Method Article

שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (בהלבשה) פונקציה וביטוי באמצעות מודל תרבית תאים במבחנה של תאי קאקו-2 גדל ב -3 D ו מודל vivo לשעבר של מעי עכבר. שיטות אלו חלות על המחקר של מובילי אפיתל אחרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל המעי יש פונקציות תחבורת מחסום חשובות לשחק תפקיד מפתח פונקציות פיסיולוגיות של הגוף תוך מתן מחסום חלקיקים זרים. תחבורת אפיתל פגומה (יון, מזין, או תרופות) נמצאת קשורה למחלות רבות ויכולה להיות שלכות מרחיבות מעבר הפונקציות הפיזיולוגיות של מובילים, כגון באמצעות השפעה על שלמות אפיתל ואת Microbiome הבטן. הבנת הפונקציה והרגולציה של חלבוני תחבורה היא קריטית להתפתחות של התערבויות טיפוליות השתפרו. האתגר הגדול ביותר בחקר תחבורת אפיתל מפתחת מערכת מודל מתאימה כי משחזרת תכונות חשובות של תאי האפיתל במעי הילידים. כמה במבחנה מודלים תרבית תאים, כגון קאקו-2, T-84, ותאי HT-29-Cl.19A משמשים בדרך כלל במחקר תחבורה אפיתל. שורות תאים אלה מייצגות גישת רדוקציוני דוגמנות הדוארpithelium שמש במחקרים מכניסטית רבים, כולל ובדיקתם של אינטראקציות אפיתל-מיקרוביאלי. עם זאת, monolayers התא אינו משקף במדויק תאי תאי אינטראקציות ואת microenvironment vivo. תאים שגודלו 3D הראו להיות מבטיח מודלים ללימודי חדירות התרופה. אנו מראים כי תאי קאקו-2 ב -3 D יכול לשמש כדי לחקור מובילי אפיתל. כמו כן, חשוב כי מחקרים בתאי קאקו-2 הם השלימו עם מודלים אחרים כדי לשלול תופעות תא ספציפיות לקחת בחשבון את המורכבות של מעי הילידים. כמה שיטות שמשו בעבר על מנת להעריך את הפונקציונליות של מובילים, כגון צק ספיג כלפי חוץ בתאי אפיתל מבודדים או שלפוחית ​​הממברנה מבודדת. אם ניקח בחשבון את האתגרים בתחום ביחס למודלים ומדידת פונקציה תחבורה, אנחנו מדגימים כאן פרוטוקול לגדל תאים קאקו-2 ב 3D ולתאר את השימוש בתא Ussing כקובץגישה יעילה למדידת תחבורה סרוטונין, כגון ב epithelia מעיים שלם מקוטב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל המעי מצויד חלבוני תחבורה שונים (ערוצים, ATPases, שיתוף מובילי מחליפים) המבצעים פונקציות רבות, החל קליטת חומרים מזינות, אלקטרוליטים, ותרופות הפרשת הנוזלים ויוני לומן. חלבונים התחבורה ליצור הדרגתיים אלקטרוכימיים לאפשר תנועה של יונים או מולקולות באופן וקטורי. זו מושגת על ידי החלוקה הסימטרית של מערכות התחבורה בממברנות הפסגה ו basolateral של תאי אפיתל מקוטבים. בנוסף, צומת הדוקים, אשר לקשור תאי אפיתל סמוכים, ממלא תפקיד חשוב בתהליך זה על ידי המשרת כמחסום דיפוזיה intramembrane של רכיבים בין תחומי קרום apical ו basolateral. מערכות דגם מתאימות מחקו תכונות אופייניות הבאות של מעי הילידים (קוטבי כלומר, בידול, ויושרת צומת חזקה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר 1. של מסועי מעיים בתוך מערכת תרבות 3D של קאקו-2: קאקו-2 3D גידול תרבית תאים על תערובת חלבון דביקה

  1. גורם גדילת הפשרה מופחת תערובת חלבונים דביקה על קרח למשך 8 שעות (או O / N) בשעה 4 מעלות צלזיוס. לאחר מופשר, להפוך 1 מ"ל או 500 aliquots μL לשימוש או בחנות ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  2. ביום התרבות, precool צלחות התרבות (להפקת RNA וחלבון) או שקופיות תאיות (עבור immunostaining) על קרח. הוסף 30 μL של תערובת חלבונים דביקה היטב בכל שקופית שמונה גם מחולקת לתאים-זכוכית (או 120 μL לכל טוב של צלחת 6....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunostaining ציסטות 3D קאקו-2 מוצג באיור 1. תמונה מייצגת של מטוס- XY מראה לומן היטב תחום של ציסטה 3D מוכתמת יקטין phalloidin מתוארת באיור 1 א. הצד הפונה לומן מציין את צד הפסגה. תאי אפיתל בתרבית מכך סביבת 3D ב פנוטיפ אפיתל חזק. קאקו-2 ציסטות שונים ביום 12, כאשר יקטינו בהלבשה הייתה שיתוף מוכתם, מוצגים באיור 1B. בייצוג זה של מטוס XY (שונה מהמטוס שמוצג באיור 1 א), מכתים בהלבשה גלוי, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לגמרי תא בדיל קאקו-2 monolayers נעשה שימוש נרחב כמו מקוטב monolayers אפיתל ללמוד תחבורת מעיים 10, 11, 12, 13, 14, 15. עם זאת, כדי לחקות את הארגון הפיזיולוגי של תאי אפיתל במעי, חלה התעניינות רבה בפיתוח תרבות קאקו-2 ב 3D. מספר מודלי תרבית תאי 3D עבור תאי האפיתל במעי פותח לאחרונה מחקי מטר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למר כריסטופר מנזלה, דוקטורנט במעבדת RKG, על עזרתו בעריכה ובהגהה של כתב היד שלנו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC® HTB­ 37 וסחר;תאים
10x PBSCarl ZeissMicrosope להדמיה קונפוקלית
3[H]-5-HT LabtekII152453תרבית תאים למיקרוסקופיה
5-HT גיבקו70013-032אינו חומר מסוכן
95% O2- 5% CO2 צילינדרKPL71-00-27אינו חומר מסוכן
אגר (לצלחות אגר)FischerBP151-100רעילות חריפה, אורה
אגר (לאלקטרודה)SigmaG7126-1KGלא חומר מסוכן
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLאינו חומר מסוכן
אלבומין בסרום בקר (BSA)SigmaP6148-500Gמזיק אם נבלע או אם נשאף
CaCl2LifeTechnologiesA12380אינו חומר מסוכן
תאי Caco-2סיגמאA8806-5Gאינו חומר מסוכן
מאגר ליזה תאיםפישר BP337-100לא א חומר מסוכן
שקופיות ChaberedSigmaS5886-1KGלא חומר מסוכן
תמיסת קולגן Type-1סיגמאS8045-500G
אלקטרודותסיגמאS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג356234משמש כמטריצה חוץ-תאית
פלואוקסטיןקיאג'ן74104
ג'נטמיציןATCC30-2003תרבית תאים
מדיה גליציןאיתות תאי, דנברס, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
חומצה L-אסקורבית ג'יבקו מבית לייף טכנולוגיות10082147
מונה נצנוץ נוזלי Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, סן דייגו, קליפורניה EM-CSYS-8
מניטולמכשירים פיזיולוגיים, סן דייגו, קליפורניה P2304
Matrigelמכשירים פיזיולוגיים, סן דייגו, קליפורניה VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, סן דייגו, קליפורניה DM MC6
מהדק מתח/זרם רב-ערוציים, סן דייגו, קליפורניה P2300
NaClמכשירים פיזיולוגיים, סן דייגו, קליפורניה P2023-100
NaClFisher Scientific, המפטון, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MOS5886
סרום עיזים רגיל (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, סנט לואיס, MOC3881
מגיב לבדיקת חלבוןסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO10420
קוקטייל מעכב פרוטאינאזMEDOX, שיקגו, IL סגנון G- 12300
RNA קל מיני ערכתסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOM4125
מודול קלט אלקטרודה ערוץ יחיד סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOA92902
מחוונים עבור snapwell Chambersסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOH9523
נתרן פוספט (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
נתרן-הידרוקסיד (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1פרקין-אלמר, וולת'אם, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (תא בלבד)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich, סנט לואיס, MOA1296
מכשירים פיזיולוגיים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles