים להשתמש בזמן אמת RT-PCR.
  4. להפקת חלבון, lyse התאים באמצעות חיץ תמוגה התא 1x השלימו עם מעכב פרוטאז קוקטייל 1x. לאחר הוספת חיץ תמוגה התא גלולה, lyse התאים על ידי sonication ולהסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 7500 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

4. מדידה של 5-HT ספיגת עכבר מעי ניצול לשכת Ussing: הכנת מעיים ו Seromuscular שלילת

  1. בעקבות המתת חסד, לנתח העכברים ולהסיר את המעי הדק (אחרי הקיבה לפני cecum). מחלק את המעי הדק לשלושה חלקים. מחק את השליש האמצעי, השתמש השלישי הפרוקסימליכמו מְעִי צָם, ולהשתמש השלישי דיסטלי כמו מעי. הימנע משיכת המעי מעיקול mesenteric שלה כדי למנוע נזק האפיתל. לשמור על קור קטע רקמה על ידי כיסוי אותו עם חיץ קר כקרח קרבס-רינגר ביקרבונט (KBR).
  2. פתח את המעי longitudinally באמצעות מספריים. דגירת סעיפים במעי ניכרו טרי קר כקרח, בגז KBR המכיל אינדומטצין 1 מיקרומטר במשך 10 דקות לפני seromuscular ההפשטה.
  3. הצמד את סעיף מעיים (~ 1 ס"מ אורך) הרירית בצד למטה לצלחת המכיל agarose 7% או אלסטומר סיליקון נרפא (0.5 ס"מ עובי).
  4. להפשיט את שכבות seromuscular תחת סטראו דיסקציה עם תאורה תחתית. חותכים את שכבת seromuscular באמצעות סכין אזמל נוצה. שימוש במלקחיים בסדר להשיג קצה השכבה לאורך ציר האורך של המעי.
    הערה: במהלך הליך ההפשטה, התאורה התחתונה של סטראו עוזרת לזהות ולהימנע אזורים עם התיקון של Peyeres.
  5. לאחר השלים הפשטת seromuscular, הר הרירי בקפידה על הפינים של חץ תא Ussing. במהלך כל התהליך, לטפל להחזיק את הרקמה הרירית כיסחה בקצותיו מבלי לקרוע אותו.

5. איזון וטיפול רקמות

  1. הכן פתרון של Kreb: 115 מ"מ NaCl, 25 מ"מ 3 NaHCO, 2.4 מ"מ K 2 4 HPO, 1.2 מ"מ CaCl 2, 1.2 מ"מ MgCl 2, ו -0.4 מ"מ KH 2 PO 4 ב- pH 7.4, בגז עם 95% O 2/5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. הוסף 10 מ"מ גלוקוז לאמבטיה serosal כדי לשמש מצע אנרגיה ו -10 מ"מ מניטול לאמבטיה הרירית כדי לשמור על האיזון האוסמוטי.
    הערה: הפתרון של Kreb הוא השלים עם חומצת L-אסקורבית (100 מיקרומטר) pargyline (100 מיקרומטר, מעכב מונואמין אוקסידאז) כדי למנוע שפלה תאית 5-HT.
  2. הכנס את המחוון לתוך התא לחשוף הוא את סי הפסגה (לומינל)דה והצד (serosal) basolateral של הרקמה כדי פתרון של Kreb.
  3. לאחר תקופת איזון של 10 דקות, pretreat רקמת ileal עם fluoxetine (10 מיקרומטר) למשך 30 דקות בצד הפסגה עבור MS J (רירית אל serosal שטף).
  4. פנקו את הרקמה עם-β1 TGF (10 ng / mL) במשך שעה 1 בצד basolateral ואז דגירה אותו עם 3 [ח] -5-HT (20 ננומטר) למשך 30 דקות בצד הפסגה.

6. כימות רירית כדי Serosal Flux (ms J) ו -3 [ח] הצטברות -5-HT ברקמה

  1. אסוף 0.75 aliquots מיליליטר ממאגר serosal (סה"כ 5 מיליליטר) כדי למדוד את הרדיואקטיביות מונה נצנץ נוזלי לחשב רירית אל serosal (ms J) מחירי שטף; fluoxetine רגיש שטף מייצג בהלבשה בתיווך 3 [ח] ספיגה -5-HT.
  2. כדי למנוע הבדלי לחץ ההידרוסטטי פני הרירי במהלך תקופת שטף, לקחת דגימות מצד serosal מחדשלמקם אותם עם כמויות זהות של מדיום אמבטיה.
    הערה: החישוב השטף מתקנת עבור דילול של המדגם סוף (4.25 מ"ל / 5 מ"ל = 0.85).
  3. עבור כימות של 3 [ח] -5-HT שנצבר בתוך הרקמה, לרדת רירית מן המחוון, לשטוף אותו פעם עם חיץ KRB קר כקרח, ולמקם אותו צינורות תרבות זכוכית.
  4. דגירה רירית ב 0.5 מ"ל של 10% KOH לילה בשעה 37 ° C. מדוד את הרדיואקטיביות ב 150 aliquots μL של lysates (ב triplicates) בעזרת מונה נצנץ נוזלי.
  5. השתמש aliquots (3 - 5 μL) של lysates למדוד ריכוז החלבון בשיטת ברדפורד.
    הערה: 10 מ"ל של מדיום הדגירה המכילים סרוטונין רדיואקטיבי משמש כסטנדרט. 5-HT שמר ברקמת מבוטא pmol / מ"ג חלבון / min.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunostaining ציסטות 3D קאקו-2 מוצג באיור 1. תמונה מייצגת של מטוס- XY מראה לומן היטב תחום של ציסטה 3D מוכתמת יקטין phalloidin מתוארת באיור 1 א. הצד הפונה לומן מציין את צד הפסגה. תאי אפיתל בתרבית מכך סביבת 3D ב פנוטיפ אפיתל חזק. קאקו-2 ציסטות שונים ביום 12, כאשר יקטינו בהלבשה הייתה שיתוף מוכתם, מוצגים באיור 1B. בייצוג זה של מטוס XY (שונה מהמטוס שמוצג באיור 1 א), מכתים בהלבשה גלוי, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לגמרי תא בדיל קאקו-2 monolayers נעשה שימוש נרחב כמו מקוטב monolayers אפיתל ללמוד תחבורת מעיים 10, 11, 12, 13, 14, 15. עם זאת, כדי לחקות את הארגון הפיזיולוגי של תאי אפיתל במעי, חלה התעניינות רבה בפיתוח תרבות קאקו-2 ב 3D. מספר מודלי תרבית תאי 3D עבור תאי האפיתל במעי פותח לאחרונה מחקי מטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למר כריסטופר מנזלה, דוקטורנט במעבדת RKG, על עזרתו בעריכה ובהגהה של כתב היד שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x PBSATCCATCC® HTB­ 37 וסחר;תאים
10x PBSCarl ZeissMicrosope להדמיה קונפוקלית
3[H]-5-HT LabtekII152453תרבית תאים למיקרוסקופיה
5-HT גיבקו70013-032אינו חומר מסוכן
95% O2- 5% CO2 צילינדרKPL71-00-27אינו חומר מסוכן
אגר (לצלחות אגר)FischerBP151-100רעילות חריפה, אורה
אגר (לאלקטרודה)SigmaG7126-1KGלא חומר מסוכן
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLאינו חומר מסוכן
אלבומין בסרום בקר (BSA)SigmaP6148-500Gמזיק אם נבלע או אם נשאף
CaCl2LifeTechnologiesA12380אינו חומר מסוכן
תאי Caco-2סיגמאA8806-5Gאינו חומר מסוכן
מאגר ליזה תאיםפישר BP337-100לא א חומר מסוכן
שקופיות ChaberedSigmaS5886-1KGלא חומר מסוכן
תמיסת קולגן Type-1סיגמאS8045-500G
אלקטרודותסיגמאS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג356234משמש כמטריצה חוץ-תאית
פלואוקסטיןקיאג'ן74104
ג'נטמיציןATCC30-2003תרבית תאים
מדיה גליציןאיתות תאי, דנברס, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
חומצה L-אסקורבית ג'יבקו מבית לייף טכנולוגיות10082147
מונה נצנוץ נוזלי Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, סן דייגו, קליפורניה EM-CSYS-8
מניטולמכשירים פיזיולוגיים, סן דייגו, קליפורניה P2304
Matrigelמכשירים פיזיולוגיים, סן דייגו, קליפורניה VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, סן דייגו, קליפורניה DM MC6
מהדק מתח/זרם רב-ערוציים, סן דייגו, קליפורניה P2300
NaClמכשירים פיזיולוגיים, סן דייגו, קליפורניה P2023-100
NaClFisher Scientific, המפטון, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MOS5886
סרום עיזים רגיל (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, סנט לואיס, MOC3881
מגיב לבדיקת חלבוןסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO10420
קוקטייל מעכב פרוטאינאזMEDOX, שיקגו, IL סגנון G- 12300
RNA קל מיני ערכתסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOM4125
מודול קלט אלקטרודה ערוץ יחיד סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOA92902
מחוונים עבור snapwell Chambersסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOH9523
נתרן פוספט (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
נתרן-הידרוקסיד (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1פרקין-אלמר, וולת'אם, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (תא בלבד)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich, סנט לואיס, MOA1296
מכשירים פיזיולוגיים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003(2014).
  3. Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
  4. Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
  5. Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
  6. Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
  7. Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
  8. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  9. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  10. Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
  11. Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
  12. Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
  13. Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
  14. Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
  15. Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
  16. McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
  17. Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654(2014).
  18. Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
  19. Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
  20. Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

תגיות

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

מאמרים קשורים