קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

סיכום

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

תקציר

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לבדיקה קינטית של סינתזת DNA בפיגור במבחנה על ידי חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7. רפליזום T7 הוא אחת ממערכות השכפול הפשוטות ביותר הידועות, המורכבת מארבעה חלבונים בלבד, המהווה תכונה אטרקטיבית לניסויים ביוכימיים. דגש מיוחד מושם על סינתזה של פריימרים ריבונוקלאוטידים על ידי ה-T7 primase-helicase, המשמשים את DNA פולימראז ליזום סינתזת DNA. מכיוון שמנגנוני שכפול הדנ"א נשמרים לאורך האבולוציה, פרוטוקולים אלה צריכים להיות ישימים, או שימושיים כקרש קפיצה רעיוני, לחוקרים המשתמשים במערכות מודל אחרות. הפרוטוקולים המתוארים כאן רגישים ביותר וחוקר מנוסה יכול לבצע ניסויים אלה ולהשיג נתונים לניתוח תוך יממה בערך. הציוד המיוחד היחיד הנדרש הוא מכשיר זרימה מהיר, אך ציוד זה נפוץ יחסית וזמין ממקורות מסחריים שונים. עם זאת, החסרונות העיקריים של בדיקות אלה כוללים את השימוש ברדיואקטיביות ואת התפוקה הנמוכה יחסית.

מבוא

השכפול של הדנ"א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית ^1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג'ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ"א מחייב, GP2. 5) ^2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקו....

פרוטוקול

הערה: מלאו אחר כל התקנות המוסדיות לגבי השימוש הבטוח והסילוק של חומר רדיואקטיבי, לרבות אך לא רק, שימוש בציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ומגינים אקריליק מתאימים.

הערה: המאגר סטנדרטי מורכב מ -40 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 גלוטמט אשלגן מ"מ, 5 מ"מ DTT, 0.1 mM EDTA (חיץ זה שהוכן מראש בריכוז 5x) ו -0.3 מ"מ של כל dNTP. חלבונים שכפול T7 הם מטוהרים כמתואר ^{8, 9, 10.} דנ"א חד-גדילי המכיל אתר הכרה primase יחיד T7 (5'-GGGTC-3 ", 5'-GTGTC-3", 5'-TGGTC-3 &....

תוצאות

התוצאות שמוצגות באיור 1A התקבלו כמתואר בשלב 1 של הפרוטוקול, כלומר, באמצעות דגימה ידנית תגובת סינתזת פריימר מזורזת על ידי gp4 בתנאים מרובה מחזור. הנה, מגוון של מוצרים לאחר ג'ל אלקטרופורזה ניתן לצפות באמצעות CTP שכותרתו עם ³² P במיקום-α בתגובות סינתזה פריימר (איור 1 א). מבשר שכותרתו, CTP, מציגה את הניידות הגבוהה ביותר נודד לכיוון החלק התחתון של הג'ל, ואחריו מינים נודדים אי.......

דיון

הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ"מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ"מ, 1 מ"מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. לכן אנו עכשיו להקפיא פלאש aliquots קטן של gp4 מטוהרים 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 מ"מ TCEP, ו -10% גליצרול באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 ° C. בעוד השימוש .......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גבישים מוגדרים מראש של Tris pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-חומצה גלוטמית מלח אשלגן מונוהידרט	SIGMA	G1501
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
נתרן דודציל סולפט	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) חומצה טטראצטית, מלח דיסודיום, דיהידרט	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	רדיואקטיבי, לנקוט באמצעי הגנה
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	רדיואקטיבי, לנקוט באמצעי הגנה
100 מ"מ dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	ארבעה dNTPs חלק מסט
100 מ"מ ATP ו-CTP	Epicentre	RN02825	חלק מ-NTP סט
ssDNA מבני	DNA משולבות	N/A	רצפים מותאמים אישית
מתנול	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
ברומופנול כחול	SIGMA	B8026
צילין קסיאנול	סיגמא	X4126
אקרילאמיד	SIGMA	A9099	רעיל
N,N&פריים; -Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	רעיל
אוריאה	בוסטון ביופרודקטס	P-940
חומצה בורית	Mallinckrodt Chemicals	2549
מכשיר זרימה מהירה	חברת קינטק	RQF-3
קינטק אקספלורר	קינטק קורפ	לא ישים
Kaleidagraph	תוכנת סינרג'י	לא ישים

טכנולוגיות