הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

12.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55305

⸱

17 ביולי 2017

 ,  ,  , 
1Department of Developmental and Stem Cell Biology, CNRS UMR3738, Department of Immunology, Institut Pasteur, 2Cellule Pasteur UPMC, University Pierre et Marie Curie

במאמר זה

סיכום

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

תקציר

מקרופאגים הם phagocytes מקצועי מזרוע מולדת של המערכת החיסונית. במצב יציב, מקרופאגים נינוחים נמצאים ברקמות מבוגר שבו הם פועלים כמו זקיפים קו הקדמי של זיהום נזק לרקמות. בעוד תאי חיסון אחרים מתחדשים ללא הרף מן גזע ההמטופויטים ותאי האב (HSPC) הממוקמים במח העצם, השושלת של מקרופאגים, הידועה כמקרופאגים מקומיים, הוכחה כמתוחזקת בעצמה ברקמות ללא קלט ממחלת HSPCs של מח עצם. השושלת הזו מודגמת על ידי מיקרוגליה במוח, תאי קופפר בכבד ובתאי לנגרהנס באפידרמיס. המעי הגס ומעי הגס lamina propria הם רק רקמות מבוגר ללא מקרופאגים תושב עצמאי HSPC. מחקרים שנערכו לאחרונה זיהו כי מקרופאגים תושב שמקורם hematopoiesis חלמון עובריים מחוץ עובריים (מ) נבדל תאי גזע עובריים hematopoietic (HSC). בין heletopoiesis שק החלמון סופי, eאבות rythromyeloid (EMP) לעורר הן erythroid תאים מיאלואידים, מקרופאגים תושב בפרט. EMP נוצרים רק בתוך שק החלמון בין E8.5 ו E10.5 ימים של פיתוח והם נודדים לכבד העובר כבר בתחילת המחזור, שם הם מתרחבים ומבדילים עד לפחות E16.5. צאצאיהם כוללים אריתרוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי תורן, אך רק מקרופאגים שמקורם ב- EMP נמשכים עד לבגרות ברקמות. אופי חולף של הופעת EMP ואת חפיפה הזמני עם הדור HSC הופך ניתוח של אבות אלה קשה. הקמנו טמוקסיפן- inducible מיפוי פרוטוקול מיפוי מבוסס על ביטוי של מקרופא ציטוקין קולטן Csf1r האמרגן לאפיין EMP ו EMP הנגזרות תאים in vivo על ידי cytometry הזרימה.

מבוא

ישנם מספר גלים רצופים אך חופפים של אבות hematopoietic במהלך התפתחות הצאצאים myeloid להישאר בבגרות. ראשית, אבות "פרימיטיביים" יוצאי דופן מופיעים בשק החלמון העכבר 1 , 2 בין E7.5-E8.25 ו להוליד מקרופאגים עובריים ללא כל ביניים monocytic. אם מקרופאגים נגזר אבות פרימיטיביים להתמיד במוח המבוגר כמו microglia נשאר נושא של חקירה פעילה. שנית, Erythro-Myeloid מבשרי (EMPs) להתעורר בשק החלמון ב E8.5, להיכנס למחזור הדם ליישב את העובר. EMPs לצאת מתוך האנדותל hemogenic שק חלמון במעבר האנדותל ל- hematopoietic Runx1 תלויי 3 , 4 . בעוד EMP יכול להבדיל לתוך מקרופאגים בתוך שק החלמון, הם גם ליישב את הכבד עוברית מיום עובריים (E) 9 5 ו differentenTiate לתוך erythrocytes, megakaryocytes, מקרופאגים, מונוציטים גרנולוציטים ותאי התורן 6 . מקרופאגים הנובעים EMPs התערוכה קיבולת השגשוג ברקמות התפתחותיות ומבוגרים. אם מקרופאגים נגזרות EMP לעקוף את השלב מונוציטים של בידול עדיין שנוי במחלוקת כמו מעט מאוד ידוע על מסלול ההבחנה שלהם 7 , 8 . לבסוף, תאים גזעיים ההמטופויטים (HSCs) מופיעים ב E10.5 בתוך העובר הנכון מאזור אבי העורקים- gonad-mesonephros ו נודדים לכבד העובר. HSCs עם יכולת repopulation לטווח ארוך מזוהים רק לאחר E11 (על הבמה זוג 42 somite) 9 . שם הם מתפשטים ומבדילים בין E12.5 עד שהמטופויזיס המוחלט מתחיל לעבור למוח העצם, אשר הופך להיות האתר השולט של ייצור תאי הדם למשך החיים שלאחר הלידה 10 .

את spAtial ו חפיפה זמנית בהופעתה, כמו גם סמנים immuno-phenotypic משותף יש עד כה הפריע ביכולתנו להבחין התרומות הספציפיות של גלים אלה של אבות hematopoietic עובריים. בעוד ששניהם EMP ו- HSC נוצרים באופן תלוי ב- Runx1 ומבטאים את גורם התעתוק Myb ואת מקדם גדילה Csf1r (קולוני-מגרה פקטור 1 קולטן, הידוע גם בשם מקרופאג קולוני מגרה פקטור קולטן) בין היתר, EMPs ניתן להבחין HSCs על ידי היעדר הפוטנציאל הלימפה, הן במבחנה והן in vivo , חוסר שלהם לטווח ארוך repopulating פוטנציאל וחוסר ביטוי פני השטח של השושלת סמן Sca-1 11 . מודלים מיפוי גורל גנטי נדרשים לאפיין ontogenny מקרופאג שכן הם מאפשרים מיקוד אבות עובריים באופן ספציפי תא ספציפי זמן. כאן אנו מציגים את פרוטוקול מיפוי הגורל המשמש במעבדה שלנו כדי להפלות בין שני השושלתS של מקרופאגים נמצא רוב הרקמות למבוגרים: HSC הנגזר מקרופאגים מקרופאגים תושב עצמאי HSC.

מקרופאגים תושב רקמות כבר נעוצים תאים מבשר מייב עצמאית להביע את הקולטן ציטוקינים Csf1r 12 ו נמצאים העובר ב E8.5-E10.5 באמצעות שלוש משלימות גורל מיפוי אסטרטגיות 6 . כדי ללמוד hematopoiesis שקית חלמון ללא תיוג HSCs עוברי, אנו משתמשים זן מהונדס, Csf1r MeriCreMer , להביע חלבון היתוך טמוקסיפן- inducible של recombinase "משופר" Cre ושני קולטנים אסטרוגן העכבר (Mer-iCre-Mer) תחת שליטה של את Csf1r האמרגן. לפיכך, recombinase Cre יהיה פעיל בתאים Csf1r -expressing במהלך חלון זמן מוגבל. כאשר נעשה שימוש עם זן כתב המכיל חלבון פלואורסצנטי במורד של קוקס lox-stox-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), זה יוביל את הקבועתיוג גנטי של התאים הנוכחים בזמן אינדוקציה, אלא גם של צאצאיהם. מינהל ב- E8.5 של הצורה הפעילה של טמוקסיפן, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), תוויות EMPs ומקרופאגים, ללא תיוג של חלמון שן "אבות פרימיטיביים" חסרי אונים או HSCs עוברית. בכך, יש לנו אפיינו את אימונופנוטיפ של EMPs וצאצאיהם במהלך ההתפתחות העוברית, כמו גם להעריך את תרומתו של מקרופאגים שק חלץ נגזר לבריכות macrophage מבוגר. עבודה נוספת נדרשת לאפיין אם מקרופאגים נגזרים פרימיטיביים אב מתויגים גם באמצעות גישה זו והאם הם יכולים לתרום בריכות מקרופאג מבוגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נהלי בעלי חיים בוצעו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימושים מוסדיים של מכון פסטר (CETEA).

1. ב Utero דופק תיוג ב Csf1r MeriCreMer רוזה LSL-YFP עוברים

  1. הכן את הפתרון המניות של 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 מ"ג / מ"ל).
    1. תחת fumehood, לפתוח את בקבוקון 25 מ"ג של OH-TAM ולהוסיף 250 אתנול μL (100%).
    2. מעבירים את הפתרון OH-TAM לצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם קצה חתוך וורטקס במהירות מקסימלית במשך 10 דקות.
    3. Sonicate 30 דקות אמבטיה sonicator.
    4. הוסף 250 μL של שמן קיק PEG-35 תחת fumehood כדי לקבל פתרון מניות 50 מ"ג / מ"ל.
      הערה: שמן קיק PEG-35 הוא ממס עם תכונות amphiphilic שקושר מולקולות הידרופובי solubilizes אותם ממיסים מימיים.
    5. וורטקס כ 5 דקותבמהירות מקסימלית sonicate 30 דקות אמבטיה sonicator.
    6. Aliquot 90 μL (4.5 מ"ג) לכל צינור microcentrifuge (1 aliquot לכל זריקה).
    7. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע 1 או ב -20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך כפי שתואר לעיל 13 .
  2. הכן את הפתרון המניות של פרוגסטרון (10 מ"ג / מ"ל)
    1. הוסף 250 μL של אתנול 100% ל 25 מ"ג של פרוגסטרון להכין 10 מ"ג / 100 ההשעיה μL תחת fumehood. וורטקס בעדינות.
    2. הוסף 2250 μL שמן חמניות autoclaved לעשות פתרון 10 מ"ג / מ"ל ​​פרוגסטרון מתחת למכסה המנוע.
    3. וורטקס כ 5 דקות במהירות מקסימלית, aliquot ו חנות ב 4 ° C. שים לב שהפתרון ברור כאשר מאוחסן.
  3. טמוקסיפן
    הערה: התפתחות עובריים נאמדה בהתחשב ביום היווצרות תקע הנרתיק כמו יום עובריים (E) 0.5. רקומבינציה הוא המושרה על ידי הזרקת יחיד ב E8.5להריון בהריון Csf1r MeriCreMer נקבות 12 . תוסף OH-TAM עם 37.5 מיקרוגרם לכל גרם של פרוגסטרון כדי להפחית את שיעורי ההפלה לאחר הממשל טמוקסיפן. להזריק בשעה 13 (עבור הנרתיק תקע נצפו בבוקר).
    1. בבוקר הזרקת, sonicate aliquot של פתרון OH-TAM במשך 10 דקות (או עד resuspended לחלוטין).
    2. הוסף 360 μL NaCl 0.9% תחת fumehood להשיג 10 מ"ג / מ"ל ​​פתרון OH-TAM ו מערבולת ביסודיות. Sonicate עד הפתרון ברור לחלוטין resuspended (לפחות 30 דקות).
    3. טרום חם פרוגסטרון לטמפרטורת החדר.
    4. מערבבים 450 μL של OH-TAM ו 225 μL של פרוגסטרון בצינור microcentrifuge. מְעַרבּוֹלֶת.
    5. Sonicate לפחות 10 דקות לטעון על מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G.
    6. במתקן החיות, לשקול את ההריון הנשי ( Csf1r MeriCreMer הנקבות נמצאים רקע גנטי FVB inbred ו טיפוסי לשקול betweEn 25 ו 33 גרם).
    7. בצע הזרקת תוך צפצפה על ידי הזרקת לאט את נפח מחושב לתוך העכבר. לאחר משיכת המחט, לחץ בעדינות על הפצע לנקב ועסה את הבטן כדי להפיץ את OH-TAM.
      הערה: מינון ההזרקה של OH-TAM הוא 75 מ"ג לק"ג, והמינון של פרוגסטרון הוא 37.5 מ"ג לק"ג. טבלה 1 מספקת את נפח להזריק לתוך הנקבות בהריון.
משקל עכבר (g) נפח הכולל להזריק מתערובת (μL)
25 281
26 292
27 303
28 315
29 326
30 338
31 348
32 360
33 371
34 382
35 394

טבלה 1: נפח הזרקה של 4-OH-tamoxifen (OH-TAM). נפח נדרש זריקה אחת ב E8.5 של 75 מיקרוגרם לכל גרם (משקל גוף) של OH-TAM בתוספת 37.5 מיקרוגרם לכל גרם של פרוגסטרון.

2. Dissection של חלמון Sac (YS) ו עוברית כבד (FL)

הערה: טכניקות סטריליות קפדניות אינם נחוצים כאשר מניפולציה עוברים, אלא אם הם הולכים לשמש לתרבות לטווח ארוך. עם זאת, אזור העבודה חייב להיות נקי ומכוסה בנייר מתחת לנייר סופג.

  1. הכן פוספט קר כקרח שנאגרו מלוחים (PBS) ו עיכול לערבב (PBS המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​collagenase D, 100 U / מ"ל ​​Deoxyribonuclease אני (DNase I) ו 3% בסרום שור עוברית).
  2. להקריב נקבות בהריון על ידי קרנקע ויקלי ביום ההיריון הנדרש ( למשל שלב עוברי E10.5).
  3. צבוט את העור רק מעל איברי המין ולעשות חתך קטן על קו האמצע עם מספריים. משוך את העור לעבר הראש כדי לחשוף לחלוטין את קיר הגוף ללא פרווה. חותכים את שרירי הבטן כדי לחשוף את האיברים הפנימיים לדחוף את המעיים לחשוף את שתי הקרניים הרחם.
  4. עם מלקחיים בוטה בגודל בינוני, לתפוס את כרית שומן המצורפת השחלה בעדינות למשוך את הרחם. גזור ברמה הצווארית של קרניים הרחם ולהרים את הקרניים מהחלל הצפק. הסר את פנקס השומן כדי לשחרר לחלוטין את קרניים הרחם לחתוך את הקרניים מן השחלה בכל צד.
  5. שים את הקרניים לתוך קר כקרח PBS בצלחת 10 מ"מ פטרי. במהירות אחיזה בשכבות הרחם בשריר בקצה אחד (סוף צוואר הרחם) ולהחליק מספריים בסדר בין שכבת השריר לבין הרקמה הדקודית כדי לשחרר את העוברים עם הרקמה הדקודית המקיפה.
    הערה: שרירים נוטים להתכווץ במהירות afteR החילוץ, כך שלב זה חייב להיות מהיר ככל האפשר.
  6. השתמש זוג אחד של מלקחיים בסדר לחתוך את הקרום של רייכרט ואת השליה.
  7. בעדינות להסיר את שק החלמון ומניחים אותו 24-רקמה צלחת תרבות עם 0.5 מ"ל של עיכול לערבב.
    הערה: בשלב זה, דם עובריים ניתן לאסוף.
    1. מיד לאחר ניתוק כלי הטבור וויטלין, להעביר את העובר לתוך צלחת 12-רקמה תרבותית המכילה 10 מ"מ קר כקרח ethylenediaminetetraacetic (EDTA). לערוף את העובר באמצעות מספריים יפים חדים, מנסה להגביל ככל האפשר ריסוס רקמות אפשרי. לדגור על הקרח 10-15 דקות ולאסוף את EDTA המכיל את הדם.
  8. הסר את amnion המקיף את העובר.
  9. עבור שלבים
  10. חותכים את הראש של העובר אותנוIng מלקחיים או מספריים בסדר. מעבירים את הראש לצלחת 24 גם עם תערובת העיכול 0.5 מ"ל.
    הערה: neuroectoderm והמוח בשלבים מאוחרים יותר גזור נוספת עבור ניתוח cytometry זרימה; להסיר בזהירות את מקלעת כלי הדם שמסביב.
  11. חותכים את העובר מעל hindlimb ולהסיר את forelimbs.
  12. כדי לבודד את הכבד, לפתוח את בית החזה באמצעות זוג מלקחיים בסדר. צבוט הקדמי אל הלב בעדינות למשוך תוך שימוש במלקחיים השני לשחרר את האיברים מהגוף.
    1. בזהירות להפריד את הכבד עוברית מהלב ומעיים. מעבירים את הכבד עוברית לצלחת 24 גם עם תערובת 0.5 מ"ל עיכול. בזהירות לעקוב אחר ההעברה תחת מיקרוסקופ לנתח.
  13. איסוף אזור הזנב (או כל חלק אחר העובר) עבור genotyping על ידי assay תגובה שרשרת פולימראז (PCR).
    הערה: רקמות ואיברים אחרים ניתן לקצור מן העוברים E10.5 לניתוח דומה באמצעות cytometry הזרימה. דם, סקי ראשN, אבי העורקים- gonad-mesonephros אזור (AGM), הלב neuroectoderm ניתן לאסוף ב E10.5. בשלבים מאוחרים יותר, ריאות, כליות, טחול ולבלב ניתן גם לאסוף. תיאור מפורט של דיסקציה של AGM בשלבים התפתחותיים שונים תוארה בעבר 14 .

3. עיבוד של רקמות עובריים עבור זרימת cytometry

  1. דגירה האיברים (ממוקם בתערובת העיכול) במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  2. מעבירים את הרקמה פתרון אנזימטי על מסננת 100 מיקרומטר להציב צלחת 6-רקמת רקמה מלא 6 מ"ל של חיץ FACS (0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו 2 מ"מ EDTA ב 1x PBS). ניתוק מכני על ידי רסיסים בעדינות עם בוכנה גומי שחור של מזרק 2 מ"ל להשיג ההשעיה תא בודד.
    הערה: מעתה והלאה, כל השלבים צריכים להתבצע ב 4 ° C.
  3. איסוף ההשעיה התא עם פיפטה פסטר ולהעביר לתוך צינור 15 מ"ל.
  4. ספיN עבור 7 דקות ב 320 xg ב 4 ° C. מחק את supernatant על ידי שאיפה.
  5. Resuspend גלולה ב 60 μL חיץ FC חסימת (CD16 / CD32 חסימת נוגדן בדילול 1/50 במאגר FACS).
    1. העברת 50 μL ההשעיה תא בודד לכל היטב בתחתית עגול 96 צלחת רב רב. דגירה של לפחות 15 דקות על הקרח.
      הערה: מכתים יכול להתבצע גם 5 צינורות פוליסטירן מ"ל פוליסטירן בעת ​​טיפול במספר קטן של דגימות.
    2. מעבירים את 10 μL הנותרים לתוך צינור FACS 5 מ"ל פוליסטירן כדי לקבל מאגר של דגימות מכל רקמה. בריכה זו תשמש את הפקדים ( כלומר דגימות לא מוכחות ופלורסנט מינוס אחד (FMO) שולטת עבור כל fluorochrome). העברת 50 μL של הבריכה עבור כל פלואורסצנט מינוס אחד (FMO) שליטה (אחד לכל fluorochrome) על צלחת 96 רב.
      הערה: כל בקרת FMO מכילה את כל הנוגדנים מצמידים לפלואורוכרום מחלונית הנוגדן, למעט אחדכי הוא נמדד. FMOs משמשים לזיהוי גבולות השער ולשליטה על החפיפה הספקטראלית בחלוניות צבעוניות. כדי לטפל כראוי את וריאציות רקע autofluorescence בין רקמות שונות, חשוב להכין את הפקדים האלה מן הבריכה של דגימות של כל רקמה. השליטה המתאימה ביטוי YFP יהיה דגימות של עוברי Cre- שלילי, אשר אושרו על ידי גנוטיפינג PCR.

4. משטח אנטיגן מכתים

  1. הכן את תערובת הנוגדנים במאגר FACS (טבלה 2). הכן 50 μL של תערובת נוגדנים למדגם.
    1. השתמש נוגדנים הבאים fluorochrome מצמידים: אנטי CD45.2 (שיבוט 104); Anti-CD11b (משכפל M1 / ​​70); אנטי F4 / 80 (לשכפל BM8); Anti-AA4.1 (משוחזר AA4.1); אנטי קיט (שיבוט 2B8); ו נגד Ter119 (שיבוט Ter119).
    2. הכן שש תערובות נוגדן עבור פקדי FMO במאגר FACS. הכן 50 μL של תערובת נוגדן למדגם שליטה.
      לאTE: דילול הנוגדנים בתערובת הנוגדנים מרוכז פי שניים מאשר הריכוז הסופי המצוין בטבלת החומרים. עבור פאנל עם שישה נוגדנים מצמידים fluorochrome, 6 פקדים FMO מוכנים. טבלה 2 מספקת את הרכב תערובת הנוגדנים ובקרות FMO עבור צינור אחד.
נפח (μL) של נוגדן (נפח סופי 50 μL)
נוֹגְדָן שיבוט תערובת נוגדן FMO CD45.2 FMO CD11b FMO F4 / 80 FMO AA4.1 ערכת FMO FM119
אנטי CD45.2 104 1 0 1 1 1 1 1
אנטי CD11b M1 / 70 0.5 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5
אנטי F4 / 80 BM8 1 1 1 0 1 1 1
אנטי AA4.1 AA4.1 1 1 1 1 0 1 1
אנטי קיט 2 ב 8 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.5
נגד Ter119 Ter119 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0
חיץ FACS 45.5 46.5 52 46.5 46.5 52 52

.within-page = "1"> טבלה 2: נפח נוגדנים באמצעות מכתים ופלורסנט מינוס אחד (FMO) שולטת. נפח (μL) של נוגדן נדרש נפח סופי של 50 μL.

  1. הוסף 50 μL של תערובת נוגדן לדגימות בצלחת 96-multiwell (נפח סופי במהלך מכתים הוא 100 μL). בעדינות פיפטה למעלה ולמטה פעמיים דגירה על קרח במשך 30 דקות.
  2. ספין את צלחת 96-multiwell במשך 7 דקות ב 320 xg ב 4 ° C וזורקים את supernatant. Resuspend μL 200 של חיץ FACS.
  3. חזור על הליך לשטוף (שלב 4.3) פעמיים עם 150 חיץ FACS μL.
  4. סנן את הדגימות ואת הפקדים (FMOs ודגימות הבריכה בלא כתם) לתוך 5 צינורות קלקר מ"ל דרך מסננת 70 מיקרומטר. חנות על הקרח עד הרכישה.

5. זיהוי EMPs ו YS הנגזרות מקרופאגים על ידי זרימת cytometry

הערה: פרוטוקול זה היה מותאם באמצעות זרם לייזר 4 cytometer זרימהUipped עם 405 ננומטר לייזר ויולט, לייזר 488 ננומטר כחול, 562 ננומטר לייזר צהוב ו 638 ננומטר לייזר אדום.

  1. הכן חרוזים פיצוי עבור כל נוגדנים מצמידים בהתאם להוראות היצרן. השתמש דגימות בלא כתם חרוזים פיצוי כדי לייעל את עוצמות לייזר.
  2. כדי לזהות גבולות השער, להשתמש FMO (פלואורסצנציה מינוס אחד) שולטת עבור כל נוגדנים.
  3. על מנת להוציא תאים מתים, להוסיף 1 μL של DAPI (1 מ"ג / מ"ל) לצינור (המכיל 200 μL ההשעיה תא מוכתם) 1 דקות לפני הרכישה. השתמש אות חזק DAPI ופרמטר קדימה מפוזרים (FSC) לבצע הרחקה של תאים מתים ופסולת.
    הערה: השתמש בתוכנה מן cytometer זרימת לצייר שערים במהלך הרכישה. פיצוי מטריקס וניתוח ניתן לבצע לאחר רכישת מדגם באמצעות תוכנות אחרות זמינים מסחרית.
  4. השתמש קדימה ופיזור בצד (FSC לעומת SSC) לבצע תא חי ופליה אפלטון מכל האירועים.
  5. יצירת נקודות פלואורסצנציה נקודות בוגר בקנה מידה יומן לצייר שערי הבת, ראשית, להוציא אריתרוציטים (Ter119 + ) ולאחר מכן, לזהות תאים אב (Kit + ) ותאי hematopoietic (CD45 + Kit Neg ) (ראה איור 1 ).
  6. יצירת היסטוגרמות פלואורסצנטי לכמת את יעילות תיוג של YFP בקרב אוכלוסיות מזוהה שונים YS ( איור 2 ), הכבד עוברית ( איור 3 ) ואת המוח ( איור 4 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מיפוי גורל גנטי הושג על ידי הממשל ב E8.5 של OH-TAM לתוך Csfrr-Mer-iCre-Mer נשים מזדווגות עם גברים נושאת כתב Rosa26-LSL-eYFP. בנוכחות OH-TAM, כריתה של קסטה להפסיק מוביל הביטוי הקבוע של YFP בתאים המבטאים Csf1r . אספנו שני רקמות hematopoietic: שק החלמון וכבד העובר ורקמה לא hematopoietic, neuroectoderm, מן העוברים ב E10.5. יחיד תא השעיות התקבלו על ידי ניתוק אנזימטי מכני דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה לאחר מכתים עם נוגדנים פלואורסצנטי מצמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גלים שונים של תאים מבשר hematopoietic חלקית חופפים בתוך מסגרת זמן קצר, מה שהופך את הניתוח של התרומה של כל גל של hematopoiesis התפתחותי לתאי החיסון מבחינה טכנית מאתגר מאוד.

טמוקסיפן- inucible Cre מערכות להציע את ההזדמנות כדי לתג תאים ספציפיים באופן זמני inducible לבצע ניתוח שושלתיות בעוברים או מבוגרים, ללא צורך vivo לשעבר או בתרבות חוץ גופית או השתלה. ב tamoxifen-inducible Cre זנים, גן היתוך נוצר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לגלות.

תודות

המחברים מודים לפרופ 'פרדריק גיסמן ופרופ' כריסטיאן שולץ על דיונים מעמיקים; ד"ר חנה גארנר לקריאה ביקורתית של כתב היד, ד"ר חאווייר מונטגוטלי וד"ר ז'אן ג'וברט ואנשי מכון החיות Institut Pasteur לתמיכה בבני אדם; ו Pascal Dardenne ו Vytaute Boreikaite, Amgen Scholar, על סיוע טכני שלהם. המחקר במעבדה EGP ממומן על ידי Institut Pasteur, CNRS, ה- Cercle FSER (FRM וחבילת פתיחה של Institut Pasteur וקונסורציום REVIVE. LI נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקונסורציום REVIVE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#5 מלקחיים ישריםכלים מדעיים עדינים11251-20
MC19 / B מספריים אביביים Pascheff-Wolff Fine Science Tools15371-92
מספריים ישרים 8.5 ס"מFine Science Tools14090-09
ערכת נגד עכבר-PE (שיבוט 2B8)BD Pharmingen5533551/200 דילול ב-FACs מאגר
נגד עכבר CD45.2 APC-Cy7 (שיבוט 104)Sony11491201/100 דילול ב-FACs מאגר
נגד עכבר AA4.1-APC (CD93, שיבוט AA4.1)eBioscience17-58921/100 דילול ב-FACs מאגר
נגד עכבר Ter119 PerCP-Cy5.5 (שיבוט Ter119)Biolegend5605121/200 דילול ב-FACs מאגר
נגד עכבר F4/80-BV421 (שיבוט BM8)BD Pharmingen1231371/100 דילול ב-FACs מאגר
נגד עכבר CD11b PE-Cy7 (שיבוט M1/70)BD Pharmingen5528501/200 דילול במאגר
FACsAnti-Mouse CD16/CD32 (עכבר BD Fc Block, שיבוט 2.4G2)BD Biosciences553142
PBS 1xFischer Scientific12559069
סרום בקר עובריפישר 11570506
קולגנאז D Roche11088882001
Deoxyribonuclease ISigmaD4527-20KU
צלחת תרבית רקמות 6 בארותDutscher Dominique353046
צלחת תרבית רקמות 12 בארותDutscher Dominique353224
צלחת תרבית רקמות 24 בארותFischer Scientific11874235
96 בארות תרבית רקמה תחתונה בצורת U צלחתDutscher Dominique353227
  מזרק פלסטיפק 2 מ"ל Dutscher Dominique300185
רשת ניילון 100 ומיקרו; מסנני תאים mDutscher Dominique352360
רשת ניילון 70 ומיקרו; מסננות תאים mDutscher Dominique352350
15 מ"ל צינורות בזDutscher Dominique352096
Stericup GP Millipore ערכת סינון, 0.2 μ mDutscher Dominique51246
סרום בקר אלבומיןסיגמאA7906-500G
(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25 מ"גסיגמאH7904-25MGיש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת הכנה ועבודה עם טמוקסיפן ונגזרותיו. השתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים
פרוגסטרוןסיגמאP3972השתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים שמן
PEG-35 (Kolliphor/Cremophor EL)SigmaC5135
שמן חמניותSigmaS5007-250ML
אתנול Sigma24103-1L-R-Dהשתמש תמיד בציוד מגן אישי מתאים והשתמש תחת אדים
EDTASigmaE9884-500G
DAPI, 1 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל במים)Fischer Scientific10116287
CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 ציטומטר זרימהבקמן קולטרB75408
CytoFLEX יומי QC פלואורוספירותבקמן קולטר B53230
ערכת חרוזים ללכידת נוגדנים של VersaComp (2x5 מ"ל)בקמן קולטר B22804
FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/Jמעבדת ג'קסון19098
B6.129X1-GT(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/Jמעבדת ג'קסון6148
קיק

מקורות

  1. Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
  2. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  3. Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
  4. Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
  5. Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
  6. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  7. Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
  8. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
  9. Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
  10. Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
  11. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  12. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  13. Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
  14. Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
  15. Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
  16. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  17. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
  18. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  19. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  20. Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Csf1rKit CD45F480 CD11b
זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.