מאמר שיטה

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

DOI:

10.3791/55315

⸱

14 באפריל 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilium העיקרי הוא גורם קריטי ב התפשטות תאים ובתאים עצבית, בידול עצבי, ואת תפקוד עצבי בוגרת. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד ciliogenesis וסחר איתות חלבונים כדי ריסים בתאי גזע / ובתאים עצביים נוירונים בדיל באמצעות תרבויות neurosphere עיקריות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסיליום הראשוני חשוב באופן בסיסי לשגשוג תאי גזע/אב עצביים ולהתמיינות עצבית במהלך החיים העובריים, לאחר הלידה והבוגרים. בנוסף, לרוב הנוירונים המובחנים יש ריסים ראשוניים המכילים קולטני איתות, כגון קולטנים מצומדים לחלבון G, ומולקולות איתות, כגון אדניליל ציקלאזות. הסיליום הראשוני קובע את פעילותם של מסלולי התפתחות מרובים, כולל מסלול הקיפוד הקולי במהלך ההתפתחות העצבית העוברית, ומתפקד גם בקידום איתות תת-תאי ממודר במהלך תפקוד עצבי בוגר. באופן לא מפתיע, פגמים בביוגנזה ובתפקוד ראשוניים של ריסים נקשרו לחריגות התפתחותיות של המוח, השמנת יתר מרכזית וליקויי למידה וזיכרון. לפיכך, הכרחי לחקור ביוגנזה ראשונית של ריסים וסחר ריסים בהקשר של תאי גזע/אב עצביים ונוירונים מובחנים. עם זאת, שיטות תרבית לתאי עצב ראשוניים דורשות מומחיות רבה ואינן ניתנות למחזורי הקפאה-הפשרה. בפרוטוקול זה, אנו דנים בשיטות תרבית עבור אוכלוסיות מעורבות של תאי גזע/אב עצביים באמצעות נוירוספרות ראשוניות. שיטות התרבות המבוססות על נוירוספרה מספקות את היתרונות המשולבים של חקר תאי גזע / אב עצביים ראשוניים: התאמה למעברים מרובים ומחזורי הקפאה-הפשרה, פוטנציאל התמיינות לנוירונים/גליה, ויכולת טרנספקטיביות. חשוב לציין, קבענו שתאי גזע/אב עצביים שמקורם בנוירוספירה ונוירונים מובחנים ריסניים בתרבית וממקמים מולקולות איתות הרלוונטיות לתפקוד הריסי בתאים אלה. תוך שימוש בתרבויות אלה, אנו מתארים עוד שיטות לחקר ריסים וסחר ריסים בתאי גזע/אב עצביים ונוירונים מובחנים. שיטות מבוססות נוירוספירה אלה מאפשרות לנו לחקור מסלולים תאיים המווסתים על ידי ריסים, כולל קולטן מצומד לחלבון G ואיתות קיפוד קולי, בהקשר של תאי גזע/אב עצביים ונוירונים מובחנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilium העיקרי הוא תא התת-תאי דינמי המבוסס microtubule שמתפקד אנטנה חושית בתיאום מסלולי איתות הסלולר, כולל סוניק הקיפוד (ששש) מסלול במהלך ההתפתחות העצבית עובריים 1, 2, ו איתות התת-תאי ממודרת פונקציה 3 העצבית מבוגר, 4 . איתות רכיבים של מסלולים אלה, כגון קולטן ששש טלוא 5; מסלול מפעיל smoothened (SMO) 6; ו Gpr161 7, גידול G יתום חלבון בשילוב קולטן (GPCR) כי באופן שלילי מסדיר את מסלול ששש, למקם את הריסים באופן דינמי. GPCRs המרובה דווח למקם את הריסים בנוירונים במוח 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. פגמי ריסי מסלולי איתות שנוצר ריסים להשפיע רקמות מרובות נקראים ביחד כמו ciliopathies 17, 18, 19. הספקטרום המחלה ciliopathy קרובות כולל ליקויים נוירו-התפתחותיות, כגון הפרעות craniofacial 20, 21, 22. בנוסף, cilia העיקרי בנוירונים ההיפותלמוס לווסת מסלולי שובע מרכזיים, ופגמים לגרום להשמנה מרכזית 23, שיקוף השמנת ciliopathies syndromic כגון תסמונת Bardet Biedel 24. בנוסף, קולטן ונוירופפטידים איתות הריסים מסדיר centrשובע אל מסלולי 11, 14. לוקליזציה ריסי adenylyl cyclase III (ACIII) ו GPCRs כגון קולטן סומטוסטטין 3 ב נוירונים בהיפוקמפוס לגרום למומים זיהוי האובייקט הרומן וגירעונות זיכרון 25, 26 ו- Parallels חוסר שלמות ריסי 27. היבטים התפתחותיים של איתות שנוצר הריסים קשורות בטבורן הומאוסטזיס רקמות; בפרט, הריסים חשובים להתקדמות ומדולובלסטומות ששש-תת הנובעים אבות גרגיר של 28 המוחון, 29. לפיכך, cilia העיקרי ממלא תפקידים חשובים במהלך עוברית, לאחר הלידה, ואת ההתפתחות עצבית מבוגרת ותפקוד.

בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזור subventricular (SVZ) של החדר הלטרלי, אזור subgranular של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס, ואתאזור חדרית של החדר השלישי בהיפותלמוס ביונקים 30, 31, 32. NSCs הם מולטיפוטנטיים, בעלי יכולת התחדשות עצמית, והם חשובים להתפתחות המוח ורפואה רגנרטיבית 30. רוב NSCs ב SVZ הם שקטים ובעלי cilium העיקרי בודד כי, במקרים רבים, משתרע אל החדר לרוחב 33. אותות cilium העיקריים באמצעות הלוקליזציה של קולטנים שונים, להמרצת תגובה תאית במורד זרם, במיוחד ביחס ששש, TGFβ, ומסלולי טירוזין קינאז קולטן 2, 34, 35, 36. מאז cilia העיקרי להאריך לתוך החדר לרוחב, משערים כי cilia העיקרי לזהות ציטוקינים בנוזל השדרה (CSF) כדי להפעיל NSCs 37 . מחקרים אחרונים מראים כי מסלול איתות ששש ו הריסים העיקריים הם קריטיים עבור הפעלת תאי גזע של תיקון והתחדשות של רקמות מרובות, כולל אפיתל ההרחה, ריאות, כליות 38, 39, 40, 41. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם CSF מתקשר עם NSCs והאם cilia העיקרי מעורבים אינם ידועים. NSCs החסיד בתרבות הוא ריסים; למקם רכיבים מסלולים ששש, כגון SMO ו Gpr161 ב ריסים; והם ששישה 42 תגובה. לפיכך, NSCs יכול לשמש כמערכת מודל חשובה ללמוד את המסלול שהשישה, סחר ריסים, ומסלולי בידול עצביים. בנוסף, נוירונים נבדלים NSCs יכולים לשמש גם עבור מבחני סחר ריסים.

Neurospheres הם היוו של צבירי תאי "פנויות" הנובעים מההפצה של neural גזע / ובתאי תאים שגדלים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיות ומשטחי nonadhesive 43, 44. Neurospheres לשמש חשובה דגמים בתרבות במבחנה ללמוד גזע עצביים / ובתאים בפיתוח נורמלי למחלה 31, 45, 46, 47. כאן, אנו מתארים assay מבוסס-neurosphere עבור culturing גזע עצביים / ובתאים ו לבידול לתוך הנוירונים / גליה. אנחנו במיוחד להדגיש את הסחר של איתות רכיבי ריסים של גזע עצבי / ובתאים נוירונים בדיל (איור 1). בניגוד נוירונים culturing העיקרי, neurospheres העיקרי הם יחסית קל תרבות, ניתנים קטעים מרובים להקפיא להפשיר מחזורים, והוא יכול לעבור התמיינות לתוך הנוירונים / גליה. חשוב לציין, קבענו כי עצבי נגזר neurosphereתאי גזע / ובתאים נוירונים בדיל הם ריסים בתרבות LOCALIZE מולקולות איתות רלוונטיות לתפקוד ריסים בתאים אלה. Neurosphere מבוסס שיטות culturing יכולות לשמש כמערכת מודל אידיאלית ללימוד סחר ciliogenesis ואת הריסים ב NSCs נוירונים בדיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניתוק של Neurospheres ממוח העכבר למבוגרים

  1. להרדים עכבר מבוגר (סביב 2 חודשים) ממנת יתר של isoflurane. בדוק היטב כי העכבר הפסיק נשימה לנתח מיד לאחר מותו.
  2. בעזרת מספריים, לעשות חתך קו האמצע כדי לפתוח את הגולגולת. הסר את המוח.
  3. מניחים את המוח קר PBS בצלחת 10 ס"מ על הקרח. בצע את השיטה לנתיחה כל ההר להשיג את SVZ מן החדר לרוחב 48.
  4. מניחים את החדר לרוחב לתוך צינור מ"ל 1.5, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, ו דגירה הצינור במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  5. אחרי 15 דקות, להוסיף 500 μL של המדיום לעצור בעדינות pipet 20 - 30 פעמים עם טיפ מ"ל 1. הימנע ויוצרים בועות אוויר במהלך בפיפטה.
    הערה: שלב זה הוא קריטי להישרדות התא.
  6. לסובב את התאים ב 500 XG במשך 8 דקות. בטל supernatant, להוסיף 1 מ"ל של PBS, ו גלולה tהוא התאים על ידי pipetting 5x בעדינות עם קצה מ"ל 1.
  7. ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הבסיס.
  8. (אופציונלי) אם פסולת הסלולר הם נצפו, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
  9. ספירת תאים עם hemocytometer; באופן כללי, על 30,000 - 60,000 תאים / SVZ מתקבלים.
  10. פלייט התאים מן SVZ אחד לתוך צלחת 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום ותרבות המל"ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  11. (אופציונלי) כדי למנוע היתוך בין תחומי 49, לשים 1000 תאים הבאר אחד של צלחת אולטרה-נמוכה מחייב 6-היטב, כי הוא מלא מראש עם 1.5 מ"ל של מדיום ותרבות המל"ל על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
    הערה: לאחר 5-7 ימים, neurospheres ניתן לראות (איור 2A). תקופת culturing עשויה להיות שונה עם הגיל של עכבר או הרקע הגנטי.
  12. להוסיף 2 מ"ל של מדיום NSC כל 3-4 ימים כדי לשמור על התרבות(לא להסיר את המדיום הקיים).

ניתוח 2. לחוק הכשרות דיפרנציאציה של בדיקות Neurospheres ו Ciliogenesis

  1. כדי לנתח את יכולת הבידול, לנתח את neurospheres בתנאים חסידים במדיום בידול.
  2. לעקר 12 מ"מ עגול coverslips ידי מעוקר או עם חשיפה UV לפני השימוש. לקבלת תרבית תאים חסידה, לשים מכסת זכוכית עגולה מעוקרת 12 מ"מ לתוך באר של צלחת 24-היטב בתנאים מזוהמים.
  3. מעיל זכוכית המכסה עבור 10 s עם 500 μL של 0.002% פולי- L- ליזין (PLL). לשאוב את הפתרון ולייבש אותו במשך 10-15 דקות.
  4. הוספת 500 μL של פתרון laminin (5 מיקרוגרם / μL). דגירת זכוכית הכיסוי עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לשאוב את laminin ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול או בינוני NSC (שליטה מובחנת).
  6. עבור assay בידול, להרים 100 - כדור מיקרומטר 200 עם טיפ 200 μL תחת מיקרוסקופ. לְהוֹסִיף5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 7-10 ימים במדיום בידול.
  7. כדי לנתח neurospheres מובחן, להוסיף 5-10 neurospheres היטב בכל צלחת 24-היטב בתרבות במשך 1-2 ימים במדיום המל"ל. Neurospheres Attached להתפשט ולגדול כמו בשכבה (2B איור).
  8. לאחר הסרת בינוני בקפידה, לתקן את התאים עם 4 paraformaldehyde% (PFA) ב PBS עבור 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים עבור 5 דקות ב RT. הצלחת ניתן לאחסן 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.
    הערה: כדי להמחיש תאי גזע / ובתאים עצביים במדיום NSC ותאי בדיל במדיום בידול, לבצע immunostaining נגד Nestin (גזע עצבי / ובתאי סמן תא), β טובולין III (monoclonal Tuj1, סמן עצבי), GFAP (חלבון גליה fibrillary חומצי astrocyte, סמן), ולאחר O4 (סמן oligodendrocyte) (איור 2B-E). כדי לנתח את הריסים, לבצע immunostaining נגד Arl13b (CI העיקריליה סמן) ו Gpr161 (GPCR ריסי) (איור 3).
  9. הר מכסה זכוכית עם פתרון הרכבה על גבי זכוכית שקופית. הטה את הכוס השקופית להסיר פתרון עודף.

3. ניתוח של Ciliogenesis ב Neurospheres

  1. כדי לנתח תאים neurospheres שלמים ידי immunostaining, העברת 1 מ"ל של מדיום culturing המכיל neurospheres מרובים כדי צינור 1.5 מ"ל ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות. תקן את התחומים עם 4% (PFA) לאחר ההסרה הבינונית עבור 15 דקות ולשטוף עם PBS. ספין למטה תחומי XG ב 500 במשך 8 דקות, להסיר supernatant, דגירה בתחומי O / N עם סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. בטל supernatant באמצעות קצה מ"ל 1 ולהוסיף 500 μL של פתרון אוקטובר באמצעות קצה מ"ל קיצוץ 1. חותך את קצה הקצה כדי להרחיב את הפתח, כמו אוקטובר הוא צמיג.
  3. מעבירים את הפתרון אוקטובר המכיל את neurospheres לתוך תבנית הקפאה פלסטיק חד פעמיות (10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ).
  4. להקפיא את מ 'הישן על קרח יבש דקות 15 לפחות.
  5. (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את התבנית במקפיא C -80 ° עד 1 שנה.
  6. חותכים את החלקים עם cryostat; עובי סעיפים צריך להיות 15-30 מיקרומטר.
  7. כדי להמחיש את הריסים העיקריים בתוך neurosphere, לבצע immunostaining נגד Arl13b (איור 4).

תרבות Passage 4. Neurospheres ו NSCs חסיד

  1. המסדרון, neurospheres בעוד בגודל כדור הוא בין 100-200 מיקרומטר; כאשר neurospheres גדול מדי (300 מיקרומטר ומעלה), הם לא אידיאליים עבור ניסויים.
  2. העברת neurospheres לתוך צינור 50 מ"ל באמצעות קצה מ"ל 1 ומסובב ב XG 500 עבור 8 דקות.
  3. בטל supernatant באמצעות aspirator, להוסיף 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כמות טריפסין משתנה בהתאם למספר תחומים.
  4. הוספת 500 μL של המדיום בסרום בעדינות צינורt 20 פעמים עם טיפ מ"ל 1.
  5. ספין למטה XG ב 500 במשך 8 דקות. בטל supernatant באמצעות טיפ 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הבסיס.
  6. (אופציונלי) אם neurospheres פסולת או undissociated הסלולר נראים, עוברים התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
  7. מעבר התאים בצלחת 10 ס"מ בצפיפות של 10,000 תאים / ס"מ 2 במדיום המל"ל; התא יהיה מוכן לקטע הבא אחרי שבוע.
  8. (אופציונלי) כדי להקפיא את התאים, להוסיף מקפיא בינוני לייצר 500,000 עד 1,000,000 תאים / מ"ל ​​ההשעיה. להקפיא את התאים באמצעות מכולות מקפיאות-קריו; neurospheres undissociated אפשר להקפיא גם.
  9. עבור התרבות החסידה, dillute לתאי 50,000 תאים / סנטימטר 2 על PLL- ו Laminin מצופה coverslips עם מדיום NSC, ותרבות במשך 1-2 ימים.

5. רעב וניתוח של צילה

  1. כן בינוני רעב (לוח 1).
  2. 1-2 ימים לאחר pl הראשוניתating של תאים חסידים לאחר ניתוק, שינוי המדיום המל"ל גם אחד (שליטה) ובינוני לרעב אחר היטב (ניסוי).
  3. תרבות התאים החסידים עבור 24 h.
  4. תקן את התאים עם 4% PFA ב PBS עבור 15 דקות ב RT ולשטוף פעמיים עם PBS עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
  5. (אופציונלי) הפסק את הניסוי ולאחסן את צלחות 24-היטב עם coverslips PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 חודשים.
  6. בצע פרוטוקול immunofluorescence מכתים 7, 50.
  7. הר coverslips באמצעות פתרון גובר. יבש את O זכוכית שקופית / N ב RT בחושך.
  8. לרכוש תמונות על מיקרוסקופ מתחם בהגדלה ההכרחית. שימוש במיקרוסקופ, מצלמה, ויעדים (40X / 1.3 נפט 63X / 1.4 נפט), הנשלט באמצעות התוכנה המלווה. קח z-סעיפים מספיק על 0.5-0.8 מיקרומטר במרווחים (איור 5).
  9. לניתוח כמותי של לוקליזציה ריסים בתאים חסידים, לרכוש ערימות של תמונות מתוך 3-8 שדות רצופים עם תאים ומחוברים ע"י הסתכלות לתוך ערוץ DAPI. לכמת את מספר הריסים העיקריים באמצעות ImageJ / פיג'י. בדרך כלל, להשתמש בכלי "מונה Cell" של תוספי ImageJ> לנתח בתיבת הדו-שיח כדי לספור את התאים עם ריסי GPCR חיוביים; תחזיות מקסימליים מארובות של תמונות ניתן גם לייצא מ עוצמת תמונה ופרמטרי ניגוד דומה ImageJ / Fiji.Use עבור כל תמונות מאותו הניסוי לספירה ועניין יצוא.

6. Transfection של Neurospheres

  1. צמד תאים ניתק כדי coverslips עבור 24 h. השתמש צפיפות תאים בדרך כלל בין 75,000 ו 150,000 תאים 500 μL של המל"ל בינוני באר אחד של צלחת 24-היטב.
  2. מערבבים 25 μL של המדיום סרום מופחת 1.5 μL של מגיב transfection בתוך microtube 0.5 מ"ל על ידי vortexing עבור 5 ים.
  3. להוסיף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א רעלן פנימי חופשית microtub 0.5 מ"ל נפרדדואר המכיל 25 μL של תקשורת סרום המופחתת ומערבבים ידי vortexing עבור 5 ימים.
  4. להוסיף 1 μL של מגיב transfection ל- DNA המכיל שני microtube ומערבב ידי vortexing עבור 5 ימים.
  5. מוסיפים את תערובת מהצינור המכילים DNA אל microtube הראשון ומערבבים ידי pipetting.
  6. דגירה את התערובת במשך 10-15 דקות ב RT. לאחר הדגירה, בעדינות ומוסיפים את תערובת transfection dropwise אל בארות על גבי מדיום NSC (500 μL / טוב).
  7. שינוי המדיום 24 h-transfection פוסט לשלוט (מדיום NSC) בינוני או בינוני רעב (500 μL / טוב).
  8. תקן את התאים על ידי שינוי בינוני עד 4% PFA לאחר 24 h ולבצע immunostaining; בדרך כלל, עד יעילות transfection 10% מתקבל באמצעות פרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר ציפוי התאים מן SVZ במדיום המל"ל במשך שבוע, neurospheres צף נצפו (איור 2 א). הגדלים של התחום נעים בין 50 לבין 200 מיקרומטר. כדי לבחון אם הספירות היו שמקורם בתאי גזע / ובתאים עצביים, את neurospheres היה מצופה על PLL- ו Laminin מצופה coverslips במדיום NSC עבור 2 ימים. לאחר מכן הם היו immunostained נגד סמן תא גזע / ובתאים העצביים, Nestin. יומיים נדרשו כדי לאפשר את הכדורים אל לצרף את coverslips לגדול כמו בשכבה של תאים. בשכבה של תאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה להפקה ולשמור תרבויות neurosphere מן SVZ עכבר המבוגר. כמה נקודות רלוונטיות לגבי התרבויות הן כדלקמן. ראשית, בגדלים של הספירות הם בדרך כלל בין 50 ל - 200 מיקרומטר. מניסיוננו, כאשר neurosphere מקבל גדול יותר 300 מיקרומטר קוטר, הזמן האופטימלי עבור passaging הוחמץ. תחומים גדולים אלה מכילים תאים מתים בתוך הליבה. שנית, כפי neurospheres משמשת ללמוד בתאי גזע / ובתאים עצביים, חשוב להשתמש EGF ו FGF-בסיסי (bFGF) כדי לשמור על stemness של תאים אלה. לכן, הגורמים להשרות התמיינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדה של ס.מ. ממומנת על ידי מענקי גיוס מ-CPRIT (R1220) ו-NIH (1R01GM113023-01).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זכוכית כיסוי עגול 12 מ"מפישרברנד12-545-80 
צלחת 24 בארותפלקון353047
4% פרפורמלדהיד (PFA)Affymetrix19943
צינור 50 מ"לפלקון352098
95 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי, מכסה ניתן להחלקהפישרברנדFB0875714Gצלחת 10 ס"מ
70 ומיקרו; מסננת תאים MFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 נוגדן משני
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 תוסף תזונה (50X),
תרמו מדעיST 40R
בקבוקון קריוגניקורנינג430488
DAPISigmaD9542-10MG
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקרסיגמאD5025-15KUDnase I
דימתיל סולפוקסידסיגמאD8418-100MLDMSO
תבניות דגימת ויניל חד פעמיותSakura Tissue-Tek Cryomold456510 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ
תמיסת מלח 10X עם חוצץ פוספט של Dulbecco, שונה, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאיםSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11254-20
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaF9026-500ML
תמיסתFluoromount-GSouthern Biotech0100-01פתרון הרכבה
GFAPDAKOZ0334
עז נגד עכבר IgG1 נוגדן משני, Alexa Fluor 555 מצומדThermoFisher ScientificA-21127עז נגד עכבר IgG1, Alexa 555 נוגדן
משני עז נגד עכבר IgG2a נוגדן משני, Alexa Fluor 555 מצומדThermoFisher ScientificA-21137עז נגד עכבר IgG2a, Alexa 555 נוגדן משני
Gpr161תוצרת ביתN/A
אנושי bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 מ"מ נויבאואר משופר עמוק 0.100 מ"מ
איזותזיההנרי שייןNDC 11695-0500-2איזופלואורן
למינין מקרום הבסיס של אנגלברת-הולם-נחיל סרקומהסיגמאL2020למינין
L-גלוטמין (200 מ"מ)סיגמאG7513
ליפופקטמין 3000 מגיב טרנספקציהThermoFisher ScientificL3000
מר פרוסטינלג'ן 5100-0036
תוסף N-2 (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
מדיום נוירובזאליGibco21103-049
סרום חמור רגילג'קסון ImmunoResearch017-000-121
תרכובת OCTSakura Tissue-Tek4583OCT
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמאP4333-100ML
פולי-L-ליזין (PLL)SigmaP4707
חלבון EGF אנושי רקומביננטי,מערכות CF R ו-D236-EG-200
EGF מספרייםכלים מדעיים עדינים14060-10
שקופית סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופפישר מדעי12-550-15שקופיות
טריטון X-100ביו-ראד161-0407
תמיסת טריפסין-EDTA (10X)SigmaT4174-100טריפסין
COSTAR, עם מכסה תחתון שטוח משטח חיבור נמוך במיוחד פוליסטירן,קורנינג3471צלחת 6 בארות מחייבת נמוכה במיוחד
ובטא;-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1
צנטריפוגה B27 17504001 ThermoFisher Scientific ללא סרום צלחת 6 בארות סטרילי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857(2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902(2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422(2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576(2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669(2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ARL13BGPR161

מאמרים קשורים