בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry
במאמר זה
סיכום
תקציר
מקרופאגים הם phagocytes מקצועי מזרוע מולדת של המערכת החיסונית. במצב יציב, מקרופאגים נינוחים נמצאים ברקמות מבוגר שבו הם פועלים כמו זקיפים קו הקדמי של זיהום נזק לרקמות. בעוד תאי חיסון אחרים מתחדשים ללא הרף מן גזע ההמטופויטים ותאי האב (HSPC) הממוקמים במח העצם, השושלת של מקרופאגים, הידועה כמקרופאגים מקומיים, הוכחה כמתוחזקת בעצמה ברקמות ללא קלט ממחלת HSPCs של מח עצם. השושלת הזו מודגמת על ידי מיקרוגליה במוח, תאי קופפר בכבד ובתאי לנגרהנס באפידרמיס. המעי הגס ומעי הגס lamina propria הם רק רקמות מבוגר ללא מקרופאגים תושב עצמאי HSPC. מחקרים שנערכו לאחרונה זיהו כי מקרופאגים תושב שמקורם hematopoiesis חלמון עובריים מחוץ עובריים (מ) נבדל תאי גזע עובריים hematopoietic (HSC). בין heletopoiesis שק החלמון סופי, eאבות rythromyeloid (EMP) לעורר הן erythroid תאים מיאלואידים, מקרופאגים תושב בפרט. EMP נוצרים רק בתוך שק החלמון בין E8.5 ו E10.5 ימים של פיתוח והם נודדים לכבד העובר כבר בתחילת המחזור, שם הם מתרחבים ומבדילים עד לפחות E16.5. צאצאיהם כוללים אריתרוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי תורן, אך רק מקרופאגים שמקורם ב- EMP נמשכים עד לבגרות ברקמות. אופי חולף של הופעת EMP ואת חפיפה הזמני עם הדור HSC הופך ניתוח של אבות אלה קשה. הקמנו טמוקסיפן- inducible מיפוי פרוטוקול מיפוי מבוסס על ביטוי של מקרופא ציטוקין קולטן Csf1r האמרגן לאפיין EMP ו EMP הנגזרות תאים in vivo על ידי cytometry הזרימה.
מבוא
ישנם מספר גלים רצופים אך חופפים של אבות hematopoietic במהלך התפתחות הצאצאים myeloid להישאר בבגרות. ראשית, אבות "פרימיטיביים" יוצאי דופן מופיעים בשק החלמון העכבר 1 , 2 בין E7.5-E8.25 ו להוליד מקרופאגים עובריים ללא כל ביניים monocytic. אם מקרופאגים נגזר אבות פרימיטיביים להתמיד במוח המבוגר כמו microglia נשאר נושא של חקירה פעילה. שנית, Erythro-Myeloid מבשרי (EMPs) להתעורר בשק החלמון ב E8.5, להיכנס למחזור הדם ליישב את העובר. EMPs לצאת מתוך האנדותל hemogenic שק חלמון במעבר האנדותל ל- hematopoietic Runx1 תלויי 3 , 4 . ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלי בעלי חיים בוצעו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימושים מוסדיים של מכון פסטר (CETEA).
1. ב Utero דופק תיוג ב Csf1r MeriCreMer רוזה LSL-YFP עוברים
- הכן את הפתרון המניות של 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 מ"ג / מ"ל).
- תחת fumehood, לפתוח את בקבוקון 25 מ"ג של OH-TAM ולהוסיף 250 אתנול μL (100%).....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מיפוי גורל גנטי הושג על ידי הממשל ב E8.5 של OH-TAM לתוך Csfrr-Mer-iCre-Mer נשים מזדווגות עם גברים נושאת כתב Rosa26-LSL-eYFP. בנוכחות OH-TAM, כריתה של קסטה להפסיק מוביל הביטוי הקבוע של YFP בתאים המבטאים Csf1r . אספנו שני רקמות hematopoietic: שק החלמון וכבד העובר ורקמה לא hematopoietic, neuroectoderm, מן העוברים ב E10.5. יחיד תא השעיות התקבלו על ידי ניתוק אנזימטי מכני דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה לאחר מכתים עם נוגדנים פלואורסצנטי מצמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גלים שונים של תאים מבשר hematopoietic חלקית חופפים בתוך מסגרת זמן קצר, מה שהופך את הניתוח של התרומה של כל גל של hematopoiesis התפתחותי לתאי החיסון מבחינה טכנית מאתגר מאוד.
טמוקסיפן- inucible Cre מערכות להציע את ההזדמנות כדי לתג תאים ספציפיים באופן זמני inducible לבצע ניתוח שושלתיות בעוברים או מבוגרים, ללא צורך vivo לשעבר או בתרבות חוץ גופית או השתלה. ב tamoxifen-inducible Cre זנים, גן היתוך נוצר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לגלות.
תודות
המחברים מודים לפרופ 'פרדריק גיסמן ופרופ' כריסטיאן שולץ על דיונים מעמיקים; ד"ר חנה גארנר לקריאה ביקורתית של כתב היד, ד"ר חאווייר מונטגוטלי וד"ר ז'אן ג'וברט ואנשי מכון החיות Institut Pasteur לתמיכה בבני אדם; ו Pascal Dardenne ו Vytaute Boreikaite, Amgen Scholar, על סיוע טכני שלהם. המחקר במעבדה EGP ממומן על ידי Institut Pasteur, CNRS, ה- Cercle FSER (FRM וחבילת פתיחה של Institut Pasteur וקונסורציום REVIVE. LI נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקונסורציום REVIVE.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #5 מלקחיים ישרים | כלים מדעיים עדינים | 11251-20 | |
| MC19 / B מספריים אביביים Pascheff-Wolff | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| מספריים ישרים 8.5 ס"מ | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| ערכת נגד עכבר-PE (שיבוט 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 דילול ב-FACs מאגר |
| נגד עכבר CD45.2 APC-Cy7 (שיבוט 104) | Sony | 1149120 | 1/100 דילול ב-FACs מאגר |
| נגד עכבר AA4.1-APC (CD93, שיבוט AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 דילול ב-FACs מאגר |
| נגד עכבר Ter119 PerCP-Cy5.5 (שיבוט Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 דילול ב-FACs מאגר |
| נגד עכבר F4/80-BV421 (שיבוט BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 דילול ב-FACs מאגר |
| נגד עכבר CD11b PE-Cy7 (שיבוט M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 דילול במאגר |
| FACsAnti-Mouse CD16/CD32 (עכבר BD Fc Block, שיבוט 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| סרום בקר עוברי | פישר 11570506 | ||
| קולגנאז D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| צלחת תרבית רקמות 6 בארות | Dutscher Dominique | 353046 | |
| צלחת תרבית רקמות 12 בארות | Dutscher Dominique | 353224 | |
| צלחת תרבית רקמות 24 בארות | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 בארות תרבית רקמה תחתונה בצורת U צלחת | Dutscher Dominique | 353227 | |
| מזרק פלסטיפק 2 מ"ל | Dutscher Dominique | 300185 | |
| רשת ניילון 100 ומיקרו; מסנני תאים m | Dutscher Dominique | 352360 | |
| רשת ניילון 70 ומיקרו; מסננות תאים m | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 מ"ל צינורות בז | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore ערכת סינון, 0.2 μ m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25 מ"ג | סיגמא | H7904-25MG | יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת הכנה ועבודה עם טמוקסיפן ונגזרותיו. השתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים |
| פרוגסטרון | סיגמא | P3972 | השתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים שמן |
| PEG-35 (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| שמן חמניות | Sigma | S5007-250ML | |
| אתנול | Sigma | 24103-1L-R-D | השתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים והשתמש תחת אדים |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל במים) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 ציטומטר זרימה | בקמן קולטר | B75408 | |
| CytoFLEX יומי QC פלואורוספירות | בקמן קולטר | B53230 | |
| ערכת חרוזים ללכידת נוגדנים של VersaComp (2x5 מ"ל) | בקמן קולטר | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | מעבדת ג'קסון | 19098 | |
| B6.129X1-GT(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | מעבדת ג'קסון | 6148 |
מקורות
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
