הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55312

⸱

25 בפברואר 2017

 , 
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

תקציר

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לבדיקה קינטית של סינתזת DNA בפיגור במבחנה על ידי חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7. רפליזום T7 הוא אחת ממערכות השכפול הפשוטות ביותר הידועות, המורכבת מארבעה חלבונים בלבד, המהווה תכונה אטרקטיבית לניסויים ביוכימיים. דגש מיוחד מושם על סינתזה של פריימרים ריבונוקלאוטידים על ידי ה-T7 primase-helicase, המשמשים את DNA פולימראז ליזום סינתזת DNA. מכיוון שמנגנוני שכפול הדנ"א נשמרים לאורך האבולוציה, פרוטוקולים אלה צריכים להיות ישימים, או שימושיים כקרש קפיצה רעיוני, לחוקרים המשתמשים במערכות מודל אחרות. הפרוטוקולים המתוארים כאן רגישים ביותר וחוקר מנוסה יכול לבצע ניסויים אלה ולהשיג נתונים לניתוח תוך יממה בערך. הציוד המיוחד היחיד הנדרש הוא מכשיר זרימה מהיר, אך ציוד זה נפוץ יחסית וזמין ממקורות מסחריים שונים. עם זאת, החסרונות העיקריים של בדיקות אלה כוללים את השימוש ברדיואקטיביות ואת התפוקה הנמוכה יחסית.

מבוא

השכפול של הדנ"א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית 1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג'ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ"א מחייב, GP2. 5) 2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור את המנגנונים הביוכימיים המשומרים מעורבים שכפול הדנ"א.

דגש מיוחד מושם על היווצרות של פריימרים ribonucleotide ידי DNA T7 primase, critical צעד בייזום של סינתזה של DNA. בנוסף, אפשר גם לבחון את השימוש של פריימרים אלה על ידי פולימראז T7 DNA או חלבונים שכפולים אחרים על ידי כולל אותם לתערובת התגובה. T7 primase-helicase, gp4, מזרז היווצרות של פריימרים עבור סינתזה של DNA על רצפי DNA ספציפי הנקרא אתרי הכרה primase, או PRS, (5'-GTC-3 '). ציטוזין ב PRS הוא נסתר, זה הכרחי להכרה של האתר, אבל זה לא מועתק לתוך המוצר 3. הצעד הראשון סינתזה פריימר ידי gp4 כרוך היווצרות של dinucleotide pppAC, אשר ניתנת להארכה אז אל trimer, ובסופו של דבר פריימרים tetranucleotide פונקציונלי pppACCC, pppACCA, או pppACAC תלוי רצף בתבנית 4. פריימרים אלו לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי פולימראז T7 DNA ליזום סינתזת ה- DNA, שהוא גם תהליך 5 בסיוע gp4, 6. בהקשר זה, primaseתחום מייצב את tetraribonucleotides הקצר מאוד עם התבנית, מניעת דיסוציאציה שלהם, עוסק DNA פולימרז באופן הדרך להבטיח פריימר / תבנית לתוך פולימראז האתר פעיל 7. צעדים אלה (סינתזת פריימר RNA, handoff פריימר כדי פולימראז, ורחבה) חוזרים מחזורים רבים לשכפל הגדיל המפגר חייבים להיות מתואם עם השכפול של הגדיל המוביל.

המבחנים המתוארים כאן הם רגישים מאוד והוא יכול להתבצע בתוך מסגרת זמן מתונה. עם זאת, הם נמוכים יחסית תפוקה ו בזהירות רבה יש מבוצעת השימוש וסילוק חומרים רדיואקטיביים. תלוי במהירות שבה היא מתרחשת, אפשר להעסיק מכשיר מהיר-להרוות להשיג דגימות בסקלות הזמן נוחות עבור ניתוח משמעותי של קורסי זמן תגובה כלשהי באחד משני יציבה או במצב טרום היציב. לאחרונה, השתמשנו מבחנים המתוארים כאן כדי לספק evidencדואר לחשיבות שחרור פריימר מהתחום primase של gp4 בייזום של שברי Okazaki. בנוסף, מצאנו עדויות של תפקיד רגולטורי עבור דנ"א חד-גדילי T7 חלבון מחייב, gp2.5, בקידום היווצרות פריימר יעיל וניצול 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: מלאו אחר כל התקנות המוסדיות לגבי השימוש הבטוח והסילוק של חומר רדיואקטיבי, לרבות אך לא רק, שימוש בציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ומגינים אקריליק מתאימים.

הערה: המאגר סטנדרטי מורכב מ -40 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 גלוטמט אשלגן מ"מ, 5 מ"מ DTT, 0.1 mM EDTA (חיץ זה שהוכן מראש בריכוז 5x) ו -0.3 מ"מ של כל dNTP. חלבונים שכפול T7 הם מטוהרים כמתואר 8, 9, 10. דנ"א חד-גדילי המכיל אתר הכרה primase יחיד T7 (5'-GGGTC-3 ", 5'-GTGTC-3", 5'-TGGTC-3 ') ניתן לרכוש ממגוון רחב של חברות סינתזה DNA (אורך של ssDNA יכול להיות תלוי האנזים של בחירה עבור primase T7, pentamer הוא אורך תבנית המינימום לסנתז פריימר באורך מלא 11, כמו C הנסתר חיוני, אולם אם היה פריימר הוא תוארך פולימראז, נוקלאוטידים נוסף חייב להיות נוכח בסוף '3 של התבנית. תגובות יזומים על ידי תוספת של ריכוז סופי של 10 מ"מ MgCl 2 וטופחו על 25 מעלות צלזיוס. דגימה ידנית עובדת היטב עבור נקודות זמן של 5 שניות או יותר. אם בזמן נקודות קצרות מזו נדרשות, מומלץ להשתמש באמצעי זרימה מהיר-להרוות להשיג נתונים מדויקים.

1. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור ידי דגימה ידנית

  1. לפני תחילת הניסוי, aliquot 2 μL של חיץ לצבוע לפוראמיד (93% (V / V לפוראמיד), 50 מ"מ EDTA, 0.01% cyanol קסילן ו 0.01% bromophenol כחול) לתוך 8 1.5 צינורות פוליפרופילן מ"ל. באופן כללי, מספר צינורות שווה למספר נקודות זמן המנותח.
  2. הכינו תערובת 20 μL המורכב חיץ 1x, 0.1 מ"מ ATP ו CTP, 0.25 MCI / מ"ל [α- 32 P] CTP, 0.1 מיקרומטר SSDתבנית NA, ו -0.1 מיקרומטר gp4 (מבוטא ריכוז hexamer - 0.6 מיקרומטר מונומר).
  3. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. הסר 2 μL של התערובת באמצעות pipettor ומערבבים עם 2 μL חיץ לצבוע לפוראמיד צינור 1.5 מ"ל מוכן בשלב 1.1 עבור כל שליטה התגובה (זמן אפס).
  5. הוסף 2 μL של 0.1 M MgCl 2 לתערובת התגובה (לריכוז סופי של 10 מ"מ).
  6. באופן ידני למשוך 2 דגימות μL של תערובות התגובה באמצעות pipettor ב 10 מרווחי ים ומערבבים עם צבע לפוראמיד predispensed ב 1.5 צינורות מ"ל מוכן בשלב 1.1.
  7. דגימות מחממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך גוש חום.
  8. טען aliquots של דגימות על ג'ל denaturing. המוצרים פריימר tetraribonucleotide קטן מסונתז על ידי primase T7 נפתרות היטב על acrylamide 0.4 מ"מ עובי 25%: bisacrylamide (19: 1), 3 M אוריאה, TBE 1x (100 מ"מ טריס-borate, 1 mM EDTA).
  9. מניחים ג'ל כולו על chromatograPHY נייר ומכסים בניילון נצמד. ג'ל ניקוי באמצעות היבשים ג'ל.
  10. כן סדרת דילול של שארית תערובת התגובה ספוט באותו הנפח טעון על הג'ל על גבי נייר כרומטוגרפיה, כלומר, במקום 4 μL של הדילול אם 4 μL של מדגם הועמס.
    הערה: זה ישמש את עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז של מוצרים נוצרו במהלך התגובה. לדוגמה, פי חמישה דילולים באמצעות TE חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) עובד טוב, פורש מגוון של 1:25 עד 1: 15.625 (5 2 -5 6), אבל דילולים צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הפעילות.
  11. לחשוף ג'ל יבש רגיל באמצעות מסך phosphorimager. לכמת את הרדיואקטיביות בסדרת הדילול לבנות עקום סטנדרט כמתואר 8, 12
    הערה: הכללה של DNA פולימראז T7 לתערובת התגובה מאפשרת לאדם EXAשלי השימוש של פריימרים tetraribonucleotide ע"י אנזים זה. באופן אופטימלי, ריכוז פולימראז יש להרוות כדי לפשט את הפרשנות של הנתונים. ריכוז פולימראז של 0.4 מיקרומטר ומעלה נותן תוצאות טובות. בנוסף, ההשפעה של חלבונים אחרים, כגון חלבונים מחייב חד גדילי דנ"א, משני סינתזה פריימר או חניכה גדיל מפגרת ניתן לבדוק בדרך זו.

2. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור באמצעות מכשיר Rapid-להרוות

  1. הכנת תערובות התגובה
    1. הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 0.2 מיקרומטר hexamer gp4, 0.2 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ"מ dNTPs, 0.2 מ"מ ATP ו CTP (כולל 0.5 MCI / מ"ל [α- 32 P] CTP.
    2. הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ"מ MgCl 2.
  2. מבצע של מכשיר זרימה מהירה-להרוות
    1. הפעל ראפמכשיר זרימה id-להרוות; לאחר הופעת התפריט הראשי, הקלד 7 במקלדת המכשיר כדי להזיז את נהג המזרק לעמדת המוצא.
    2. חיץ מזרק להרחיב בעמדה "עומס".
  3. מזרקי חיץ טוען
    1. צרף חוצץ המכיל מזרק 10 מ"ל לנמל מזרק הכונן. שינוי מיקום ידית מזרק כדי "לטעון".
    2. באמצעות 10 מזרקים מ"ל, למלא מאגר חיץ מכשיר ו- B עם 10 מ"מ טריס, pH 7.5, 1 mM EDTA ולמלא מזרק C עם פתרון להרוות (250 מ"מ EDTA, ו -0.2% SDS). הסר בועות אוויר על ידי דחיפת בוכנות פנימה והחוצה.
    3. ידית שינוי עמדות "אש". סוג 2 כדי לשנות את מיקום של בר נהג מזרק. לחץ "להתאים DOWN" על מנת להקטין את המזרק עד חיץ יוצא לולאת היציאה: (7-יורדים ברציפות; צעד גדול 8 למטה; 9-קטן צעד למטה). הקלד "ESC" כדי לחזור לתפריט הראשי.
  4. צינורות Wash
    1. עו"דאח היציאה בתור ואקום. שנת ידיות מדגם "סומק". מזרק חיץ לסגור על ידי קביעת הידיות למצב האופקי. הפעל ואקום לטבול 2 לולאות הסומק H 2 O עבור 10 s, ואז לטבול MeOH במשך 10 שניות. ניקוי לולאות ידי מציצת אוויר עבור ~ 15 שניות, או עד יבש.
  5. דגימות טוענים
    1. מיקום ידית מדגם שנה "עומס". מניחים פתרון לתוך מזרק 1 מ"ל. חבר מזרק לתוך לאחת מיציאות עומס המדגם. חזור על הפעולה עבור פתרון B, ומניחים בנמל עומס מדגם ההפך.
  6. אוסף של נקודות זמן
    1. בתפריט הראשי, מסוג 1 לריצה להרוות-זרימה. זן זמן תגובה (ים) ולחץ "ENTER". מספר לולאת התגובה להשתמש יוצג. Switch to לולאת תגובה הנדרשת. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4.
    2. הפעל מדגם ידיות "לטעון". תגובה טען מתערבבת לולאות מדגם עד ממש מחוץ לתא הערבוב המרכזי. הפעל את כל הכפתורים כדי "FIRE ". מוודא שכל הכפתורים נמצאים בעמדה הנכונה.
    3. מניח 1.5 מיליליטר מתחנת רכבת תחתי לתוך סוף לולאת יציאה. לחץ "GO" כדי להפעיל את התגובה. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. מזרקי חיץ רענן A ו- B עד שהם להכות את הנהג.
    4. חזרו על שלבי 2.2.6.2-2.2.6.3 עבור כל נקודת זמן רצויה. יוצא מן הכלל: אל תטען תמיסה המכילה מגיב ההתחלה (כלומר, MgCl 2 במקרה זה) כאשר מרווה השליטה אפס זמן נקודות.
    5. בסיום איסוף דגימות, הזן "ESC" כדי לחזור לתפריט הראשי. לחץ "7" כדי לחזור נהג מזרק חיץ לעמדת המוצא שלה.
  7. מכשיר לניקוי
    1. סור מזרקי תערובת תגובה. הפעל ידית טעינה מדגם למצב "עומס". תחת ואקום, לשטוף כל לולאה המדגם עם 10 מ"ל 0.2 N NaOH, ואחריו 10 מ"ל 0.3 NH 3 PO 4 ו -10 מ"ל MeOH.
    2. הפעל ידיות מזרק למצב "עומס". לחץ כלפי מטה על כל 3 SYRבוכנות אינגה לאחזר מאגרי תגובה להרוות. לשטוף מזרקים עם 5 מ"ל H 2 O לפחות פעמיים.
    3. מלאו מזרקים שוב עם 5 מ"ל H 2 O ולהפוך ידיות למצב "אש". שינוי עמדות כפתור ולהדליק ואקום כדי להסיר H 2 O. Flush כמו בשלב 2.2.4. כבה המכשיר.
      הערה: מוצרים מנותחים כמתואר בשלבים 1.7-1.12. בנוסף, DNA פולימרז T7 וחלבונים שכפול אחרים ניתן להוסיף לתערובת התגובה לנתח את השפעתם על סינתזה פריימר או הרחבה.

3. תגובת סינתזת פריימר חד מחזור

הערה: סינתזת פריימר חד מחזור / מבחני הרחבה מתבצעים באופן דומה לתגובות מרובה-מחזור, עם הבדלים גדולים כמה: מבחנים אלה בצעו את ההמרה של ה- ATP רדיואקטיבי לתוך מוצרים פריימר או רחבה, אולם ריכוז המצעים וחלבונים הם consideraבליי גבוה. בנוסף, על מנת להשיג ברזולוציה אלפית השנייה כדי לאפשר ניתוח של סינתזת התגובה פריימר, אחד חייב לנצל מכונת זרימה מהירה-להרוות.

  1. הכנת תערובות תגובה.
    1. הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 3 מיקרומטר hexamer gp4, 6 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ"מ dNTPs, 1 מ"מ CTP, ו -2 ננומטר [γ- 32 P] ATP. הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ"מ MgCl 2.
  2. מבצע זרימה מהיר-להרוות
    1. לבצע תגובות כמתוארות בשלב 2.2. אם תרצה בכך, להוסיף פולימראז T7 DNA או T7 חד גדילי ה- DNA חלבון מחייב בריכוז של 15 מיקרומטר ו 20 מיקרומטר, בהתאמה. במקרה זה, את המוצרים הרחבים להצטבר משטר זמן המאפשר דגימה ידנית של התגובה.

ניתוח 4. נתונים

  1. עקומות התקדמות מוצר לנכונות שאינו ליניארי least-מודלי ריבועים באמצעות תוכנה זמינה מסחרי מסוגלים ריבועים לפחות מתאימים ו / או אינטגרציה נומרית. הפרטים של המבצע ישתנו עם התוכנה מועסקת, אך להלן צורות כלליות של משוואות המשמשות התאמת הנתונים.
  2. קבע את קצב היווצרות התוצר של תגובות סינתזת פריימר מספר המחזור ידי ההתאמה להתקדם עקומות למשוואה ליניארית. אם יש עיקום ניכר, השתמש בשיטת שיעורו הראשונית 13, 14 על ידי התאמת הנתונים לפונקציה יחידה מעריכים: y = A (e - t k), כאשר y הוא ריכוז המוצר, A היא משרעת התגובה, k הוא הקבוע לקצב המהיר שנמדד בטלסקופים, t הוא הזמן, בשניות. השיפוע של המשיק בשלב = 0 הוא השיעור הראשוני.
    הערה: Fit טרום יציב תגובות סינתזת פריימר מדינת משוואה ליניארית או למשוואה טרום יציבה פרץ מדינת Y = A (e - k buהראשון t) + שיעור ss t, כאשר A הוא משרעת התגובה, פרץ k הוא קבוע קצב ציין עבור פרץ במצב טרום יציב, ss השיעור הוא ss שיעור היציב = חתול k [אנזים]), t הוא הזמן , בשניות. התאם תגובות סינתזת פריימר חד מחזור להתקדם עקומות על יחיד מעריכי פונקציה y = A (ה - k t). במקרה של gp4, להתאים את הנתונים על ידי אינטגרציה נומרית 15, למודל עם שלושה שלבי עיבוי NTP, כאשר כל ביניים נמצאים בשיווי משקל עם האנזים, באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות שמוצגות באיור 1A התקבלו כמתואר בשלב 1 של הפרוטוקול, כלומר, באמצעות דגימה ידנית תגובת סינתזת פריימר מזורזת על ידי gp4 בתנאים מרובה מחזור. הנה, מגוון של מוצרים לאחר ג'ל אלקטרופורזה ניתן לצפות באמצעות CTP שכותרתו עם 32 P במיקום-α בתגובות סינתזה פריימר (איור 1 א). מבשר שכותרתו, CTP, מציגה את הניידות הגבוהה ביותר נודד לכיוון החלק התחתון של הג'ל, ואחריו מינים נודדים אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ"מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ"מ, 1 מ"מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. לכן אנו עכשיו להקפיא פלאש aliquots קטן של gp4 מטוהרים 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 מ"מ TCEP, ו -10% גליצרול באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 ° C. בעוד השימוש ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת C.C.R. על ההערות ול-S. Moskowitz על הכנת האיורים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים למענקי בריאות F32GM101761 (A.J.H.) ו-GM54397 (C.C.R).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גבישים מוגדרים מראש של Tris
pH 7.5		SIGMAT4128
Tris baseSIGMA93362
L-חומצה גלוטמית מלח אשלגן מונוהידרטSIGMAG1501 
מגנזיום כלוריד הקסהידרטMallinckrodt Chemicals5958-04
1,4-DithiothreitolJ.T. BakerF780-02
נתרן דודציל סולפטMP Biomedicals811030
(Ethylenedinitrilo) חומצה טטראצטית, מלח דיסודיום, דיהידרטMallinckrodt Chemicals4931-04
[α-32P] CTPPerkinElmerBLU508Hרדיואקטיבי, לנקוט באמצעי הגנה
[γ-32P] ATPPerkinElmerBLU502Aרדיואקטיבי, לנקוט באמצעי הגנה
100 מ"מ dATP, dCTP, dGTP, dTTP Affymetrix77100ארבעה dNTPs חלק מסט
100 מ"מ ATP ו-CTPEpicentreRN02825חלק מ-NTP סט
ssDNA מבניDNA משולבותN/Aרצפים מותאמים אישית 
מתנול Macron Fine Chemicals3017-08
formamideThermo Scientific17899
ברומופנול כחולSIGMAB8026 
צילין קסיאנול סיגמאX4126 
אקרילאמידSIGMAA9099רעיל
N,N&פריים; -MethylenebisacrylamideSIGMAM7279 רעיל
אוריאהבוסטון ביופרודקטסP-940
חומצה בוריתMallinckrodt Chemicals2549
מכשיר זרימה מהירה חברת קינטקRQF-3 
קינטק אקספלוררקינטק קורפלא ישים
Kaleidagraph תוכנת סינרג'ילא ישים
טכנולוגיות

מקורות

  1. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
  2. Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
  3. Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
  4. Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
  5. Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
  6. Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
  7. Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
  8. Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
  9. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  10. Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
  11. Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
  12. Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
  13. Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658(2013).
  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Rapid quench FlowT7 Primase helicaseDNASingle turnover
קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.